Поиск Кабинет

Первый клинический опыт применения прямой генной терапии VEGF и bFGF при лечении пациентов с критической ишемией нижних конечностей

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 180-184

 

Авторы

Плотников М.В., Ризванов А.А., Масгутов Р.Ф, Мавликеев М.О., Салафутдинов И.И., Газизов И.М., Романова Ю.Д., Шамсутдинова И.И., Богов А.А., Максимов А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлено клиническое наблюдение успешного лечения дистальной формы заболевания периферических артерий нижних конечностей с явлениями критической ишемии у пациента 60 лет.

Была выполнена инъекция двухкассетной экспрессионной плазмиды c кДНК генов сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов, в мышцы голени и мягкие ткани стопы пораженной конечности. Эффект лечения оценивали при помощи функциональных проб: измерение лодыжечно-плечевого индекса, тредмил-тест, время восстановления исходного плечелодыжечного индекса после нагрузки и временной окклюзии. Выполнялось иммуногистохимическое исследование биоптатов мышцы пораженной конечности.

Заболевания периферических артерий (ЗПА) – частая причина снижения качества жизни и инвалидизации [1]. Общая распространенность ЗПА в популяции по данным различных исследований варьирует в пределах 3–10%, увеличиваясь до 15–20% в возрастной группе старше 70 лет [2–4]. Прогноз сохранения конечности при ЗПА является в целом благоприятным, однако у четверти пациентов наблюдается либо сохранение симптомов, либо их прогрессирование с развитием критической ишемии нижних конечностей (КИНК) [5–7]. При этом лишь половине пациентов с установленным диагнозом КИНК может быть выполнена реваскуляризация конечности, четверть пациентов получают консервативное лечение, остальным выполняется первичная ампутация бедра или голени [8]. В этой связи, высок интерес к разработке непрямых методов реваскуляризации [9]. С 90-х годов прошлого века изучению терапевтического ангиогенеза посвящено большое количество работ [10, 11]. Положительные результаты этих исследований стали толчком к апробации технологий стимуляции ангиогенза в клинической практике. В России разработан геннотерапевтический препарат «Неоваскулген» (Институт Стволовых Клеток Человека), разрешенный для клинического применения. Неоваскулген® является первым в Европе, первым в своем классе и всего лишь одним из четырех в мире генотерапевтических препаратов, разрешенных к клиническому применению. В настоящее время Неоваскулген® рекомендован для применения в комплексной терапии пациентов при ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза [15]. Препарат создан на основе плазмидного вектора, кодирующего ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF). Нами разрабатывается инновационный генотерапевтический препарат, позволяющий повысить эффективность лечения ишемических заболеваний за счет одновременной экспрессии двух высокоактивных пронгиогенных фактора роста – VEGF и основного фактора роста фибробластов (bFGF2).

Целью нашего исследования стало определить эффективность применения двухкассетного экспрессионного плазмидного вектора pBud-VEGF165-FGF2 при лечении пациентов с ЗПА в стадии КИНК [12]. Исследование было одобрено Ученым советом КФУ и Локальным этическим комитетом.

Материал и методы

Больной А. (60 лет) поступил в отделение сосудистой хирургии № 1 в ноябре 2011 г. с жалобами на постоянные, усиливающиеся в ночное время боли в области трофической язвы I пальца левой стопы, зябкость обеих стоп, быструю утомляемость и боли в икроножной мышце левой нижней конечностей при ходьбе через 10–15 м. Ночной отдых облегчался клиностазом конечности и наркотическими анальгетиками.

Из анамнеза: больным себя считает около 5 лет, когда постепенно стал отмечать появление зябкости стоп и повышенной утомляемости в икроножных мышцах при ходьбе. В 2009 г. развился острый атеротромбоз левой подколенной артерии, по поводу чего была произведена тромбэктомия с ревизией дистальных сегментов берцовых артерий. В последующем перемежающаяся хромота до 20–30 м. сохранялась и летом 2010 г. у больного появилась трофическая язва I пальца левой стопы. Больному проводились неоднократные курсы препаратом простагландина Е с кратковременным положительным эффектом. В октябре 2011 г. ввиду присоединения болей в покое выполнена левосторонняя поясничная симпатэктомия, однако значимый клинический эффект не был достигнут.

Местный статус при поступлении: левая голень и стопа бледные, подкожные вены заполнены слабо. Пульсация магистральных артерий не определялась на подколенной артерии и дистальнее. На I пальце левой стопы в области дистальной фаланги по латеральной поверхности – трофический дефект под струпом размером 1,5×2 см. (рис. 1). По данным артериографии, магистральное артериальное русло дистальнее подколенной артерии не контрастировалось (рис. 2).

С учетом ранее перенесенных безуспешных попыток хирургической прямой и непрямой реваскуляризации, отсутствия эффекта от проводимой фармакотерапии и наличия критической ишемии больному было предложено произвести инъекцию двухкассетного экспрессионного плазмидного вектора pBud-VEGF165-FGF2 [12]. Рекомбинантная плазмида создана на базе экспрессионного вектора pBudCE4.1 (Invitrogen, США) и обеспечивает одновременную и независимую экспрессию VEGF и FGF2 за счет наличия двух экспрессионных кассет.

Было получено письменное информированное согласие на проведение исследования. Процедура выполнена с разрешения этического комитета в рамках темы Государственного автономного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая больница Министерства здравоохранения Республики Татарстан» «Разработка новых методов прямой генной терапии у пациентов с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей и диабетической стопой». Препарат плазмиды получен хроматографическим методом с применением колонок «PlasmidSelect Xtra Starter Kit» (GE Healthcare Life Sciences, США), обеспечивающим получение ДНК, удовлетворяющей стандартам cGMP.

В условиях операционной под спинномозговой анестезией через кожный разрез на уровне середины голени произведена биопсия икроножной мышцы. После ушивания раны выполнена инъекция переднелатеральной и задней группы мышц голени равными дозами в равноудаленных точках препаратом двухкассетного экспрессионного плазмидного вектора pBud-VEGF165-FGF2. Также была выполнена инъекция мягких тканей стопы: межплюсневых мышц, подошвенной клетчатки, параульцилярной клетчатки 1 пальца стопы. Общее количество введенной плазмидной ДНК составило 1 мг.

Объективизация результатов проводилась при помощи измерения лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ), стандартного тредмил-теста, определения времени восстановления исходного ЛПИ после нагрузочной ходьбы и окклюзионной пробы.

Для гистологического анализа забирались биоптаты мышц, подвергнутых терапевтическому воздействию. Биоптаты заливали по стандартной методике в парафин, получали срезы толщиной 4–6 мкм. Выполняли имуногистохимическое исследование с помощью коммерческих моноклональных антител к CD34 для визуализации капилляров (клон QBEnd/10, Novocastra, Великобритания, разведение 1:75). Реакция с антителами к СD34 позволяет наиболее полно визуализировать капиллярную сеть [13], так как CD34 – маркер прогениторных клеток, в том числе клеток-предшественниц эндотелия [14], и, следовательно, позволяет выявить капилляры на более ранней стадии развития.

Результаты

Осложнений местного и системного характера не наблюдалось. На вторые сутки пациент отметил улучшение, выражающееся в потеплении конечности и уменьшении болевого синдрома. На пятые сутки пациент констатировал исчезновение болей в покое, отказ от наркотических анальгетиков и нормализацию ночного сна, а также некоторое увеличение дистанции безболевой ходьбы в привычном для себя темпе. На седьмые сутки пациент был выписан. Отдаленные результаты исследованы на сроке 3 и 6 мес.

1. ЛПИ: до введения препарата и на сроке 3 мес. – кровоток в артериях около лодыжечной области лоцировать не удалось (0), через 6 мес. – выявлен кровоток в задне-большеберцовой артерии, ЛПИ составил 0,48;

2. дистанция безболевой ходьбы по результатам стандартного тредмил-теста: до введения – 24 м, через 3 мес. – 177 м, через 6 мес. – более 200 м (рис. 3);

3. время восстановления исходного ЛПИ после дозированной нагрузки (измерение осциллографческим методом): до введения – 11 мин 42 с, через 3 мес. – 8 мин 31 с, через 6 мес. – 8 мин 3 с (рис. 4);

4. время восстановления исходного ЛПИ после трехминутной окклюзии (измерение осциллографическим методом): до введения – 5 мин 36 с, через 3 мес. – 2 мин 23 с, через 6 мес. – 1 мин 52 с (рис. 5).

По результатам иммуногистохимического исследования биоптатов мышц с антителами к CD34 выявлено увеличение плотности капиллярной сети (рис. 6).

При объективном осмотре на сроке 3 мес. отмечалось значительное уменьшение трофического дефекта I пальца левой стопы и полное заживление на сроке 6 мес. (см. рис. 1).

На сроке 6 мес. пациент отмечал отсутствие ограничения дистанции при ходьбе в привычном для себя темпе.

Выводы

Представленное клиническое наблюдение показывает возможность применения терапевтических методов ангиогенеза с использованием прямой генной терапии двухкассетной экспрессионной плазмидой при IV степени хронической ишемии нижних конечностей.

Подняться вверх сайта