Поиск Кабинет

Перспективы использования плюрипотентных стволовых клеток человека для получения компонентов крови: эритропоэз

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 6-12

 

Авторы

Филоненко Е.С., Лагарькова М.А., Киселев С.Л.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Обзор посвящён проблеме получения клеток эритроидного ряда из плюрипотентных стволовых клеток человека. Плюрипотентные стволовые клетки человека (эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) обладают способностью к самоподдержанию и дифференцировке во все типы клеток организма, в том числе клетки крови. Поскольку проблема нехватки донорской крови стоит во всем мире очень остро, разработка технологий получения крови или отдельных форменных элементов из плюрипотентных клеток – крайне современная и нужная задача, которой посвящены работы многих лабораторий мира.

Актуальность

С тех пор, как J.A. Thomson и соавт. (1998) впервые получили эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека из внутренней клеточной массы бластоцисты[1], благодаря потенциальной способности дифференцироваться во все типы клеток организма (свойства плюрипотентности) ЭСК рассматриваются как модель для изучения процессов ранней клеточной дифференцировки и специализации. ЭСК человека могут служить также источником клеток для «регенеративной медицины», но их использование связано с рядом проблем, основная из них – проблема иммунологической совместимости.

В 2006 г. K. Takahashi и S. Yamanaka получили ещё один тип плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК)[2]. иПСК могут быть получены для каждого пациента индивидуально, а неограниченная пролиферация позволяет производить генетические манипуляции (трансгенез и гомологичную рекомбинацию), что делает иПСК перспективным источником клеток для лечения многих заболеваний, в том числе гематологических. Проблема нехватки иммуносовместимого аллогенного материала (костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)) остро стоит во всём мире[3–4], в то время как трансплантация элементов крови является основой современной медицины. Кроме нехватки доноров, существуют такие проблемы, как передача инфекционных заболеваний и иммунологическая несовместимость. Использование ЭСК и иПСК в качестве источников клеток крови позволило бы решить эти проблемы. Этот обзор посвящён вопросам получения пригодных для использования в клинической практике клеток эритроидного ряда из ПСК человека.

Эритропоэз человека

В процессе эмбриогенеза млекопитающих эритропоэз происходит в 2 этапа: этап примитивного эритропоэза, начинающийся и ограничивающийся внезародышевым желточным мешком[5–8], и этап дефинитивного гемопоэза, который начинается в желточном мешке и (или) собственно в зародышевых тканях[9–10] и продолжается в зародышевой печени, а затем – в костном мозге[7].

Эмбриональный эритропоэз человека почти недоступен для исследований in vivo. Для изучения этого процесса на клеточном и молекулярном уровне служат модели in vitro. Для анализа кроветворения in vitro используются следующие методы оценки качества кроветворных предшественников: морфологическая характеристика по окрашиванию специфическими красителями (такие, как метод Романовского – Гимзы); исследование набора экспрессируемых глобинов; исследование суррогатных стадиеспецифичных маркеров ГСК и клеток-предшественниц, выявленных при исследованиях, проведённых на мышиных моделях; функциональный непрямой тест на образование колоний в полужидких средах в культуре[11–14]. Тест на образование колоний в полужидких средах позволяет выявлять в составе кроветворных предшественников колониеобразующие единицы (КОЕ). Помещение КОЕ в полужидкую среду (обычно метилцеллюлозу или агар), дополненную гемопоэтическими цитокинами, вызывает локальную экспансию и дифференцировку гемопоэтических клеток в дискретных колониях. По морфологии колоний можно определить тип КОЕ. В процессе ранних стадий клеточной дифференцировки образуются эритроидные предшественники, которые обнаруживаются в тесте на образование колоний в полужидких средах: эритроидная бурстобразующая единица (БОЕэ) – ранний эритроидный предшественник, мало чувствительный к эритропоэтину (EPO), гормону терминальной дифференцировки, и затем эритроидная колониеобразующая единица (КОЕэ), которые постепенно дифференцируются в эритробласты, нормобласты, ретикулоциты и, наконец, в зрелые энуклеированные эритроциты[15]. Этот комплекс процессов контролируется ростовыми факторами, включающими EPO[16].

Дефинитивные и примитивные эритроидные клетки отличаются морфологически[17, 18] и на молекулярном уровне по разнице в составе гемоглобина. Гемоглобин является гетеротетрамером, состоящим из двух гомодимеров: принадлежащих к альфа- и бета-глобиновому кластерам.

Примитивные эритроидные клетки экспрессируют эмбриональный Hb Gower 1 (ζ2ε2), Hb Gower 2 (α2ε2) и фетальный Hb F (α2γ2) гемоглобины, а взрослые – 95% (α2β2), 1,5–3,5% (α2δ2) и небольшое количество (α2γ2), начинающего экспрессироваться в третьем триместре[19–22]. Эмбриональные и фетальные гемоглобины, а также небольшое количество взрослого гемоглобина детектируются на 5-6 нед. развития эмбриона человека[21, 22], т.е. уже на этом этапе развития существуют и примитивные, и дефинитивные эритроидные клетки. Таким образом, примитивные и дефинитивные эритроидные клетки экспрессируют ε, γ, и весь набор α-глобинового кластера, в то время как ζ экспрессируется на 5 нед. только в примитивных клетках, заменяясь β глобином на 6 нед.[22]. β-глобин является отличительной чертой исключительно дефинитивных эритроидных клеток. Существует две теории происхождения примитивных и дефинитивных эритроидных клеток: из разных предшественников и из одного[17, 18].

Гемопоэтическая дифференцировка ПСК человека

Впервые способность ЭСК дифференцироваться в гемопоэтические клетки была показана в лаборатории J.A. Thomson[23]. К этому времени уже были разработаны основные способы индукции дифференцировки ЭСК мыши in vitro: метод дифференцировки через стадию эмбриоидных телец (ЭТ)[24, 25], метод совместного культивирования со стромальными линиями[26, 27] и метод культивирования на поверхностях, покрытых коллагеном[28]. Для гемопоэтических клеток, полученных из ЭСК мыши, был исследован паттерн экспрессии генов, характерных для различных типов клеток крови, проведён фенотипический анализ и функциональные тесты, позволившие охарактеризовать гемопоэз мыши in vitro. Все методы индукции дифференцировки и характеристики дифференцированных производных ЭСК мыши были использованы для разработки методов регуляции дифференцировки ЭСК человека. Однако в связи с тем, что in vivo гемопоэз человека в значительно степени отличается от гемопоэза мыши, методы индукции дифференцировки были адаптированы лишь частично, а критерии оценки дифференцированных производных пришлось впоследствии во многом пересмотреть. Например, поверхностные маркеры, которые были успешно использованы для описания ранних кроветворных предшественников, появляющихся при дифференцировке ЭСК мыши, оказались не подходящими для описания кроветворной дифференцировки ЭСК человека (многие из этих маркеров экспрессировались недифференцированными ЭСК человека)[29, 30]. Например, Flk-1+-клетки, появляющиеся при дифференцировке ЭСК мыши и способные к дальнейшей дифференцировке как в эндотелиальные, так и в гемопоэтические клетки[31–34], присутствуют и в недифференцированных популяциях ЭСК человека, и в ЭТ в сходных количествах, поэтому Flk-1 не может рассматриваться как маркер гемопоэтической дифференцировки ЭСК человека[29]. К моменту выхода первой работы по дифференцировке ЭСК человека также были накоплены знания по гемопоэзу человека in vitro, полученные при исследованиях гемопоэтических предшественников, выделяемых из костного мозга, периферической и пуповинной крови человека. Были описаны основные методы, позволяющие характеризовать и выделять ГСК человека, обладающие высоким пролиферативным потенциалом и способные восстанавливать кроветворение у облученных или генетически дефектных мышей[35], так называемые длительно репопулирующие ГСК (ДР-ГСК). ДР-ГСК человека характеризуются экспрессией молекулы адгезии CD34 и имеют фенотип: Lin-/c-Kit+/CD34+/CD38– (Lin- – отсутствие маркеров линейных дифференцировок)[36, 37].

Также существуют ГСК, способные кратковременно репопулировать облученное животное (КР-ГСК). Их отличие от ДР-ГСК состоит в том, что они способны репопулировать облученный организм, однако через 4–6 нед. их кроветворные способности истощаются. Хотя методы характеристики и селекции ГСК и позволили получить достаточную информацию, чтобы использовать эти клетки для трансплантации, биология ГСК человека остается еще малоизученной. Так, была выявлена популяция CD34--клеток также обладающих свойствами ГСК: способностью к дифференцировке, самовозобновлению и длительной репопуляции костного мозга[38–41].

Методы индукции дифференцировки ПСК человека включают несколько основных подходов: совместное культивирование со стромальными клеточными линиями[23; 42–48], дифференцировка через стадию эмбриоидных телец[29, 30, 49–55], а также комбинация указанных подходов[56].

При выращивании кластеров ЭСК в суспензии происходит их агрегация, сопровождающаяся спонтанной дифференцировкой в различные клеточные типы, относящиеся к производным эндодермы, эктодермы и мезодермы. Эти агрегаты, имеющие форму сфер, называются ЭТ[57–60]. Впервые метод индукции дифференцировки ЭСК по гемопоэтическому пути через стадию ЭТ был применён в лаборатории М. Bhatia[49]. В этой же работе был определен один из ключевых факторов, запускающих гемопоэтическую дифференцировку ЭСК человека, – BMP-4 (bone morphogenetic protein-4), для которого ранее была показана способность изменять пролиферативный потенциал и способность к дифференцировке дефинитивных гемопоэтических предшественников плода, новорожденных и взрослого человека[61–64]. Впоследствии было показано, что добавление BMP-4, VEGF (vascular endothelial growth factor)[50], SCF (stem cell factor), TPO (thrombopoietin) и Flt3L (Flt-3 ligand) в бессывороточную среду для дифференцировки ЭСК через стадию ЭТ в значительной степени улучшает кроветворную дифференцировку[44]. Установленный набор из этих пяти цитокинов является основным для практически всех протоколов индукции дифференцировки[65–67].

В качестве стромальных клеточных линий для совместного культивирования, как правило, используются линии клеток, для которых было показано, что они поддерживают рост гемопоэтических предшественников, выделенных из костного мозга. Так, D.S. Kaufman и соавт. (2001), первыми показавшие возможность дифференцировки ЭСК человека по гемопоэтическому пути[23], использовали линии клеток костного мозга S17 и эндотелия желточного мешка мыши C166[68, 69]. Наиболее широко для регуляции дифференцировки ПСК человека используются стромальные клетки мыши линии OP9[47; 70–72]. Также возможна эффективная индукция дифференцировки ПСК человека с использованием стромальных клеток, полученных из аорта-гонадомезонефроса и зародышевой печени мыши[67, 73–76].

Независимо друг от друга, разные группы исследователей получили ряд похожих результатов. Вопервых, при дифференцировке методом совместного культивирования и через стадию эмбриоидных телец наблюдается сходная временная шкала дифференцировки, в то время как сам процесс является следствием случайных событий, происходящих в ходе дифференцировки, а повышение вероятности дифференцировки по выбранному направлению достигается варьированием условий культивирования[23, 29, 30, 42, 49, 51]. Во-вторых, в процессе дифференцировки гемопоэтические клетки развиваются из CD45+-предшественников, которые экспрессируют поверхностные маркеры CD31 и CD34[23, 42, 49, 29, 30].

Эритроидные клетки, получаемые из ПСК

В первой же работе по получению клеток крови из ЭСК было показано, что дифференцированные кроветворные предшественники содержат БОЕэ (по результатам теста на образование колоний в полужидких средах) и клетки в эритроидных колониях экспрессируют гликофорин А (CD 235a), основной маркер эритроидных клеток[23]. Последующие работы также продемонстрировали возможность получения эритроидных клеток из ЭСК[30, 42, 43, 49, 65, 77, 78]. Ряд исследований сосредоточены непосредственно на получении эритроидных клеток, причём используются как способ дифференцировки через стадию эмбриоидных телец или совместное культивирование со стромальными клеточными линиями, так и комбинация этих подходов[56, 65, 75, 79–83]. Основные этапы дифференцировки ПСК по пути эритропоэза представлены на рисунке.

Несмотря на достаточное количество опубликованных методик получения эритроидных клеток, ни одна из них не может быть использована для получения эритроцитов, пригодных для клинического использования. Основная причина заключается в том, что эритроидные клетки, получаемые из ПСК человека, как правило, экспрессируют набор глобинов, характерный для эмбриональных эритроцитов (Hb Gower 1 (ζ2ε2), Hb Gower 2 (α2ε2) и фетального гемоглобина Hb F (α2γ2)[56, 65, 83, 84]. Экспрессия небольшого количества взрослого гемоглобина (α2β2) была достигнута всего в нескольких исследованиях, причём доля клеток, экспрессирующих β-глобин, была незначительна и скорее демонстрировала возможность эритроидных клеток «созревать». Также одной из проблем является получение энуклеированных эритроцитов. Энуклеация взрослых эритроидных клеток in vitro была достигнута при дифференцировке ГСК, полученных из взрослых гемопоэтических тканей. Перенести разработанные методы на эритроидные клетки, получаемые из ПСК, не удалось. Одним из объяснений данного явления может быть то, что эритроидные клетки, получаемые из ПСК, представляют собой аналог примитивных эритроидных клеток человека, появляющихся в процессе онтогенеза в желточном мешке. Такие клетки выходят в кровоток содержащими ядра, и уже в процессе циркуляции происходит их энуклеация. Действительно, если рассматривать ЭТ как модель желточного мешка, то получение при дифференцировке через стадию ЭТ преимущественно ранних кроветворных клеток, таких как примитивные эритроциты, является вполне логичным[85]. Cовместное культивирование ПСК со стромальными клеточными линиями из взрослых кроветворных тканей могло бы обеспечить более подходящие условия для эффективного получения взрослых кроветворных клеток.

Наиболее интересные результаты при дифференцировке через стадию ЭТ были получены H. Lapillonne и соавт. (2010)[83]. 93% полученных эритроидных клеток экспрессировали фетальный гемоглобин HbF и всего 2,3% и 4,3% из общего гемоглобина было эмбриональным (HbGower1/HbGower2). Кинетика связывания CO2 гемоглобином, выделенным из полученных клеток, была практически полностью идентична образцам, полученным из образцов зародышевой крови человека. Кроме того, 4–10% эритроцитов, полученных из иПСК, и 52–66%, полученных из ЭСК, было энуклеировано. Эта же группа исследователей показала, что при введении эритроидных предшественников, полученных из ПСК человека, иммунодефицитным мышам происходит переключение экспрессии глобиновых генов на взрослый тип[12]. Данное наблюдение свидетельствует о том, что полное созревание эритроидных клеток, полученных из ПСК человека, возможно, и для этого, по всей видимости, необходимо создание микроокружения, поддерживающего взрослый гемопоэз[86–87]. При использовании для индукции дифференцировки ПСК клеточной линии, полученной из печени зародыша мыши, было показано, что стромальное микроокружение, поддерживающее дефинитивный гемопоэз in vivo, in vitro активирует переключение синтеза глобинов с набора HbGower1/ HbGower2, характерного для примитивных эритроидных линий, на HbF – гемоглобина дефинитивных эритроцитов зародышевого типа, но не на гемоглобин взрослого типа[65]. Уровень энуклеации был также предельно низким и не превышал 16%, в то время как для CD34+-клеток, выделенных из пуповинной и периферической крови, составлял 25–35% и 60–70%, соответственно, при дифференцировке в этих же условиях. Таким образом, наличие соответствующего стромального микроокружения не является достаточным условием для дифференцировки в энуклеированые эритроидные клетки зрелого типа. При эритроидной дифференцировке иПСК, в отличие от ЭСК, не достигается терминальная стадия процесса[78, 88, 89], хотя иПСК дифференцируются в эндотелиальные клетки и эритробласты[89].

Было показано, что иПСК демонстрируют значительно более высокий уровень апоптоза, ограниченную пролифератичную активность и способность к дифференцировке, в том числе в гемопоэтическом направлении[89]. Другие авторы, напротив, продемонстрировали, что иПСК не отличаются от ЭСК по возможности достигать терминальной стадии эритроидной дифференцировки и экспрессируют набор эритроидных маркеров, идентичный дифференцированным производным ЭСК[65]. Однако всеми отмечено, что иПСК и ЭСК различаются по количеству дифференцированных эритроидных производных по сравнению с изначальным количеством ПСК, использованных для дифференцировки[65, 89]. В то же время, C. Chang с соавт. (2011) при индукции эритроидной дифференцировки иПСК, полученных из различных соматических линий (фибробластов кожи, эмбриональных и фетальных мезенхимных стволовых клеток), показали, что полностью репрограммированные иПСК вне зависимости от возраста доноров и типа соматических клеток подвергаются эритроидной дифференцировке с той же эффективностью, что и ЭСК, а конечным продуктом являются зрелые эритроидные клетки, экспрессирующие (по данным HPLC) соответствующий ЭСК уровень эмбриональных и фетальных глобинов[81]. По нашим собственным наблюдениям иПСК и ЭСК в значительной степени отличаются друг от друга по потенциалу эритроидной дифференцировки (в большей степени, чем различаются между собой различные линии ЭСК). иПСК, полученные из эндотелия пупочной вены, являются полностью репрограммироваными по данным in vitro и in vivo анализов[90, 91]. Однако они демонстрируют высокий пролиферативный потенциал при дифференцировке по эритроидному пути, большую долю эритроидных клеток, по сравнению с клеточными типами других ветвей гемопоэза, высокий выход эритроидных клеток, полученный на единицу иПСК, подвергнутых дифференцировке, по сравнению с различными линиями ЭСК, культивируемыми в лаборатории. Несмотря на полноту репрограммирования по функциональным и молекулярным критериям, по всей видимости, эффекты соматической памяти сохраняются. Для подтверждения данного предположения нами была использована линия ЭСК, содержащая в своём геноме факторы репрограммирования под индуцибельными промоторами (Шутова и соавт., публикация готовится). иПСК, полученные при репрограммировании нейрональных клеток, дифференцированных из данной линии ЭСК, демонстрируют низкий потенциал дифференцировки по гемопоэтическому пути, по сравнению с исходной линией ЭСК, при том что и ЭСК, и иПСК имеют идентичный генетический фон, а иПСК полностью репрограммированы (Филоненко и соавт., публикация готовится). Нейрональная ткань и кровь – производные разных зародышевых листков, и остаточная соматическая память отражается на способности иПСК, полученных из нейрональных клеток, дифференцироваться по гемопоэтическому пути. Таким образом, нет однозначного мнения о пригодности иПСК для получения эритроидных клеток. Хотя весьма привлекательно выглядит перспектива использования иПСК в качестве персонифицированного источника эритроидных клеток для трансплантации, учитывая возможность генетической коррекции дефектов при тяжёлых наследственных заболеваниях, типа анемий.

В животных модельных системах с использованием ПСК мыши были успешно получены как различные типы зрелых клеток крови, так и ГСК, способные к длительной репопуляции костного мозга облучённых мышей. Из иПСК мыши, больной гемоглобинопатией, с использованием методов генетической коррекции были получены нормальные аутологичные ГСК, пригодные для трансплантации и лечения серповидноклеточной анемии[92]. Впоследствии данный подход был применён и для коррекции иПСК человека, полученных из фибробластов пациента, страдающего тем же заболеванием[93]. Однако до сих пор не получено ни ГСК человека, способных к длительной репопуляции костного мозга, ни форменных элементов крови, по качеству и количеству пригодных для трансплантации.

Использованию эритроидных клеток, полученных из ПСК, в клинических целях препятствует также такой немаловажный факт, как довольно длительное время дифференцировки ПСК до состояния эритроидной клетки, занимающее, как правило, более месяца. Альтернативой получению эритроидных клеток из ПСК может служить получение эритроидных клеток из CD34+-клеток, предварительно дифференцированных из ПСК и сохраненных. E. Olivier с соавт. (2012) опубликовали бессывороточный протокол индукции дифференцировки CD34+-клеток, полученных из ЭСК и выделенных из 6–8-недельного желточного мешка, 16–18-недельной печени зародыша, пуповинной и периферической крови[94]. Полученные эритроидные клетки экспрессировали набор глобинов, соответствующий стадии развития СD34+-клеток: HbF из желточного мешка и зародышевой печени, зародышевый и взрослый гемоглобины – из СD34+-пупочной вены, взрослый гемоглобин – из СD34+-клеток периферической крови. CD34+-клетки, полученные из ЭСК, дифференцировались в эритроидные клетки, практически идентичные полученным из желточного мешка и зародышевой печени. Авторы отметили, что пролиферативный потенциал СD34+-клеток из ЭСК был низким, однако, учитывая тот факт, что большинство СD34+-клеток, получаемых при дифференцировке ПСК, не являются кроветворными и погибают в селективных для гемопоэза условиях культивирования, 1%-5% выживших клеток имеют пролиферативный потенциал схожий или даже превышающий потенциал СD34+-клеток желточного мешка и зародышевой печени. Таким образом, была показана возможность эффективной дифференцировки СD34+-клеток, полученных из ЭСК, в эритроидные клетки: 3×105 СD34+-клеток можно получить с 1 лунки 6-луночного планшета ЭСК (3×106 клеток), из которых может быть получено 1010 эритроидных клеток. Таким образом, получение эритроидных клеток ограничено размерами биореактора и, конечно, высокой стоимостью факторов дифференцировки. В связи с этой работой стоит отметить тот факт, что СD34 является маркером ГСК, однако СD34+-клетки, получаемые из ЭСК, имеют сходство с СD34--клетками эмбрионального происхождения и не являются ГСК в прямом смысле этого слова, не репопулируют облучённых животных, а скорее представляют собой более ранние предшественники кроветворных клеток, чем собственно ГСК.

Но СD34+-клетки, получаемые из ЭСК, могут быть хорошим источником эритроцитарной массы. Сейчас перспективным направлением исследований является непосредственная конверсия одних клеточных типов в другие. Так соматические клетки напрямую были репрограммированы в такие дифференцированные клеточные типы, как миобласты[95], макрофаги[96], бета-клетки[97] и нейроны[98]. V.M. Sandler с соавт. (2011) показали, что репрограммирование эмбриональных фибробластов человека в гемопоэтические клетки возможно при слиянии с СD34+-клетками, выделенными из зародышевой печени[99]. Также было показано репрограммирование фибробластов человека в кроветворные предшественники путём эктопической экспрессии OCT4[100]. Прямое репрограммирование дифференцированных клеточных типов в тканеспецифические предшественники открывает перспективы как для развития новых методов клеточной терапии, так и для лучшего понимания механизмов репрограммирования[101, 102], клеточной пластичности in vitro[103] и in vivo[104], а также онтогенеза человека[65].

Заключение

Исследования, проведённые в области гемопоэтической дифференцировки ПСК, позволили получить различные клеточные типы клеток крови, включая клетки эритроидного ряда. Однако до конкретного использования эритроидных клеток, дифференцированных из ПСК, в клинической практике, предстоит ещё решить ряд вопросов, таких как получение чистых популяций взрослых типов энуклеированных эритроцитов; возможность использования фетальных эритроцитов для трансплантации; получение эритроидных клеток без использования неохарактеризованных компонетов и компонентов животного происхождения; возможность применения в клинических целях эритроидных предшественников; использование прямого репрограммирования соматических клеток для получения зрелых эритроцитов и ряд других. В то же время, разработанные модельные системы эритропоэза человека in vitro уже сейчас дают возможность решать фундаментальные проблемы, касающиеся генетики человека, регуляции транскрипции, изучения биохимии и структуры мембран, и других вопросов.

Подняться вверх сайта