Поиск Кабинет

Подавление кальцификации трансплантатов клапанов сердца путем их девитализации

Гены & Клетки: Том V, №1, 2010 год, стр.: 41-43

 

Авторы

Акатов В.С., Фесенко Н.И., Соловьев В.В., Фадеева И.Е., Чеканов А.В., Муратов Р.М., Бритиков Д.В., Сачков А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Подавление кальциноза и дегенерации трансплантатов клапанов сердца остается важной задачей сердечно-сосудистой хирургии и тканевой инженерии, решение которой необходимо для увеличения сроков функционирования биопротезов. Ранее нами было показано, что предложенные в литературе способы децеллюриларизации трансплантатов путем ферментативной обработки, осмотическим шоком либо с помощью детергента додецилсулфата натрия не предотвращали кальциноз стенок аорты. В настоящей работе, используя модель подкожной имплантации тканей крысам линии Wistar, мы показали возможность полного подавления кальцификации ксенографтов клапанов сердца путем их инкубации до имплантации в растворе с дигитонином и ЭДТА, вызывающей гибель клеток донора без разрушения хроматина. Способ антикальцинозной девитализации основан на предложенном нами ранее механизме инициации кальциноза в трансплантатах клапанов сердца.

Аллотрансплантаты (аллографты) клапанов сердца рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных материалов для сердечно-сосудистой хирургии врожденных и приобретенных пороков сердца. В отличие от механических клапанов, аллотрансплантаты позволяют избежать антикоагулянтной терапии, которая вызывает поражение печени, и потенциально способны к ремоделированию в организме реципиента. Способность к ремоделированию особенно важна у детей и пациентов молодого возраста, когда необходимо обеспечить не только поддержание и обновление структуры трансплантата, но и его рост. Однако сроки функционирования трансплантатов ограничены, что в значительной степени определяется их кальцификацией и дегенерацией, которые приводят к необходимости повторных операций у молодых пациентов и к высокой смертности пациентов в раннем детском возрасте. В последние 15 лет для предотвращения кальцификации и дегенерации трансплантатов предлагаются различные методы децеллюляризации (разрушения клеток донора) до имплантации[1—13]. Предполагается, что клетки донора после трансплантации ткани вызывают иммунную реакцию, погибают, и в результате этого инициируются процессы кальцификации и дегенерации ткани. Исходя из этого положения, были предложены различные способы обработки трансплантатов, которые вызывают гибель и разрушение клеток донора на основе использования ферментов[1, 2, 7], гипотонического шока[3—6, 8] и детергентов[12—13], Ранее нами были выполнены исследования на модели подкожной имплантации крысам, которые показали, что предложенные в литературе способы децеллюляризации не подавляли кальцификацию тканей трансплантатов клапанов сердца[14]. Эти результаты указывают, что децеллюляризация не является достаточным условием подавления кальциноза тканей трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Нами была предложена и экспериментально проверена гипотеза, согласно которой инициация кальциноза связана с накоплением кальция в митохондриях погибающих клеток донора[15]. На основе этой гипотезы мы предложили способ предимплантационной анти-калыдинозной обработки трансплантатов клапанов сердца и сосудов[16]. В настоящей работе представлены данные о подавлении кальцификации трансплантатов клапанов сердца после такой обработки, полученные на основе использования модели подкожной имплантации крысам.

Материал и методы

Ткани. Аортальные клапаны сердца свиньи извлекали не позднее чем через 1 ч после забоя животных и помещали в питательную среду ДМЕМ (Sigma, США) с добавлением гентамицина (400 мкг/мл) и флуконазола (20 мкг/мл). После доставки в лабораторию (не позднее чем через 4 ч после забоя и извлечения) ткани препарировали и разрезали на фрагменты размером 5x5 мм. После этого часть фрагментов подвергали децеллюляри-зации и девитализации, а часть фрагментов сохраняли до имплантации в среде ДМЕМ (pH 7,2) с указанными антибиотиками при 4°С.

Девитализация и децеллюляризация. Часть материала стенок аорты и створок клапанов подвергали ферментативной обработке[7]. Для этого фрагменты ткани инкубировали в течение 24 ч в растворе, содержащем 0,25% трипсина и 0,02% этилендиаминтетраук-сусной кислоты (ЭДТА) в фосфатно-солевом буфере без ионов кальция и магния. Затем образцы помещали в раствор с РНК-азой (0,02 мг/мл) и ДНК-азой (0,2 мг/ мл) на 2 ч, и снова инкубировали в течение 24 ч в указанном выше растворе с трипсином и ЭДТА при 37°С[15]. Другую часть фрагментов обрабатывали методикой гипотонического шока с нуклеазами[3]. Для этого образцы сначала помещали в стерильную деионизованную воду на 24 ч. После начального этапа лизиса клеток ткани обрабатывали 24 ч в физиологическом растворе (pH 7,2), содержащем ДНК-азу (0,2%) и РНК-азу (0,02%). Согласно авторам метода[7], такая обработка позволяет элиминировать до 95% гистологически видимых клеток. Кроме того, для обеспечения апоп-тозной гибели клеток фрагменты ткани также инкубировали 48 ч в среде ДМЕМ с ЮмМ ЗДТА, либо с 2М сорбитола (Sigma, США). Для обеспечения некротической гибели клетки инкубировали 48 ч в среде ДМЕМ с 0,02% дигитонина (Sigma, США), который, связываясь с холестерином, образует при такой концентрации поры в плазматической мембране. В качестве антикальци-нозной девитализации применяли предложенную нами обработку, включающую инкубацию в 0,9% растворе хлорида натрия, с 10 мМ HEPES (pH 6,0), содержащем дигитонин (0,02%) и ЗДТА (ЮмМ) при 20°С в течение двух суток при непрерывном перемешивании раствора на шейкере. После всех обработок ткани тщательно отмывали в фосфатном солевом буфере pH 7,2 в течение 24 ч с трехкратной сменой раствора для удаления агентов, повреждающих клетки. Отсутствие токсичности обработанных тканей было выявлено при посеве на них гладкомышечных клеток и выражалось в жизнеспособности, прикреплении к матриксу и пролиферации высеянных клеток.

Оценка жизнеспособности клеток в ткани. Экспресс-анализ соотношения числа живых и погибших клеток в тканях проводили методом прижизненной флуоресцентной микроскопии тотальных препаратов с использованием окраски ткани ядерными красителями этидиум бромидом и Bisbenzimide Hoechst 33342, описанным ранее [17]. Фрагмент ткани помещали в среду ДМЕМ, добавляли 5^10 мкг/мл этидиум бромида (окрашивает ядра только в погибших клетках, оранжевая люминесценция) и 5 мкг/мл Bisbenzimide Hoechst 33342 (окрашивает ядра живых и погибших клеток, сине-зеленая люминесценция), инкубировали 10 мин при 37°С и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. При одновременном окрашивании этими красителями ядра живых клеток флуоресцировали сине-зеленым цветом за счет проникновения в них и связывания с ДНК красителя Hoechst 33342, а ядра погибших клеток флуоресцировали оранжевым цветом за счет связывания ДНК с этидиум бромидом и Hoechst 33342. Метод позволяет оценить наличие и жизнеспособность эндотелиальных клеток (овальная форма ядер) на поверхности ткани, гладкомышечных клеток и фибробластов (удлиненная форма ядер) внутри ткани на глубине до 50 мкм, а также пролиферацию и тип гибели клеток.

Гистологический анализ. Для оценки состояния матрикса и наличия клеток в ткани наряду с гистологическими методами использовали флуоресцентную микроскопию. Фрагменты ткани аорты фиксировали в 10% нейтральном формалине 16 ч, отмывали от фиксатора 8 ч, помещали в заливочную среду GSV-1, инкубировали 12 ч и делали криосрезы толщиной 10 мкм при ^21°С. Для световой микроскопии криосрезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для флуоресцентной микроскопии криосрезы окрашивали ядерным красителем этидиум бромидом. Ядра клеток флуоресцировали оранжевым цветом на фоне собственной зеленой флуоресценции волокон тканевого матрикса, фиксированных формалином. Микроскопический анализ выполняли на конфокальном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5C (Германия).

Модель изучения кальцификации трансплантатов. Для изучения кальцификации трансплантатов in vivo применяли используемый для этого многими исследователями метод подкожной имплантации ткани крысам[14, 18—19]. Фрагменты стенок аорты и створок кла-x

ленные из титановой сетки с размерами пор 50 мкм, и имплантировали крысам линии Wistar подкожно в область спины под тиопенталовым наркозом (3 мг/100 г веса). Опытные и контрольные группы животных состояли из молодых самцов весом 180+10 г, которые содержались в стандартных условиях вивария в течение

1 мес. после имплантации. В рацион питания крыс включали витамин ДЗ.

Цель исследования и экспериментальный протокол работы с животными были одобрены этическим комитетом Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Определение минерализованного кальция. Минерализованный кальций во фрагментах ткани определяли методом атомной абсорбционной спектроскопии. Фрагменты ткани после эксплантации отмывали в течение 4 ч в дистиллированной воде, высушивали в течение

2 ч при 100°С, измеряли сухой вес образцов, растворяли минерализованный кальций в 0,1 Н HCI и затем проводили измерение количества минерализованного кальция в них, используя прибор AAS-51 ОО/Zeeman фирмы Perkin-Elmer (Германия). Количество минерализованного кальция оценивали как среднее по образцам, импланная ошибка. Достоверность отличия средних значений для разных групп оценивали по критерию Стьюдента (Р<0.05).

Результаты

Исследование жизнеспособности клеток стенок аорты и створок клапанов после антикальцинозной обработки. Флуоресцентный микроскопический анализ показал, что до обработки значительная часть клеток, включая эндотелиальные клетки интимы (овальная форма ядер) и миофибробласты медии вблизи поверхности (продолговатая форма ядер) в створках аортальных клапанов и в стенках аорты свиньи были живыми (рис. 1 А, Б). После антикальцинозной девитализации все клетки были погибшими (рис. 1В). Форма ядер после обработки оставалась неизменный, что указывает на некротический характер клеточной гибели. В то же время, обработка ЭДТА в аналогичной концентрации (10 мМ) в среде ДМЕМ в течение 2 сут. вызывала апоптотическую гибель клеток, о чем свидетельствовало аберрантное распределение хроматина (рис. 1 Г). Применение одного ЭДТА в солевом растворе не обеспечивало клеточной гибели до тех пор, пока клетки не переносили из этого раствора в среду ДМЕМ, после чего в течение 2^4 ч выявлялась апоптотическая гибель клеток (рис. 2). Следовательно, в условиях энергетического ограничения метаболизма клеток в солевом растворе с ЭДТА происходила иницация их апоптотической гибели, но реализация апоптоза откладывалась до восстановления энергетического метаболизма в питательной среде ДМЕМ. Дигитонин, как и следовало ожидать, в концентрации 0,02% вызывал некротическую гибель как в среде ДМЕМ, так и в используемом для антикальцинозной обработки солевом растворе, подобно тому, что наблюдали после антикальцинозной девитализации (см. рис. 1 В)

Гистологическое исследование стенок аорты и створок аортальных клапанов после антикальцинозной девитализации. Согласно гистологическому анализу с использованием гематоксилина и эозина, а также согласно флуоресцентному анализу криосрезов, после антикальцинозной девитализации с применением сочетания 0,02% дигитонина и 10 мМ ЭДТА морфология ядер оставалась неизменной как в интиме, так в медии и адвен-тиции (рис. 3). Изменений слоистой структуры матрикса аорты не выявлялось. Полученные результаты указывают на отсутствие повреждения структуры тканевого матрикса и сохранение целостности ядер погибших клеток после антикальцинозной девитализации.

Подавление кальцификации стенки аорты после деви-тализации. После 30 сут. имплантации под кожу крысам внешний вид эксплантированных девитализированных фрагментов стенок аорты свиньи оставался неизменным. Флуоресцентный микроскопический анализ криосрезов свидетельствовал о тотальном лизисе ядер, и при этом полностью сохранялась слоистая структура тканевого матрикса (рис. 4). После высушивания в контрольных фрагментах стенок аорты свиньи были видны отложения кальция белого цвета. Количественный анализ минерализованного кальция показал полное подавление кальциноза в стенках аорты, которые до имплантации подвергались антикальцинозной обработке (рис. 5). Антикальцинозная обработка подавляла также минерализацию в мышечной ткани клапанно-аортальных комплексов, использующейся для закрепления аллотрансплантатов клапанов сердца в организме реципиента (рис. 5). Нативные створки клапанов сердца не кальцифицировались, и антикальцинозная девитализация не инициировала их минерализацию. Содержание минерализованного кальция в створках составило 0,3+0,3 и 0,5+0,3 мг/г. сухого веса ткани до обработки и послеткани после имплантации нативных и девитализированных фрагментов створок соответственно. Для сравнения следует привести данные о минерализации фрагментов стенок аорты свиньи, обработанных дигитонином или ЗДТА в солевом растворе или в питательной среде ДМЕМ. Девитализация фрагментов стенок аорты раствором ЗДТА в среде ДМЕМ вызывала апоптоз, но не уменьшала кальцификацию ткани, так же как и девитализация дигитонином в данной среде, которая вызывала некротическую гибель клеток (рис. 6). Девитализация стенок аорты солевым раствором с ЗДТА или дигитонином вызывала уменьшение минерализации ткани (рис. 6). Это подавление кальцификации усиливалось по мере снижения pH раствора, но оставалось неполным. Другие способы девитализации, вызывающие согласно флуоресцентному микроскопическому анализу апоптотичес-кую гибель клеток, включая обработку 2М раствором сорбитола, 4-часовую инкубацию при 44°С в среде ДМЕМ и 2-суточную инкубацию с кальциевым ионофо-ром А23187 не вызывали уменьшение минерализации стенок аорты в сравнении с нативной тканью (рис. 7).

Таким образом, из всех изученных способов девитализации только обработка стенок аорты сочетанием 0,02% дигитонина и 10 мМ ЭДТА в солевом растворе с ЮмМ HEPES, pH 6,0, вызывала полное подавление кальцификации имплантируемых структур.

Обсуждение

Разрабатывая методы децеллюляризации, авторы зачастую полагают, что разрушение клеток донора будет способствовать подавлению минерализации трансплантатов. Оценить подавление кальцификации после имплантации децеллюляризированных трансплантатов крупным лабораторным животным достаточно сложно и требует больших сроков наблюдения. Тем не менее, такие попытки предпринимаются, и, в частности, было показано отсутствие кальцификации створок ксенотран-сплантатов клапанов сердца, децеллюляризированных посредством гипотонического шока[3]. К сожалению, это не позволяет оценить антикальцинозное действие децеллюляризации, поскольку при имплантации нативных трансплантатов клапанов сердца кальцинируется только стенка сосуда трансплантата, а в створках минерализация, как правило, не инициируется, но может быть следствием роста кристаллов минерализованного кальция из стенки в створку. Ранее нами было показано, что при подкожной имплантации крысам кальцифицируются стенки, но не створки[14]. Этот факт позволяет рассматривать модель подкожной имплантации крысам адекватной для изучения способности к кальцификации тканей трансплантатов клапанов сердца. На данной модели нами было показано, что предложенные в литературе способы децеллюляризации, такие как ферментативная обработка с применением трипсина, гипотонический шок, обработка детергентом додецилсульфатом натрия не уменьшали кальцификацию имплантированных стенок аорты[14]. Из этого следовало, что не все децел-люляризирующие методики будут подавлять кальцификацию.

Это подтверждается представленными в данной работе результатами, согласно которым девитализация стенок аорты рядом способов, вызывающих полную гибель клеток по апоптическому или некротическому пути, не подавляла их кальцификацию. Поэтому нами было предложена и экспериментально обоснована гипотеза о механизме инициации кальциноза в тканях трансплантатов клапанов сердца. Согласно этой гипотезе во время гибели клеток донора до забора ткани или после имплантации происходит накопление кальция и фосфатов в митохондриях, в результате чего в них формируются сначала аморфные фосфаты кальция, а затем — первичные кристаллы гидроксиаппатитов, которые играют роль центров минерализации в имплантированных стенках сосудов[15]. Для того, чтобы предотвратить образование центров минерализации, нами был предложен способ антикальцинозной девитализации, который обеспечивает быструю гибель клеток донора без накопления кальция в митохондриях. С этой целью было пред- ложено инициировать быструю некротическую гибель клеток дигитонином, который связывается с холестерином плазматической мембраны и пермеабилизирует ее, что при отсутствии кальция во внеклеточной среде за счет применения больших концентраций ЭДТА исключает возможность накопления кальция в митохондриях. Кроме того, в качестве дополнительного условия предотвращения формирования кристаллов гидрокси-аппатита при сохранении нативности матрикса использовали умеренно кислые значения pH инкубационного раствора. Выполненные исследования показали, что такое сочетание условий позволяет полностью предотвратить кальцификацию стенок аорты, как в наиболее сильно кальцифицирующейся сосудистой ткани, на модели подкожной имплантации крысам. При этом используемые по отдельности ЭДТА и дигитонин даже в условиях кислых значений pH не были столь эффективны в предотвращении кальциноза, хотя и оказывали частичный эффект подавления минерализации. Необходимо отметить также, что прочностные характеристики стенок аорты и створок после их антикальцинозной девитализации не ухудшаются (неопубликованные данные).

Следует подчеркнуть, что для полного подавления кальциноза нам не потребовалось тотального разрушения клеток. Согласно нашим наблюдениям, обеспечение полного разрушения клеток неспецифическим воздействием без повреждения тканевого матрикса стенок сосудов и створок клапанов является достаточно проблематичным. Вопрос о степени ответственности погибших клеток в иммунной реакции на девитализированный трансплантат остается открытым и требует дальнейших исследований. Также остается открытым вопрос о механизме естественного разрушения клеток донора в имплантированных под кожу крысам стенках аорты при сохранении нативной структуры их тканевого матрикса.

Заключение

1. Девитализация и децеллюляризация не являются достаточным условием для предотвращения кальциноза тканей ксенотрансплантатов клапанов сердца.

2. Девитализация с использованием дигитонина и ЭДТА позволяет полностью подавить кальцификацию тканей ксенотрансплантатов клапанов сердца в модели подкожной имплантации крысам.

3. Предложенный способ антикальцинозной девитализации представляет практический интерес для повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов.

Работа поддержана Министерством науки и образования РФ (проекты РНП 2.1.1/5244 и 02.740.11.5009), а также грантом Президента РФ «Ведущие научные школы» 217.2008.4.

Работа также поддержана федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», контракт № 02.740.11.0710.

Подняться вверх сайта