Поиск Кабинет

Перспективы повышения эффективности генной и клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний: генетически модифицированные клетки

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 19-28

 

Авторы

Шевченко Е.К., Талицкий КА, Парфенова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

С развитием генной и клеточной терапии связывают надежды на повышение эффективности лечения сердечно-сосудистых заболеваний, прежде всего неоперабельных случаев ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, сердечной недостаточности, критической ишемии нижних конечностей. Экспериментальные исследования убедительно продемонстрировали возможность стимуляции ангиогенеза, регенераторных процессов в сердце и ишемизированных конечностях животных с помощью генной и клеточной терапии. Однако результаты клинического применения этих методов довольно скромные. Одним их подходов к повышению эффективности генной и клеточной терапии может быть генетическая модификация стволовых и прогениторных клеток — своеобразный альянс клеточной и генной терапии, позволяющий нейтрализовать недостатки и усилить преимущества обеих методик. В данном обзоре анализируются основные экспериментальные работы по использованию генетически модифицированных клеток для стимуляции ангиогенеза и регенеративных процессов в миокарде, создания биологических пейсмейкеров, повышения выживаемости, хоуминга и интеграции клеток при трансплантации в поврежденную ткань, возможные области и перспективы их использования для лечения больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Современная медицина, несмотря на значительный прогресс за последние 100 лет, имеет в своем арсенале сравнительно мало средств для стимуляции процессов регенерации (относительно слабых у высших позвоночных), и при выраженной недостаточности функции жизненно важных органов, обусловленной распространенными структурными изменениями, трансплантация(а именно — аллотрансплантация), если она технически возможна, оказывается единственным методом, позволяющим добиться восстановления или улучшения функции органа. Однако реальная потребность в донорах, как правило, превышает число последних, и, кроме того, остается до конца не решенной проблема подавления трансплантационного иммунитета. В связи с этим, огромное клиническое значение имеет внедрение в широкую практику технологий клеточной и тканевой аутотрансплантации. Аутогенная трансплантация имеет огромное значения для пластической и восстановительной хирургии и применяется в случаях восстановления тканей после удаления злокачественных новообразований, замещения костных и хрящевых дефектов, а также при восстановлении кожного покрова после ожоговых повреждений. Зкспери ментальными исследованиями показан значительный потенциал клеточной трансплантации для восстановления повреждений в тканях сердца и цен, вызванных инфарктами, инсультами и дегенеративными заболеваниями, для восстановления функций печени и гема-поэза, а также для стимуляции неоваскуляризации при лечение ишемических болезней нижних конечностей и сердца. Одно из новых направлений в клеточной трансплантологии — использование генетически модифицированных стволовых и прогениторных клеток — своеобразный альянс клеточной и генной терапии. Суть метода заключается в том, что аутогенные клетки, полученные из организма больного, трансформируются in vitro генетическими конструкциями, несущими терапевтические гены, например, гены факторов роста (ФР) (трансфекция/трансдукция ex vivo), и затем ретрансплантируются больному. Этот подход позволяет объединить достоинства обеих методик и хотя бы частично нейтрализовать их недостатки. С одной стороны, с помощью внедрения «терапевтического» гена клеткам можно придать новые характеристики или усилить их терапевтические свойства, например, секрецию антиапоптотических и ангиогенных ФР. С другой стороны, удается избежать ограничений генной терапии — низкой эффективности трансфекции in vivo, которая при использовании наиболее безопасного плаз-мидного вектора не превышает 1% клеток ткани, а также иммунных реакций на вирусные белки в случае использования аденовирусных векторов. Клетки можно трансфецировать (трансдуцировать) in vitro, нарастить нужное количество для последующего введения в организм, измерить количество секретируемого терапевтического белка — продукта трансгена. Это дает возможность относительно более точно, чем при прямой генной терапии, дозировать лечебный эффект, определяя количество вводимых клеток и количество производимого ими терапевтического фактора. Кроме того, генетическая модификация клеток позволяет в ряде случаев повысить их жизнеспособность при введении в поврежденные ишемизированные ткани или же усилить их способность к хоумингу в участки повреждения.

В данном обзоре рассматриваются основные экспериментальные работы по использованию генетически модифицированных клеток и возможные области и перспективы их использования для лечения больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Генная и клеточная терапия при ишемической болезни сердца и ишемии нижних конечностей

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является основной причиной смерти взрослого населения в развитых странах. Несмотря на наличие эффективных методов лечения, у 5—10% (по некоторым данным — до 30%) больных ИБС не удается адекватно контролировать заболевание (так называемая рефрактерная ИБС). При тяжелом распространенном поражении коронарного русла реваскуляризация имеет преимущество перед консервативным лечением (по влиянию на отдаленный прогноз и качество жизни), однако у таких больных традиционные вмешательства на коронарных артериях (коронарная ангиопластика и коронарное шунтирование) далеко не всегда обеспечивают полноценную реваскуляризацию миокарда, либо же вообще невыполнимы. Нередко положительный эффект этих вмешательств оказывается временным, и по мере прогрессирования коронарного атеросклероза состояние больного вновь ухудшается. У большинства таких больных медикаментозная терапия недостаточно эффективна, качество жизни остается низким, а риск сердечно-сосудистых осложнений — высоким.

Клинически выраженный периферический атеросклероз (с перемежающейся хромотой) встречается у 2—3% мужчин и 1—2% женщин старше 60 лет, а бессимптомный периферический атеросклероз (снижение лодыжечно-плечевого индекса до 0,9 и ниже при отсутствии жалоб) — в 3—4 раза чаще. Доля пациентов с критической ишемией нижних конечностей (КИНК), определяющейся как острая или хроническая ишемическая боль в ноге в покое или хроническая ишемическая язва и(или) гангрена, возникшая вследствие окклюзионного атеросклеротического поражения сосудов ног, составляет 5—10% от всех больных с периферическим атеросклерозом. Причем треть случаев этой патологии приходится на сахарный диабет 2 типа. Консервативное лечение дает лишь временный эффект, а инвазивные методики, включающие в себя ангиопластику и стентирование (выполнимы только у 10% пациентов) и различные варианты шунтирования, трудновыполнимы при поражениях дистального русла, шунты (за исключением аортоподвздошных) достаточно быстро окклюзируются. При тяжелой ишемии нижних конечностей консервативная терапия малоэффективна, и если пациент не является кандидатом для реваскуляризации (анатомическая протяжённость поражения сосуда и распространённость процесса), риск потери конечности очень высок.

Поэтому на сегодняшний день имеется острая необходимость внедрения в клиническую практику новых методов реваскуляризации миокарда и нижних конечностей.

Терапевтический ангиогенез, называемый часто биологическим шунтированием, является одним из наиболее перспективных неинвазивных методов нео-васкуляризации при ишемических поражениях. Суть метода заключается в стимуляции ангиогенеза в ишемизированной ткани путем создания в ней повышенной концентрации ангиогенных факторов роста — естественных индукторов ангиогенеза. Природа создала механизмы частичной адаптации организма к регионарной ишемии путём «компенсаторного артериогенеза» (т.е. развития коллатеральной сети) и ангиогенеза (развития новых капилляров), которые регулируются ангио-генными факторами. Однако этот процесс адаптации не способен полностью компенсировать недостаточность кровообращения в ишемизированных тканях при тяжелых стенозирующих поражениях магистральных сосудов. Основу лечебной тактики терапевтического ангиогенеза, предложенной М. Hockel в 1993 г.[1], составляет стимуляция естественного образования коллатеральных сосудов и пролиферации капилляров в ишемизированных тканях под действием ангиоген-ных факторов роста.

Терапевтический ангиогенез может стать методом выбора для больных с распространенным поражением коронарного или периферического артериального русла, которым нельзя выполнить адекватную реваскуля-ризацию.

Существует несколько способов создать в ткани необходимую для стимуляции ангиогенеза концентрацию факторов роста.

1. Введение в ткани-мишени препаратов рекомбинантных ангиогенных факторов роста.

2. Трансфекция клеток ишемизированного органа вводимыми извне генетическими конструкциями, содержащими гены ангиогенных факторов роста (генная терапия).

3. Введение в ткани-мишени клеток, способных продуцировать ангиогенные факторы роста или непосредственно участвовать в формировании сосудов (клеточная терапия).

Для стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде и скелетных мышцах используются все эти подходы.

С середины 1990-х гг. выполнено большое количество экспериментальных работ на моделях ишемии миокарда и задней конечности у мышей, крыс, кроликов, минисвиней, в которых была продемонстрирована возможность эффективной стимуляции ангиогенеза и артериогенеза и восстановление перфузии тканей в ответ на местное введение ангиогенных факторов роста (VEGF, aFGF, bFGF, HGF и др.) или их генов[2].

Однако результаты клинических испытаний оказались менее оптимистичными. Если в небольших неконтролируемых исследованиях были получены весьма обнадеживающие результаты как у больных ИБС (уменьшение функционального класса стенокардии,улучшение перфузии миокарда, формирование колла-тералей, улучшение функции сердца)[3, 4], так и у больных с КИНК (устранение ишемических болей в покое, увеличение дистанции безболевой ходьбы, заживление трофических язв, улучшение кровотока по данным УЗДГ, улучшение васкуляризации по данным ангиографии)[5], то результаты двойных слепых пла-цебо-контролируемых исследований были оценены как смешанные и не представили однозначных доказательств эффективности генной терапии ни у больных ИБС, ни у больных с хронической ишемией нижних конечностей[6]. Так, например, в исследовании Euroinject-1[7] плазмидная генетическая конструкция с геном VEGF-165 вводилась в зону гибернирующего миокарда трансэндокардиально с помощью катетера NOGA под контролем электро-механического картирования полости левого желудочка (80 больных ИБС с 3^4 классом стенокардии). Через три месяца не было обнаружено достоверных различий с плацебо по классу стенокардии и величине дефекта перфузии в покое и при нагрузке. Однако локальная сократимость стенки левого желудочка по данным вентрикулографии и локальное линейное укорочение по данным электромеханического картирования достоверно улучшились в группе генной терапии. В серии исследований AGENT-1, 2, 3 и 4 оценивалась эффективность генной терапии с помощью аденовирусной конструкции с геном FGF-4, вводимой внутрикоронарно неоперабельным больным ИБС, также были получены неоднозначные результаты. Так в исследовании AGENT-1 у 79 больных со стенокардией 2^4 класса через 4 нед. после введение большой дозы аденовирусной конструкции с геном FGF-4 существенно возросла толерантность к физической нагрузке[8], а в исследовании AGENT-2 — у большинства больных, получивших генную терапию, уменьшился дефект перфузии[9]. Однако в последующем межнациональном многоцентровом исследовании AGENT-4, которое проводилось в Европе, не было обнаружено различий с плацебо по увеличению толерантности к физической нагрузке у 116 пациентов[10]. Аналогичное исследование, проводившееся в США (AGENT-3) (416 больных, первичная конечная точка — увеличение толерантности к нагрузке через 3 мес.)[10] было остановлено из-за большого разброса значений толерантности к физической нагрузке в группах, делающее невозможным получение достоверных различий. Однако последующий более детальный анализ полученных данных в различных подгруппах больных установил, что генная терапия достоверно увеличивала толерантность к нагрузке в сравнении с плацебо в подгруппе больных старше 55 лет и с более тяжелой стенокардией (4 ф.к.).

Неоднородные результаты получены и при использовании генной терапии у больных с КИНК. В одном из первых рандомизированных исследований (VEGF peripheral vascular disease trial) 54 больным с КИНК внутриартериально с помощью катетера вводили либо плазмидную ДНК VEGF-165 в комплеке с липосома-ми, либо VEGF-165 в аденовирусном векторе, либо физиологический раствор и через три месяца получили более выраженное увеличение коллатеральных сосудов, по данным цифровой субтракционной ангиографии в группах генной терапии[11]. В другом исследовании эффективность введения плазмидной ДНК VEGF-165 в мышцы ишемизированной конечности тестировалась у 54 больных сахарным диабетом 2 типа и КИНК. Хотя по первичной конечной точке (процент ампутаций за 100 дней) не обнаружено достоверных различий с плацебо, по вторичным конечным точкам (лодыжечно-плечевой индекс, заживление трофических язв, боли в покое) значительное улучшение было в группе генной терапии[12,13]. В третьем исследовании (RAVE trial) у 105 больных при введении VEGF-121 в аденовирусном векторе внутримышечно в пораженную конечность через 3 мес. не обнаружено различий с контрольной группой по лодыжечно-плечевому индексу, времени максимальной ходьбы и качеству жизни[14]. Необходимо отметить, что в клинике не существует адекватного метода оценки ангиогенеза в отличие от экспериментальных работ, поэтому об ангиогенной эффективности генной терапии можно судить лишь косвенно по улучшению перфузии тканей или сократительной способности миокарда в случае ИБС.

С конца 1990-х гг. все большее внимание в качестве инструмента терапевтического ангиогенеза начинает привлекать клеточная терапия. Было обнаружено, что стволовые и прогениторные клетки продуцируют и секретируют в межклеточную среду широкий набор ан-гиогенных факторов роста. С другой стороны, углубленное изучение свойств эндотелиальных прогениторных клеток (ЭПК), содержащихся во фракции гемопоэти-ческих предшественников, показало, что они участвуют в формировании сосудов и во взрослом организме (васкулогенез) и при стимуляции факторами роста in vitro дифференцируются в эндотелиоциты. Эти данные создали теоретические предпосылки для использования стволовых и прогениторных клеток для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях. В экспериментах на модели ишемии задней конечности у крысы и мыши инъекции ЗПК или мононуклеарной фракции костного мозга, содержащей гемопоэтичес-кие предшественники (С034+клетки), приводили к улучшению кровоснабжения конечности (по данным лазерной доплерографии), увеличению количества коллатералей (по данным ангиографии и гистологического исследования). При этом новообразованные сосуды формировались не только за счет пролиферации эндотелиальных клеток in situ, но и за счет участия в формировании новых сосудов вводимых стволовых клеток (клетки метились с помощью маркерных генов) (15,16).

Способность стимулировать неоваскуляризацию ишемизированных скелетных мышц и миокарда убедительно продемонстрирована на экспериментальных моделях и для мезенхимных клеток костного мозга и жировой ткани (17,18)

Клинические исследования по клеточной терапии так же, как и в случае с генной терапией, дали значительно более скромные результаты. На сегодняшний день опубликовано несколько обзоров с мета-анализом результатов контролируемых исследований по применению клеточной терапии для лечения острого инфаркта миокарда (введение в инфаркт-связанную артерию) и хронической ишемической болезни с постин-фарктным кардиосклерозом (введение в инфаркт-свя-занную артерию, трансэндокардиальное введение с помощью системы NOGA)[ 19—21 ], Кратко, результаты этих аналитических работ показали, что использование клеток костного мозга для терапии острого инфаркта миокарда или хронической ИБС с постинфарктным кардиосклерозом дает весьма скромный, но достоверный эффект по сравнению с традиционной терапией (увеличение фракции выброса левого желудочка в среднем на 2,5^3,5%, уменьшение конечного систолического объема на 4,6^7,4%, уменьшение размера инфаркта на 3,5^5,6%)[17, 18]. В то же время мобилизация клеток костного мозга с помощью G-CSF у больных с острым инфарктом миокарда при достаточно хорошей переносимости не продемонстрировала дополнительной эффективности в сравнении с традиционной терапией[22]. Использование «скелетных миобластов» у больных с ишемической кардиомиопа-тией, по данным рандомизированного многоцентрового исследования MAGIC, также не привело к достоверному положительному эффекту (увеличению фракции выброса левого желудочка) по сравнению с контрольной группой[23].

Эффективность клеточной терапии при ишемии нижних конечностей оценивалась в основном в исследованиях, в которые включали больных с КИНК, у которых реваскуляризация была технически невыполнима, а консервативная терапия неэффективна, так что единственной альтернативой терапевтическому ангиогенезу была ампутация конечности. Клетки мононук-леарной фракции костного мозга или мононуклеарной фракции периферической крови вводились в мышцы ишемизированной конечности или в бедренную артерию[24]. В ряде случаев использовалась предварительная мобилизация с помощью 3^5 дневного курса п/к инъекций GM-CSF[25].

Во всех исследованиях отмечалось увеличение лопаточно-плечевого индекса и напряжения кислорода в тканях, уменьшение болей в покое, исчезновение парестезий увеличение длительности безболевой ходьбы, заживление трофических язв и улучшение перфузии конечности по данным сцинтиграфии с Тс-99т-тетро-фосмином у значительной части больных. Однако окончательное суждение об эффективности клеточной терапии при ишемии нижних конечностей возможно только после проведения контролируемых исследований на достаточно больших группах больных.

При обсуждении причин недостаточной эффективности генной и клеточной терапии при заболеваниях ишемического генеза, помимо претензий к дизайну исследований и выбору конечных точек, указывают в случае генной терапии на низкую эффективность трансфекции тканей человека и недостаточную длительность экспрессии трансгена, а в случае клеточной терапии — на гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную и ишемизированную ткань, снижение функциональной активности прогени-торных клеток у пожилых людей и больных ИБС, особенно в сочетании с диабетом 2 типа. Показано, что у больных ИБС ангиогенные и регенеративные свойства клеток костного мозга (способность формировать колонии, пролиферировать, мигрировать в ответ на VEGF и SDF-1 и стимулировать неоваскуляризацию ишемизированной конечности иммунодефицитных мышей), значительно снижены[17, 26]. Учитывая, что вклад паракринных эффектов трансплантированных клеток в неоваскуляризацию весьма существенен, возможно, именно секреторная активность клеток, а не их дифференцировочные свойства определяют ангиоген-ную и тканепротективную эффективность. Если это так, то усиление паракринных эффектов трансплантируемых клеток, путем их генетической трансформации с помощью конструкций, содержащих гены ангиогенных и антиапоптотических факторов, может быть перспективным подходом к повышению эффективности клеточной терапии.

Генетически модифицированные клетки для терапевтического ангиогенеза

Возможность повысить эффективность восстановления кровоснабжения и регенерации ишемизированных тканей с помощью генетически модифицированных прогениторных клеток исследовалась прежде всего с помощью клеток, трансформированных генетической конструкцией, несущей ген VEGF — основного регулятора ангиогенеза в эмбриональном и постнатальном периоде развития организма, что естественно, так как именно этот ген наиболее часто использовался для стимуляции ангиогенеза с помощью генной терапии. Различные типы клеток, включая мононуклеарную фракцию костного мозга или пуповинной крови, эндотелиальные клетки-предшественницы, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга и «скелетные миобласты» тестировались в этих работах. Как правило, эффективность клеток, гиперэкспрессирующих VEGF, сравнивали с эффективностью нетрансформированных клеток и (или) генной терапии с помощью конструкций, несущих ген VEGF. В работе Y. Ikeda с соавт.[28] клетки мононуклеарной фракции пуповинной крови человека трансфецировали геном hVEGF-165 и маркерным геном GFP с помощью вектора HVJ (вирус Сендай). Трансфецированные клетки экспрессировали маркеры эндотелия (Flk-1, VE-кадгерин, РЕСАМ-1, CD34, и Tie-2 ) и секретировали в среду VEGF. Клетки вводили в мышцы ишемизированной задней конечности крысы на фоне иммуносупрессии и получили более значительное усиление кровотока в конечности, чем при введении нетрансфецированных клеток пуповинной крови.

Использование модифицированных предшественников эндотелиальных клеток (ПЗК), гиперэкспрессирующих VEGF, позволило в 30 раз уменьшить количество клеток, необходимых для достижения желаемого эффекта[29], что очень важно для использования клеточной терапии в клинике, где проблема получения достаточного количества клеток стоит довольно остро.

Увеличить секреторную активность прогениторных клеток можно не только путем трансфекции (транс-дукции) их генами факторов роста, но и воздействуя на внутриклеточные сигнальные пути. Такой подход был использован в работе Choi J.H. с соавт.[30]. Исследуя внутриклеточные функции киназы гликогенсинтетазы Зр (GSK3p) авторы показали, что данный фермент является ключевым регулятором ряда внутриклеточных сигнальных каскадов, обеспечивающих выживание эн-дотелиоцитов и стимулирующих их миграцию. Они трансфецировали ЗПК in vitro плазмидой с геном карливалась экспрессия ангиогенных ФР — VEGF и IL-8. Это стимулировало дифференцировку ЗПК в направлении эндотелиоцитов. Введение генетически модифив мышцы ишемизированной конечности иммунодефицитных мышей приводило к увеличению капилляриза-ции мышц, восстановлению кровотока и предотвращало развитие гангрены конечности. Эти эффекты были значительно более выраженными, чем при введении нетрансфецированных ЗПК.

Другим подходом к увеличению паракринных эффектов ЗПК в условиях ишемии может быть гиперэкспрессия в них транскрипционного фактора, индуцируемого гипоксией — HIM —, который регулирует экспрессию нескольких ангиогенных факторов. Показано, что трансфекция ЗПК вектором с геном HIM — увеличивала в них экспрессию NO-синтазы и рецепторов к VEGF CFIk-1 D, секрецию VEGF и N0 этими клетками, а также увеличивала их способность стимулировать ангиогенез и восстановление кровотока в ишемизированных мышцах задней конечности иммунодефицитных мышей[31, 32].

Эффективный ангиогенез в миокарде и скелетных мышцах невозможен без миогенеза, а миогенез — без ангиогенеза[33]. Известно, что VEGF, секретируемый «скелетными миобластами» в условиях ишемии, является важным антиапоптотическим фактором для мышечных волокон[34]. Было предположено, что использование «скелетных миобластов», сверхэкспрессирующих VEGF, позволит более эффективно стимулировать как ангио-, так и миогенез. В нескольких работах исследовали восстановление кровотока в ишемизированной конечности после введения модифицированных скелетных миобластов. С помощью аденовирусного вектора в миобласты, предварительно полученные из материала биопсии скелетных мышц кролика, вводили гены VEGF и ангиопоэтина-1. Модифицированные клетки трансплантировали в ишемизированные мышцы задней конечности кролика и получили значительную стимуляцию васкуляризации мышц как по данным ангиогра-фического исследования (развитие коллатералей), так и по данным гистологического исследования (плотность сосудов — капилляров, мелких артерий)[35]. Количество сосудов в мышцах при введении трансформированных клеток было в 3 раза больше, чем при введении интактных «миобластов» или «миобластов», трансформированных «пустым» вектором. Использование вектора с геном одного фактора было менее эффективным, чем вектора с генами двух факторов. Та же группа авторов на модели инфаркта миокарда у минисвиней показала, что «скелетные миобласты», трансдуциро-ванные аденовирусным вектором, несущим гены VEGF и ангиопоэтина-1, более эффективно восстанавливают функцию сердца после инфаркта и стимулируют образование стабильной функциональной сосудистой сети в периинфарктной зоне, чем немодифицирован-ные миобласты или миобласты, трасдуцированные «пустым» вектором[36].

Возможность существенного повышения эффективности клеточной и генной терапии путем переноса генов с помощью клеток была убедительно продемонстрирована и в других работах на моделях инфаркта миокарда. Так в одном из первых в этой области исследовании К. Suzuki с соавт.[37] в миокард периинфарктной зоны крыс вводили взвесь аутогенных миобластов, предварительно трансфецированных in vitro геном VEGF с помощью вектора HVJ (Сендай) в комплексе с липосомами. Авторы предположили, что в условиях острой ишемии VEGF, секретируемый генетически модифицированными «миобластами», будет способствовать улучшению перфузии миокарда и уменьшению размера инфаркта, а дифференцировка миобластов в функционально полноценные мышечные волокна будет препятствовать развитию неблагоприятного ремоделирования левого желудочка и сердечной недостаточности в дальнейшем. В экспериментальной группе действительно было достигнуто существенное уменьшение размеров инфаркта по сравнению с контрольной группой (введение физиологического раствора в периинфарктную зону), однако отсутствие группы сравнения, где животным вводили бы нетрансфецированные «миобласты», наряду с отсутствием в работе оценки ангиогенеза снижает ценность полученных результатов. Тем не менее, было показано, что данная технология может успешно применяться при экспериментальном инфаркте. В дальнейшем было установлено, что введение в область рубца 4 млн миобластов, сверхэкспрессирующих VEGF, на модели криогенного повреждения миокарда у крыс более эффективно стимулировало ангиогенез, чем введение плазмиды с геном VEGF[38]. И так же, как и в предыдущем исследовании, отсутствие соответствующей контрольной группы (введение нетрансфецированных «миобластов») оставило открытым вопрос о вкладе секреции VEGF миобластами в общий эффект.

Ответ был получен в исследовании A. Askari с соавт.[39], где скелетные миобласты, трансформированные аденовирусным вектором, несущим ген VEGF-165, вводили в миокард периинфарктной зоны сердца крысы через 2 мес. после моделирования инфаркта миокарда (модель ишемической кардиомиопатии) (опытная группа). В группах сравнения животным вводили либо миобласты, трансдуцированные вектором с маркерным геном (группа клеточной терапии), или раствор самого вектора с геном VEGF (AdVEGF-165) (группа генной терапии), либо физиологический раствор (контрольная группа). В опытной группе и группе генной терапии количество сосудов в миокарде было, соответственно, в 3 и в 2 раза больше, чем в группе клеточной терапии. В то же время улучшение сократимости миокарда (по сравнению контрольной группой) наблюдалось только в группах животных, получивших введение «миобластов», при этом в группе с введением модифицированных клеток эффект был более выраженным, чем в группе с применением интактных миобластов. Улучшение функции коррелировало с меньшим количеством апоптозов в периинфарктной зоне у животных экспериментальной группы. Количество мышечных волокон в обеих группах значимо не отличалось, что свидетельствовало о том, что улучшение сократительной функции происходило не за счет более активной «диф-ференцировки» миобластов в мышечные волокна, а, вероятно, было обусловлено улучшением перфузии миокарда и предотвращением индуцированного ишемией апоптоза кардиомиоцитов вследствие секреции введенными клетками VEGF.

Значительная стимуляция ангиомиогенеза продуцирующими VEGF «миобластами» человека показана на модели хронической ишемии миокарда у свиньи с иммуносупрессией циклоспорином. Увеличение количества сосудов в 6 раз превышало эффект нетрансфор-мированных клеток[40].

Возможность значительно улучшить функцию сердца после инфаркта и предотвратить развитие постин-фарктного ремоделирования левого желудочка с помощью модифицированных «скелетных миобластов» показана в работе S. Rong с соавт.[41]. Миобласты были трансфецированы плазмидой, несущей ген гормона роста, который, как показано ранее, способен стимулировать ангиогенез и подавлять апоптоз клеток. Оказалось, что продуцирующие гормон роста «миобласты» были существенно эффективнее интактных «миобластов» как в стимуляции ангиогенеза, так и во влиянии на функцию сердца. Более того, такая модификация значительно улучшала выживаемость «миобластов» после трансплантации.

Эффективность генетически трансформированных прогениторных клеток костного мозга и периферической крови исследована в нескольких работах. К. Hagikura с соавт.[42] вводили в периинфарктную зону сердца свиньи трансфецированные плазмидой с геном VEGF клетки мононуклеарной фракции, полученной из периферической крови. Для трансплантации использовали ретроградное введение в коронарные вены. Было показано, что введение трансфецированных клеток эффективно стимулировало образование коллатеральных сосудов и капилляризацию периинфарктной зоны и улучшало функцию сердца.

Наибольшее внимание в качестве инструмента клеточной терапии, направленной на стимуляцию неовас-куляризации и регенерации миокарда, привлекают мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга (ММСК). Именно для этого типа клеток достаточно хорошо документирована способность к кардиомиоцитарной дифференцировке как in vitro, так и in vivo[43, 44]. ММСК секретируют широкий спектр ангиогенных и антиапоптотических факторов роста (VEGF, HGF, bFGF, SDF-1 и др.), имеют высокий пролиферативный потенциал и способность к самообновлению, что критично для обеспечения длительного эффекта клеточной терапии[45]. Эффективность стимуляции неоваскуляризации и улучшения функции сердца после инфаркта при трансплантации ММСК показана в экспериментальных[46] и клинических работах[47]. Помимо этого интенсивно изучается возможность повышения эффективности применения ММСК для клеточной терапии за счет генетической модификации этих клеток. В основу этих работ положена гипотеза о том, что усиление за счет генетической модификации продукции одного ангиогенного или антиапоптотического фактора позволит повысить эффективность стимуляции ангиогенеза и процессов репарации за счет синергизма с другими факторами, сек-ретируемыми этими клетками. Одной из первых работ было исследование R. Matsumoto с соавт.[48], в котором МСК, модифицированные с помощью аденовирусного вектора с геном VEGF-165, вводились в периинфарктную зону сердца крысы через час после окклюзии передней нисходящей артерии (ПНА). Через месяц после инфаркта значительное улучшение показателей функции сердца, уменьшение размера инфаркта и увеличение плотности сосудов в периинфарктной зоне было отмечено у животных, которым вводили модифицированные клетки, по сравнению с животными, получившими только введение среды культивирования. Однако по сравнению с введением немодифицирован-ных клеток, отмечались лишь тенденции к более значительному улучшению этих показателей. Достоверное повышение эффективности клеточной терапии инфаркта миокарда за счет модификации ММСК продемонстрировано в работе F. Gao с соавт.[49]. Размер инфаркта, параметры функции сердца и количество сосудов через месяц после перевязки ПНА и введения клеток были достоверно лучше у животных, получивших ММСК, трансдуцированные аденовирусом с геном VEGF как в сравнении с животными, получившими ММСК, трансдуцированные контрольным вектором, так и в сравнении с животными, получившими прямое введение аденовируса с геном VEGF. Часть трансплантированных ММСК дифференцировалась в кардиомиоцитарном направлении (меченные флуоресцентным красителем клетки экспрессировали тропонин Т), и только небольшое количество введенных клеток дифференцировалось в клетки сосудов. Большинство же сосудов в периинфарктной зоне не содержало меченых клеток. Эти результаты показывают, что модифицированные ММСК эффективно стимулируют миогенез как за счет пара-кринных эффектов, так, возможно, и за счет диффе-ренцировки в кардиомиоциты, и стимулируют ангиогенез, вероятно, за счет паракринных механизмов.

Эффективность трансформированных ММСК при их введении в миокард в отдаленные после инфаркта сроки изучалась в работе J. Yang с соавт.[50]. ММСК, сверхэкспрессирующие VEGF, вводились в периинфарктную зону сердца крысы через две недели после лигирования передней нисходящей артерии. В качестве контрольных групп использовались животные, которым вводили не трансформированные МСК, плазмиду с геном VEGF и среду культивирования клеток. Оказалось, что через 4 нед. после этих манипуляций наилучшие показатели функции и размеров сердца и наибольшая плотность сосудов в периинфарктной зоне были в группе животных, которым вводили трансформированные клетки, продуцирующие VEGF. Аналогичные результаты были получены и на модели ишемии миокарда у кролика при использовании ММСК, модифицированных с помощью аденовирусного вектора, несущего ген VEGF[51]. Более значительная (в сравнении с нетранс-формированными клетками) стимуляция ангиоартерио-генеза в постинфарктном сердце крысы была получена и при использовании трансформированных МСК, продуцирующих ангиопоэтин-1 — ангиогенный фактор, регулирующий образование стабильных, «зрелых» сосудов[52]. Недавно эффективная стимуляция ангиогенеза, улучшение функции сердца и выживаемости клеток после трансплантации продемонстрирована также при введении в периифарктную зону сердца крысы генетически модифицированных ММСК, сверхэкспрессирующих ангиогенин[53].

Возможность повысить эффективность стимуляции неоваскуляризации тканей с помощью генетически модифицированных прогениторных клеток показана и на модели аутодермопластики лоскутом на ножке. Так трансплантация трансфецированных in vitro плазмидой phVEGF-165 ЭПК, полученных из пуповинной крови человека, улучшала кровоснабжение и показатели сохранности ишемизированного кожного лоскута у мышей, в то время как интактные ЭПК по эффективности были сравнимы с плацебо[54]. На этой же модели была успешно применена аутотрансплантация скелетных миобластов, трансфецированнных геном FGF-2 и получены аналогичные результаты[55].

Обобщая результаты экспериментальных работ по использованию трансформированных прогениторных клеток для терапевтического ангиогенеза можно заключить, что имеющиеся данные убедительно показывают большую эффективность трансформированных клеток по сравнению с нетрансформированными клетками и генной терапией. Хотя следует признать, что далеко не во всех работах были использованы адекватные контрольные группы.

Повышение жизнеспособности трасплантируемых клеток, их хоуминга и интеграции в структуру ткани с помощью генетической модификации

Помимо повышения ангиогенной эффективности клеточной и генной терапии, важнейшей целью модификации трансплантируемых клеток является повышение их выживаемости после трансплантации. Гибель значительного количества клеток после введения в поврежденные ткани признается одной из наиболее важных проблем, ограничивающих эффективность клеточной терапии. По данным J. MQller-Ehmsen с соавт.[56], более 70% неонатальных кардиомиоцитов, трансплантированных в миокард, погибает в течение первых 24 ч. Для увеличения выживаемости клеток после трансплантации разрабатываются различные подходы. Так цитопротективный эффект фармакологического прекондициоирования был показан на «скелетных ми-областах» in vitro и in vivo[57, 58]. Культивирование клеток перед трансплантацией в условиях гипоксии[59] или повышенной температуры[60] также увеличивало выживаемость клеток при гипоксии-реоксигенации in vitro и при трансплантации в сердце.

Важной внутриклеточной сигнальной молекулой, опосредующей антиапоптотические и пролиферативные сигналы, является Akt-киназа[61]. Впечатляющие результаты были получены при введении в сердце мыши после инфаркта модифицированных ретровирусной конструкцией мезенхимных клеток костного мозга, конститутивно экспрессирующих Akt-киназу. Функция сердца мыши почти полностью восстанавливалась при введении модифицированных клеток. Их эффект был значительно лучше, чем эффект немодифицирован-ных ММСК[62]. Первоначально полагали, что этот эффект обусловлен только уменьшением апоптотичес-кой гибели введенных клеток, однако последующие работы показали, что экспрессия Akt-киназы в несколько раз увеличивала экспрессию ангиогенных факторов роста клетками и, вероятнее всего, именно усиление паракринных влияний обусловило как повышение терапевтической эффективности модифицированных клеток, так и их выживание после трансплантации[63].

Существенным фактором для клеточной терапии является длительность эффекта. В этом плане интерес представляет экспериментальная работа группы ученых из Цинциннати (США). Они трансплантировали в периинфарктную зону сердца крысы генетически модифицированные ММСК, сверхэкспрессирующие одновременно Akt-киназу и ангиопоэтин-1[64] и получили стабильную регистрирующуюся через 3 мес. стимуляцию ангиоартериогенеза, улучшение функции сердца, приживление трансплантата и признаки диф-ференцировки транплантированных клеток в кардиоми-оцитарном направлении. Однако использование клеток, конститутивно экспрессирующих Akt-киназу, таит в себе опасность онкогенности[65], поэтому продвижение данной технологии в клинику требует проведения экспериментальных разработок регулируемой экспрессии Akt-киназы.

Удачная попытка увеличить выживаемость клеток после транплантации была предпринята в работе W. Li с соавт.[66]. ММСК, полученные из костного мозга крысы, были трансфецированы антиапоптотическим геном Bcl-2 и введены в периинфарктную зону. Выживаемость модифицированных клеток была в два раза больше через 3 нед. после трансплантации, а стимуляция ангиогенеза и улучшение функции сердца были более выражены, чем при введении клеток, трансформированных «пустым» вектором.

Другой молекулой, обладающей антиапоптотической, антивоспалительной и цитопротективной активностью, является гемоксигеназа — HO-1 — фермент, катализирующий образование из гемоглобина биливердина, свободных ионов железа и оксида углерода (СО). Все эти три продукта защищают клетки от повреждения и смерти, индуцированных оксидативным стрессом[67]. Показано, что ММСК, трансфецированные плазмидой, несущей ген НО-1 под промотором, регулируемым гипоксией, устойчивы к гипоксическому повреждению in vitro и значительно лучше, чем интактные ММСК, выживают при введении в ишемизированный миокард[68].

Наиболее приемлемым для клинического использования является внутрисосудистый способ трансплантации стволовых и прогениторных клеток. При таком способе введения эффективный «хоуминг» клеток — их миграция в зону повреждения и ишемии — могут существенно влиять на эффективность клеточной терапии. Клетки ишемизированных и поврежденных тканей секретируют различные факторы роста и цитокины, из которых наиважнейшим сигналом к миграции и «хоумингу» является хемокин — фактор стромальных клеток (SDF-1), привлекающий гематопоэтические стволовые клетки, несущие на своей поверхности рецептор к SDF-1 — молекулу адгезии CXCR4[69]. Низкий уровень экспрессии CXCR4 обнаружен на минорной субпопуляции ММСК, а большинство ММСК не экспрессируют на своей поверхности CXCR4. Для улучшения миграции, «хоуминга» и выживания трансплантированных ММСК предложено трансформировать их генетическими конструкциями, несущими ген CXCR4. В исследованиях in vitro было показано, что трансдукция этих клеток с помощью ретровирусного вектора с геном CXCR4 значительно увеличивает их миграцию в трансвеллах в ответ на SDF-1[70]. Внутривенное введение ММСК, экспрессирующих CXCR4, через 3 дня после моделирования инфаркта у крыс стимулировало их аккумуляцию в периинфарктной зоне, ангиогенез и миогенез, улучшало функцию сердца[71]. Эффективность модифицированных клеток была выше по сравнению с немодифицированными клетками.

Главной проблемой при трансплантации «скелетных миобластов» в миокард является отсутствие их электрической интеграции в миокард реципиента, поскольку зрелые скелетные мышечные волокна, конечный продукт дифференцировки «миобластов», не экспрессируют белок межклеточной адгезии N-кадгерин (N-Cad) и белок межклеточных контактов коннексин 43 (Cx43), обеспечивающие нормальное проведение электрического возбуждения от одного кардиомиоцита к другому. Таким образом, в месте имплантации «миобластов» образуется фрагмент поперечно-полосатой мышцы и формируется субстрат для возникновения повторного входа возбуждения. Это было продемонстрировано и при совместном культивировании «миобластов» и кар-диомиоцитов[72]. В клинических испытаниях у некоторых больных после введения в миокард аутогенных миобластов возникали частые пароксизмы желудочковой тахикардии, что требовало имплантации кардио-вертера-дефибриллятора[73]. Для преодоления этой существенной проблемы данного вида клеточной терапии и обеспечения адекватного электрического сопряжения образующихся мышечных волокон с кардиомио-цитами предложено трансформировать «миобласты» in vitro геном коннексина 43 (Сх43)[74]. Однако авторы работы столкнулись с неожиданным препятствием: модифицированные «миобласты» формировали мышечные волокна, экспрессирующие Сх43, но последние оказывались нежизнеспособными и гибли в течение 2 нед. Авторам удалось найти выход: они поставили ген Сх43 под контроль тканеспецифичного промотора — промотора гена мышечной креатинкиназы. Известно, что этот фермент экспрессируется только в зрелых мышечных волокнах. В результате удалось получить жизнеспособные мышечные волокна, эффективно экспрессирующие Сх43 и формирующие контакты с кардиомиоцитами хозяина, что свидетельствовало в пользу формирования электрического сопряжения, хотя окончательно это не было доказано, так как электрофизиологические эксперименты не проводились.

Показано, что «миобласты» могут играть роль ан-тиген-презентирующих клеток[75]. Поэтому экспрессия ими трансгена с высокой вероятностью может приводить к развитию иммунного ответа на трансгенный продукт или вирусные белки вектора, который может приводить к дополнительному повреждению мышечных волокон. Для уменьшения иммунного ответа предложено использование специфических промоторов, запускающих экспрессию только после окончания диф-ференцировки. Так, трансдукция миобластов аденовирусным вектором с геном люциферазы, который регулировался промотором мышечной креатинкиназы вместо обычного цитомегаловирусного промотора, уменьшала интенсивность иммунного ответа после трансплантации таких клеток, клетки лучше выживали и дольше экспрессировали трансген[76]. Альтернативный подход — трансфекция «миобластов» геном «атипичной» молекулы главного комплекса гистосовместимости HLA-G, который экспрессируется в мышцах при воспалении, а также «миобластами» в культуре[77]. Две изоформы этого белка — HLA-G1 (трансмембранный белок) и HLA-G5 (растворимая форма), экспрессируемые модифицированными «миобластами», предупреждали аллореактивный лизис последних за счет прямого подавления активности естественных киллеров, CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.

Генетически модифицированные клетки в качестве биологических пейсмейкеров

Тяжелые нарушения ритма сердца, обусловленные слабостью синусового узла или развитием полной блокады, требуют установки искусственных электронных водителей ритма. Несмотря на постоянное их совершенствование, они не лишены некоторых весьма существенных недостатков, таких как фиксированная частота пульса и ограниченный срок действия.

Одним из перспективных направлений в лечении таких нарушений ритма сердца может стать генетическая модификация «миобластов» или ММСК с целью придания им пейсмейкерных свойств с последующей трансплантацией в миокард для создания биологического пейсмейкера, который будет способен отвечать на физиологические стимулы[79]. Так, трансфекция ММСК плазмидой, несущей специфичный для клеток-пейсмейкеров ген HCN2, кодирующий а-субъединицу мембранного канала, обеспечивающего пейсмейкер-ный ток If, придавала клеткам соответствующие свойства (временные и амплитудные показатели потенциалов покоя и действия, появление тока If, частота соб- ственного ритма)[80]. Функциональная полноценность пейсмейкера была продемонстрирована как in vitro при совместном культивировании с кардиомиоцитами желудочков, так и in vivo после субэпикардиальной инъекции в сердце собаки, когда во время электрофизиоло-гического исследования при индукции синусовой паузы регистрировался гемодинамически эффективный замещающий ритм нового пейсмейкера. При гистологическом исследовании обнаруживались полноценные щелевые контакты с кардиомиоцитами хозяина. Работы в этой области только начинаются и в случае успеха могли бы обеспечить замену электронных пейсмейкеров на биологические, хотя на сегодняшний день перспектива их клинического применения не ясна.

Заключение

С развитием генной и клеточной терапии несомненно связывают перспективы решения многих проблем кардиологии и ангиологии, таких как восстановление кровоснабжения ишемизированных тканей, особенно в случаях невозможности провести эффективную хирургическую и эндоваскулярную реваскуляризацию, регенерация миокарда после инфаркта, восстановление функции сердца при сердечной недостаточности, лечение нарушений ритма и пр.

Несмотря на огромный потенциал, показанный в экспериментальных работах, успехи генной и клеточной терапии в клинике при используемых сегодня подходах невелики. Одним их путей повышения эффективности генной и клеточной терапии может быть генетическая модификация клеток, позволяющая улучшить их регенеративные свойства за счет усиления пара-кринной активности (секреции факторов роста), повышения жизнеспособности клеток при трансплантации, увеличения их способности к хоумингу и интеграции в ткань-мишень, создания клеток с новыми свойствами для замещения функции погибших клеток (биологические пейсмейкеры).

В подавляющем большинстве экспериментальных работ генетически модифицированные клетки (стово-ловые, прогениторные, «миобласты») оказались эффективнее немодифицированных или прямой генной терапии (введения генетических конструкций). Однако продвижение этой технологии в клинику требует, прежде всего, решения вопросов ее безопасности. И в этом плане разработка безопасных, желательно невирусных способов модификации клеток, использование регулируемых и тканеспецифичных промоторов, оценка возможных трансформаций модифицированных клеток, оценка длительных эффектов, в том числе побочных эффектов их трансплантации на лабораторных животных, должна предшествовать разработке клинических протоколов оценки эффективности этой технологии.

Подняться вверх сайта