Поиск Кабинет

Перспективы использования генной и клеточной терапий для лечения мышечных дистрофий

Гены & Клетки: Том I, №2, 2006 год, стр.: 44-50

 

Авторы

Сукач А.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В обзоре обсуждаются современные подходы к лечению мышечных дистрофий - гетерогенной группы нервномышечных заболеваний, которые проявляются в виде прогрессирующей слабости мышц, а также их частичной потери, что во многих случаях приводит к смерти. Эффективных медикаментозных способов лечения дистрофий в настоящее время нет. Однако существует несколько исследуемых терапевтических вариантов лечения мышечных дистрофий, включающих генную терапию и трансплантацию миогенных клеток-предшественников - клеточную терапию. В статье обсуждаются достижения и трудности на пути внедрения генной терапии в клиническую практику лечения мышечных дистрофий. Особое внимание уделено клеточной терапии, перспективному направлению регенеративной медицины, дающему надежду на излечение многих ранее не излечимых как наследственных, так и приобретенных заболеваний. Обсуждаются потенциальные источники соматических и эмбриональных стволовых/прогениторных клеток человека, которые могут использоваться как в качестве объектов приложения генно-инженерных методов, так и для клеточной терапии мышечных дистрофий. Обсуждаются проблемы, стоящие на пути успешного внедрения в клиническую практику лечения мышечных дистрофий стволовых/проге-ниторных клеток человека.

Введение

Мышечная дистрофия - это группа наследственных заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей мышечной слабостью и потерей мышечных тканей. В настоящее время все дистрофии считаются заболеваниями неизлечимыми. В некоторых случаях болезнь приводит к смерти. Мышечные дистрофии различаются по группам поврежденных мышц, возрасту, при котором начинается болезнь, и скорости ее прогрессирования. Молекулярной причиной, лежащей в основе многих дистрофий, являются мутации в генах, кодирующих компоненты дистрофин-гликопротеинового комплекса, который связывает миофибрильный цитоскелет с внеклеточным матриксом [1-3].

Наиболее часто встречается и наиболее тяжело протекает мышечная дистрофия Дюшенна (МДД). МДД поражает мальчиков с частотой, равной 1 на 3500. Она проявляется в 1-2-летнем возрасте и характеризуется потерей независимого передвижения уже к 10 годам. Больные МДД, как правило, умирают в возрасте 15-25 лет от сердечной или легочной недостаточности вследствие атрофии дыхательных и сердечной мышц. Сходными симптомами и причиной возникновения характеризуется мышечная дистрофия Беккера (МДБ), однако протекает это заболевание в менее тяжелой форме. Обе болезни являются следствием мутаций в гене дистрофина, который локализован на коротком плече Х-хромосомы и является самым большим из известных генов человека. Он содержит 79 экзонов и составляет приблизительно 0,1 % всего генома человека [4-6]. Этот ген кодирует мышечный белок дистрофин с молекулярным весом 427 кДа, который является основным структурным белком, стабилизирующим сарколемму мышечного волокна. Своим N-концом он связывается с актином - главным компонентом внутриклеточного цитоскелета, а С-концом - с группой дистрофин ассоциированных дистро- и саркогликанов -белков сарколеммы, и через них - с основным белком внеклеточного матрикса - ламинином (рис. 1).

Мутации в гене дистрофина приводят к полному отсутствию или сильному снижению уровня дистрофина в случае МДД, либо к образованию частично функционального дист-рофина в случае МДБ. Отсутствие или функциональная недостаточность этого белка приводит к нарушению целостности клеточной мембраны и является причиной запуска процессов дегенерации мышечного волокна. Результатом этого процесса является повышение проницаемости мембран и возникновение в них физических разрывов, что приводит к выходу ферментов из мышц в сыворотку крови (повышение в сыворотке крови активности креатинкиназы является биохимическим маркером МДД и МДБ). На начальных стадиях заболевания дегенерация мышечных волокон компенсируется активной регенерацией фибрилл, благодаря делению и слиянию мышечных сателлитных клеток. Однако с возрастом этот процесс становится менее эффективным, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости [7].

В настоящее время при отсутствии эффективных медикаментозных способов возлагаются большие надежды на использование для лечения мышечных дистрофий методов генной и клеточной терапий. Задачей этих способов лечения является восстановление синтеза дистрофина в мышечных клетках, что достигается либо путем встраивания в клетки нормального гена дистрофина, либо коррекцией мутаций в самом гене или в иРНК [8].

Генная терапия мышечных дистрофий

Основное различие генной и клеточной терапий заключается в способе доставки нормального гена дистрофина в мышечную клетку. Генно-инженерные подходы доставки гена используют, как правило, вирусные векторы. В экспериментах на мышах была продемонстрирована достаточно эффективная и долговременная трансфекция скелетных и сердечной мышц, а также мышц диафрагмы после введения аденовирусных, ретровирусных или лентивирусных векторов, доставляющих функциональный ген дистрофина или минидистрофина [9-12].

Вместе с тем, использование вирусных носителей, особенно в экспериментах in vivo, наталкивается на существенные методические трудности. К ним, например, относятся недостаточная пакующая способность ретровирусов и необходимость наличия клеток-хелперов. Наибольшим препятствием использования вирусных векторов для доставки генетических конструкций является выраженный иммунный ответ реципиента на вирусные антигены. Несмотря на огромный объем работ по модификации генома вируса-носителя и сокращению его размера до минимально возможного, иммунный ответ, тем не менее, сохраняется и делает бессмысленным повторное введение генно-инженерных конструкций. В результате оказывается невозможно достичь такого уровня трансфекции, при котором наступает эффект лечения. Большинство исследователей полагает, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20% [по последним данным - даже 40%) всех мышечных волокон, включая мышцы сердца и диафрагмы. При этом основными критериями эффективности трансфекции являются появление дистрофин-положительных мышечных волокон, нормализация уровня креатинкиназы в сыворотке крови, изменение физиологических параметров [силы мышц и др.).

Существуют также невирусные способы доставки к ДНК гена дистрофина, которые включают в себя баллистическую трансфекцию, методы электропорации [электрошока), введение генетических конструкций в составе липосом, либо упакованных с помощью олигопептидов, молекулярных конъюгатов или полимерных носителей [9, 13, 14]. Эти способы не вызывают такого иммунного ответа, как вирусные векторы, однако способность к трансформации у большинства из них ниже.

Несмотря на довольно интенсивные исследования на животных моделях, до настоящего времени клинические испытания генно-инженерных методов лечения дистрофий на больных людях практически не проводились.

Следует также упомянуть о существовании еще одного подхода к лечению дистрофий - активации синтеза в мышечных клетках репрессированного в процессе онтогенеза аутосомного гомолога гена дистрофина - гена утрофина [15]. Известно, что в эмбриогенезе человека приблизительно до семи недель развития дистрофин не экспрессируется, и его функцию в мышцах выполняет белок утрофин [16]. Между 7 и 19 неделями развития экспрессируются оба белка, после чего происходит замещение мышечного утрофина на дистрофин. Эти белки похожи своими N- и С-концевыми доменами, играющими решающую роль в функции дистрофи-на, тогда как функционально малозначимый центральный rod domain присутствует в утрофине в сильно укороченном виде. Если достичь дерепрессии гена утрофина у больных мышечной дистрофией, то продукт его экспрессии белок утрофин мог бы компенсировать недостаток дистрофина в мышцах [17]. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что in vivo трансфекция mdx мышей геном утрофина приводит к экспрессии этого белка в скелетных мышцах и диафрагме [18-20]. Эти результаты указывают на принципиальную возможность коррекции недостатка дистрофина в мышечных волокнах с помощью утрофина.

Клеточная терапия мышечных дистрофий

Перспективным направлением клеточной терапии мышечных дистрофий представляется трансплантация как стволовых клеток [СК), способных к самовозобновлению и дифференциации во множество клеточных линий организма, так и миогенных прогениторных клеток. При этом рассматриваются возможности использования для трансплантации как взрослых, так и эмбриональных стволовых/прогенитор-ных клеток.

«Взрослые» стволовые клетки. «Взрослые» СК впервые были обнаружены в строме костного мозга [КМ) советским ученым А.Я. Фриденштейном [21]. В настоящее время помимо КМ [22-24] СК обнаружены в большинстве тканей и органов взрослых организмов, включая центральную нервную систему [25-27], кожу [28], сердечную мышцу [29] и скелетную мышцу [30-34]. Для клеточной терапии мышечных дистрофий рассматривается перспектива использования взрослых СК КМ, различных «взрослых» мышечных предшественников, а также клеток пуповинной крови.

Стволовые клетки костного мозга. В КМ, основываясь на адгезивных свойствах in vitro, различают два типа СК: адгезивные стромальные мезенхимальные СК и неадгезивные гемопоэтические СК. Мезенхимальные СК могут дифференцироваться в клетки кости, хряща, жировой ткани и мышц как in vitro, так и in vivo. Миогенные клетки могут быть получены in vitro при действии на адгезивные мезенхимальные клетки 5-азацитидина (5-azacytidine), который активирует мышечный переключатель MyoD [35]. Субпопуляция мезенхимальных СК также была идентифицирована в мо-нонуклеарных клетках КМ - это CD45+/glycophorin+ клетки [36]. После ex vivo экспансии эти мультипотентные взрослые прогениторные клетки могут быть трансплантированы в необлученный организм мышей, где они приживаются и развиваются в гемопоэтические линии, эпителиальные клетки, клетки печени, легких, кишечного эпителия. При введении в раннюю бластоцисту эти клетки дифференцировались в мышечные. И хотя их способность становиться предшественниками скелетной мышцы при внутривенном введении продемонстрирована не была, свойство этих мультипотент-ных взрослых прогениторных клеток активно пролиферировать без очевидного старения и потери мультипотенции делает их привлекательным кандидатом для клеточной терапии.

Более перспективными для клеточной терапии мышечных дистрофий являются неадгезивные гемопоэтические СК, которые, помимо гемопоэза, участвуют в формировании нервной ткани [37, 38], печени [39], сердечной мышцы [29] и скелетных мышц. Было показано, что эти миогенные прогениторы могут мигрировать и участвовать в регенерации поврежденной мышечной ткани после трансплантации КМ [40]. В этом исследовании также было продемонстрировано, что в репарации поврежденных кардиотоксином мышечных клеток могут участвовать не только клетки КМ, введенные непосредственно в мышцу, но также и введенные внутривенно. В обоих случаях донорские клетки сливались с мышечными волокнами реципиента. Эксперименты по внутривенному введению донорских клеток КМ mdx мышам также продемонстрировали, что трансплантированные клетки попадают из кровеносной системы в мышечную ткань и сливаются с волокнами дистрофических мышц mdx мышей [30, 41, 42]. Однако, во всех этих экспериментах репарация дистрофических мышц трансплантированными клетками КМ никогда не превышала 1 %. Это можно объяснить как слабым захватом клеток КМ, так и неспособностью стволовых клеток КМ адекватно реагировать на клеточные сигналы реципиента.

Несмотря на то, что использование клеток КМ для лечения модели МДД у животных оказалось неэффективным, существует мнение некоторых исследователей, что трансплантация КМ для лечения мышечной дистрофии у людей будет более эффективной. Способность СК КМ человека участвовать в репарации мышечных волокон была продемонстрирована Gussoni с соавторами [43]. Они представили иммуногистохимический и FISH анализ мышц мальчика, которому в возрасте 1 года для лечения тяжелого X-связанного иммунодефицита, диагностированного вместе с МДД, была проведена трансплантация КМ. При этом, в 12 лет МДД имела умеренное протекание, а в мышцах больного через 13 лет после трансплантации было обнаружено присутствие диплоидных донорских ядер [0,5-0,9% мышечных волокон), что указывает на способность экзогенных клеток КМ человека сливаться со скелетными мышечными волокнами реципиента и сохраняться на протяжении, по крайней мере, 13 лет.

Таким образом, несмотря на возможность взрослых ге-мопоэтических СК сливаться с дистрофическими скелетными мышечными волокнами, частота таких случаев слишком низка для того, чтобы быть эффективным способом лечения мышечных дистрофий.

Клетки пуповинной крови. Очень близки по свойствам клеткам КМ клетки пуповинной крови. В их составе также присутствуют как кроветворные, так и мезенхимальные СК [44]. Применение этих клеток лишено морально-этических ограничений, их легко получать, количество СК в пуповинной крови значительно больше, пролиферативный потенциал выше, они не отягощены грузом генетических мутаций, накопленных взрослыми соматическими СК КМ. Клетки пуповинной крови менее иммунологически зрелые. Эксперименты, проведенные на мышах [45], продемонстрировали, что миогенные прогениторы [предшественники) присутствуют в пуповинной крови человека и способны мигрировать и дифференцироваться в миоциты. Однако, как и в случае СК КМ, до сих пор отсутствуют доказательства эффективного терапевтического действия клеток пуповинной крови при их использовании для лечения мышечных дистрофий. Как и для всех остальных потенциальных источников клеток для лечения мышечных дистрофий, существуют методические проблемы, связанные с выделением из пуповинной крови популяции миогенных предшественников и их дальнейшей экспансией в условиях in vitro.

Мышечные стволовые клетки. Первыми идентифицированными «взрослыми» мышечными прогениторными клетками были сателлитные клетки [СатК) мышц - коммити-рованные, покоящиеся мышечные предшественники, которые располагаются между сарколеммой мышечных волокон и их базальной мембраной [46, 47]. Активированные СатК делятся на дочерние клетки и дифференцируются в одноядерные миобласты, которые затем либо сливаются между собой и образуют новые мышечные волокна, либо сливаются с существующими мышечными волокнами [48, 49] [рис. 2). Результаты исследований роста мышц и их регенерации дают основание предположить, что активированные СатК, возможно, пополняют свой пул путем асимметричного деления [50]. Мышечные СатК возникают в процессе позднего эмбрионального миогенеза и, вероятно, отличаются по происхождению от других миогенных предшественников. Есть несколько гипотез, объясняющих их происхождение. В частности, было обнаружено, что СатК развиваются из спинной аорты эмбрионов c-met-/- мышей [51]. Скорее всего, мышечные СатК представляют собой субпопуляцию не дифференцировавшихся в процессе эмбрионального миогенеза миобластов, которые остались связанными с поверхностью развивающихся мышечных волокон [см. рис. 2). СатК гете-рогенны по экспрессии CD34 и myf-5. Также существует популяция этих клеток, не экспрессирующая никаких маркеров [52]. Сразу после активации СатК быстро вступают в клеточный цикл и проходят миогенез, аналогичный эмбриональной миогенной программе. In vivo активированные СатК ограничены мышечной линией, однако in vitro помимо мышц показано их участие в адипо- и остеогенезе [53].

СатК были одним из первых типов клеток, используемых в клеточной терапии мышечных дистрофий. СатК, которые выращиваются in vitro, представляют собой мононуклеар-ные клетки, коммитированные по миогенному пути [миоб-ласты). Эксперименты по внутримышечной трансплантации миобластов, изолированных из мышей дикого типа, mdx мышам продемонстрировали экспрессию дистрофина in vivo [55, 56]. Эти исследования послужили основанием проведения клинических испытаний миобластов с целью лечения МДД [56-60]. Для этого донорские СатК были изолированы в результате биопсии мышц у близких родственников больных детей. Затем эти клетки выращивались в условиях in vitro, после чего 80-100 миллионов донорских миобластов было введено в мышцы детей путем множественных инъекций. Контрлатеральные мышцы были инъецированы как контроль плацебо. Однако, иммуногистохимические и RT-PCR исследования мышц больных, которые проводились на протяжении года, показали, что трансплантация миобластов таким способом была неэффективна. Несмотря на то, что пересаженные миобласты действительно сохранялись и продуцировали дистрофин в мышечных волокнах пациентов с МДД, частота, при которой это встречалось, была очень низкой (<1%). Поэтому неудивительно, что не было зарегистрировано никакого функционального или клинического выздоровления. Эксперименты на мышах по использованию миобластов для лечения МДД также показали, что уже через 24 часа после трансплантации 90% гетерологичных миобластов погибает или исчезает из места трансплантации, 5% находятся в покоящемся состоянии, 5% сливаются с пораженными мышечными волокнами, но только в половине из них (2,5%) наблюдается синтез дистрофина [62, 63]. При этом трансплантация миобластов характеризуется минимальной миграцией клеток после инъекции и иммунным отторжением [64, 65], которое является одной из причин низкой степени выживания клеток. После внутримышечной инъекции пациентам с МДД высокого количества миобластов, полученных у здоровых близких родственников, правильно подобранная иммуносупрессия позволяет уже через месяц увеличить количество мышечных волокон, синтезирующих дистрофин до 10% [66]. Эти исследования указывают, с одной стороны, на важность использования адекватной иммуносупрессии при трансплантации миобластов, а с другой - на необходимость оптимизации метода трансплантации клеток, что включает наряду с определением оптимального количества клеток, частоту их введения и место трансплантации.

Следует заметить, что, по мнению некоторых исследователей, способность мышцы восстанавливаться после повреждения является заключительным этапом миогенеза, начало которого закладывается в процессе эмбриогенеза и включает в себя стадию индукции миогенных регуляторных факторов и позиционных стимулов, диктующих направление клеточной дифференциации, пролиферацию и окончательную дифференциацию во взрослую мышцу [67], что указывает на ограниченный миогенный потенциал мышечных СатК. Поэтому, несмотря на достаточно активные исследования, направленные на оптимизацию метода трансплантации миобластов для лечения мышечных дистрофий, многие исследователи все же склоняются к использованию для этих целей более примитивных предшественников мышечных клеток. Они справедливо считают, что эти миогенные СК будут не только сливаться с существующими мышечными волокнами реципиента, но также будут способны пролиферировать, дифференцироваться в нужном направлении и формировать новые миосимпласты. Как полагают, более примитивными мышечными предшественниками по сравнению с СатК являются мультипотентные мышечные стволовые клетки (ММСК] [34, 68-70], мышечные SP клетки [30, 31 ], мышечные СК ге-мопоэтического происхождения, и СК мышц, устойчивые к большим дозам радиации.

Мультипотентные мышечные стволовые клетки. ММСК экспрессируют как миогенные маркеры (положительные на desmin, myogenin и myoD), так и маркеры стволовых клеток (flk-1, sca-1, CD34). Они не экспрессируют c-kit, CD45 или другие маркеры клеток крови. ММСК могут быть экс-пандированы in vitro на протяжении более 30 пассажей без изменения кариотипа, могут быть генетически модифицированы для экспрессии минидистрофина и р-галактозидазы, могут дифференцироваться в клетки мышечной, нервной и эндотелиальной тканей in vitro и in vivo [70]. ММСК обладают способностью заселять КМ и восстанавливать кроветворение у смертельно облученных mdx мышей при введении внутривенно. Они способны попадать в дистрофические мышцы и участвовать в их регенерации [34]. Таким образом, клоны ММСК могут быть экспандированы с сохранением миогенного потенциала после гематопоэтической дифференциации. Также была показана способность этих клеток мигрировать из кровотока в поврежденные мышцы после их внутриартериальной инъекции mdx мышам [71].

SP (side population) клетки. Другой субпопуляцией взрослых мышечных предшественников, обнаруженных в мышцах и в КМ, являются так называемые SP (side population) клетки [30, 31]. Эта популяция мультипотентных клеток характеризуется тем, что они активно вытесняют краситель Hoechst 33342, благодаря активности на клеточной поверхности ABC переносчика ABCG2 [72, 73]. Мышечные SP клетки негативны на c-kit и CD45. Значительная часть SP клеток положительна на CD34 [30]. При внутривенной трансплантации смертельно облученным самкам mdx мышей мышечные SP клетки способны восстанавливать гемо-поэз [30]. При этом на 17-28 день после трансплантации донор-производные (Y+ ядра) дистрофин-положительные мышечные волокна были найдены у 9% волокон mdx мышей. Следует заметить, что мышечные SP клетки отличаются еще и тем, что могут быть изолированы из мышц Pax 7-дефицитных мышей, которые не имеют миогенных СатК [74], что указывает на уникальность этой популяции клеток. При этом нефракционированные мышечные SP клетки могут образовывать как скелетные мышечные волокна, так и СатК после внутримышечной инъекции. Также они способны становиться мышечными клетками при совместном культивировании с первичными миобластами [33].

СК мышц, устойчивые к большим дозам радиации. Известна также популяция клеток, которые вносят вклад в репарацию мышц после больших доз радиации [32]. Облучение большими дозами (18 Gy) блокирует регенерацию в мышцах mdx мышей, ингибируя митоз в пролиферирующих миобластных/сателлитных клетках. Однако дальнейшее введение myotoxin notexin (разрушает зрелые мышечные волокна, но не затрагивает мононуклеарные клетки, включая сателлитные) приводит к регенерации мышц. Анализ этого явления у нормальных и дистрофических мышей после облучения показал высокий уровень пролиферации мышечных клеток-предшественников. Они, вероятно, являются резидентными стволовыми клетками.

Следует заметить, что перспектива использования взрослых СК для клеточной терапии вообще и мышечных дистрофий в частности имеет достаточно много критиков. В частности, многими исследователями подвергается серьезным сомнениям сама возможность взрослых СК к трансдифференциации [75-77]. Так, исследование, проведенное группой Т. Брауна, противоречит мнению о том, что взрослые мезенхимальные СК КМ или локальные СК участвуют в восстановлении сердечных и скелетных мышц путем трансдифференциации в мышечные клетки. Исследователи продемонстрировали, что все случаи, в которых функциональные клетки скелетной мышцы вырастали из мезенхимальных СК, на самом деле основывались на слиянии мезенхимальных СК с уже дифференцированными мышечными клетками [77]. Сливаясь с клетками восстанавливаемой ткани, эти клетки, скорее всего, только имитируют механизм трансдифференциации, что указывает на их ограниченную способность восстанавливать поврежденные мышцы. Следует отметить, что в процессе постнатального развития наблюдается снижение способности СК к хоумингу [78]. Некоторые исследователи полагают, что в ДНК взрослых СК накапливаются мутации, и ее информация постепенно деградирует. Другие указывают на возможность накопления мутаций в ДНК митохондрий, в которых отсутствует механизм восстановления. Существует также мнение о том, что СК стареют и утрачивают способность к самовозобновлению. Культивирование СК in vitro проводится в условиях, сильно отличающихся от условий in vivo, что может приводить к существенным изменениям как генетической программы этих клеток, так и их реакции на влияние внешних факторов и регуляторов [подобных ростовым факторам и цитокинам). Все эти изменения, происходящие как в процессе постнатального развития СК, так и в процессе культивирования in vitro, могут, в конечном итоге, приводить к ограничению их способности к миграции, самовозобновлению, пролиферации, дифференциации, а также к неадекватной реакции на клеточные сигналы микроокружения в организме реципиента. К тому же в настоящее время нет эффективных методов выращивания «взрослых» СК - в культуре они растут чрезвычайно медленно. Одним из препятствий клинического применения «взрослых» СК также является малочисленность их популяции в тканях и трудности выделения.

Эмбриональные миогенные предшественники

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Источником мышечных прогениторов для клеточной терапии мышечных дистрофий могут также служить ЭСК - клетки внутренней клеточной массы бластоцисты человека [79, 80]. Они тоти-потентны и характеризуются свойством самовозобновления. Эти клетки могут быть экспандированы in vitro на протяжении длительного периода времени, оставаясь в недифференцированном состоянии. Теоретически, ЭСК являются неограниченным источником клеток, способных дифференцироваться во все типы клеток, включая и мышечные [81]. Однако, длительная экспансия ЭСК достаточно сложная и длительная процедура, требующая постоянного присутствия стромальных [фидерных) клеток, дорогостоящих цитокинов [EGF, FGF, SCF, LIF, IL-6,), а также своевременной дезагрегации и пересева клеток. Невыполнение хотя бы одного из перечисленных условий приводит к уменьшению СК в культуре за счет их дифференциации или гибели. С возрастанием срока культивирования ЭСК возрастает вероятность возникновения генетических мутаций, которые будут накапливаться в последующих клеточных поколениях. Помимо этого, в настоящий момент нет точного понимания молекулярных путей, лежащих в основе формирования органов, и не определены факторы, которые необходимы и достаточны для формирования специфических типов клеток. В случае клинического применения ЭСК существует потенциальная опасность образования нежелательных клеток, тканей и даже формирования тератом. Эта опасность проистекает, главным образом, из плюрипотентности ЭСК, и их способности образовывать все клетки эктодермы, энтодермы и мезодермы. Для широкого применения ЭСК в клинической практике предстоит решить ряд достаточно сложных задач: разработать методы, позволяющие получать достаточное количество направленно дифференцированных в мышечные предшественники ЭСК, а также способы устранения плю-рипотентных и частично дифференцированных клеток, которые могут вносить вклад в озлокачествление тканей.

ЭСК цитогибридов. Другим источником мышечных предшественников могут быть ЭСК, полученные в результате межвидовой цитогибридизации [82], которая позволяет получать гибридные бластоцисты [например, человека и свиньи, человека и коровы). Межвидовая цитогибридизация позволяет получать ЭСК с геномом человека без использования фетальных тканей человека. Этот метод теоретически позволяет получать нелимитированные количества ЭСК с геномом реципиента и далее их использовать для трансплантации без риска иммунных осложнений, избавляя при этом от морально-этических проблем. Однако существует ряд научных проблем, стоящих на пути терапевтического использования цитогибридов. Во первых, стареющие пост-митотические клетки характеризуются накоплением генетических ошибок и мутаций. Большой проблемой также является относительно неэффективное перепрограммирование донорского ядра обратно в плюрипотентное состояние [83].

Таким образом, СК, полученные в результате межвидовой гибридизации эмбрионов, могут характеризоваться большим количеством мутаций и ошибок [не говоря уже о наследственных заболеваниях), что способно лишить их эффективности, или, хуже того, стать причиной их онкологической трансформации. Необходимо заметить, что правовые и этические аспекты в области межвидовой гибридизации эмбрионов все еще остаются непроработанными.

Мышечные предшественники эмбрионов ранних сроков развития. Потенциальным источником клеток для клеточной терапии мышечных дистрофий являются миоген-ные предшественники, полученные из абортивных эмбрионов человека ранних сроков гестации. Эти клетки обладают существенным недостатком, ограничивающим их клиническое использование - это морально-этические проблемы, связанные с их получением. Наряду с этим, они имеют достаточно много преимуществ перед постнатальными миоген-ными предшественниками. Во-первых, миогенные клетки эмбрионов человека включают в себя, помимо окончательно дифференцированных, вышедших из клеточного цикла и активно формирующих мышечные волокна миоцитов, мезо-дермальные СК и коммитированные в мышечном направлении миобласты, которые характеризуются высокой степенью самовозобновления, пролиферации, миграции и пластичности [см. рис. 2). Во-вторых, миогенные предшественники эмбрионов человека представляют собой достаточно гетерогенную по происхождению клеточную популяцию, что позволяет надеяться на их способность формировать в организме реципиента не только волокна скелетных мышц, но также и клетки, например, сердечной поперечно-полосатой мышечной ткани. В-третьих, эмбрионы человека ранних сроков гестации характеризуются практически полным отсутствием на клеточной поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости. Это определяет их низкую иммуноген-ность после трансплантации. И хотя, на наш взгляд, нельзя полностью отказываться от иммуносупрессии при трансплантации этих клеток, она может быть минимальной как по времени, так и по интенсивности. В-четвертых, эмбриональные стволовые и прогениторные клетки характеризуются отсутствием приобретенных генетических нарушений.

Мезангиобласты - это популяция мезодермальных стволовых клеток, выстилающих поверхность некоторых эмбриональных сосудов [51, 84]. Эти клетки являются еще одним потенциальным источником взрослых СК для клеточной терапии мышечных дистрофий. Они экспрессируют маркеры ангиобластов, такие как Sca-1, Flk-1, и CD34, а также гены, типичные для мезодермы, включая рецепторы и сигнальные молекулы классических индукторов мезодермы, такие, как BMP, Wnt и Notch. Мезангиобласты могут быть экспандированы in vitro, при действии на них цитокинов или при сокультивировании с другими клетками мезодермального происхождения [84] способны дифференцироваться в большинство тканей, имеющих мезодермальное происхождение, включая кровь, хрящ, кость, гладкие скелетные и сердечные мышцы. Мезангиобласты обладают удивительной способностью к хоумингу в поврежденную мышечную ткань и активно восстанавливают поврежденные мышцы [85-87]. Внутриар-териальное введение мезангиобластов, меченных ленти-ви-русным вектором, экспрессирующим a-саркогликан, мышам с моделью тазово-поясничной мышечной дистрофии [85] продемонстрировало, что они накапливаются в капиллярах и затем мигрируют в области мышечной недостаточности или воспаления, и, в конечном итоге, исправляют морфологически и функционально дистрофические мышцы [85]. Многократные внутриартериальные трансплантации мезангиобластов привели к образованию через 4 месяца после введения более чем 50% положительных на a-саркогликан мышечных волокон. Помимо нового потенциального источника СК для лечения мышечных дистрофий, эти исследования показали перспективность внутриартериального способа введения клеток при клеточной терапии.

Таким образом, следует надеяться, что СК и мышечные клетки-предшественники эмбрионов человека ранних сроков гестации при попадании в поврежденные мышечные ткани реципиента будут адекватно реагировать на клеточные сигналы микроокружения, активно пролиферировать и дифференцироваться, формируя здоровые вторичные мышечные волокна, а также сливаться с уже существующими волокнами, способствуя их репарации.

Заключение

Исходя из литературных данных, можно заключить, что в настоящее время наблюдается параллельное развитие двух очень перспективных подходов лечения мышечных дистрофий - генной и клеточной терапий.

Генная терапия имеет хорошие перспективы для лечения широкого спектра заболеваний, в том числе и мышечных дистрофий. Однако ее эффективность в настоящее время находится на достаточно низком уровне. При этом, основной проблемой генной терапии является проблема доставки определенного гена в нужную клетку. Можно надеяться, что решить эту проблему помогут исследования, направленные на использование в качестве «переносчика» необходимых генов стволовых/прогениторных клеток человека. Следует полагать, что успехи в изучении СК позволят выйти технологиям генной терапии на новый уровень, которых обеспечит качественный скачок в лечении многих наследственных заболеваний человека, в том числе и мышечных дистрофий.

На сегодняшний день существует достаточно обширный круг потенциальных источников соматических или эмбриональных стволовых/прогениторных клеток человека, которые могут использоваться как в качестве объектов приложения генно-инженерных методов, так и для клеточной терапии мышечных дистрофий. Однако для их широкого внедрения в клиническую практику необходимо решить ряд проблем как морально-этического [касательно эмбриональных клеток человека), так и методического плана.

Для успешного применения методов клеточной терапии с целью лечения мышечных дистрофий необходимо:

1. Определить оптимальный тип донорских клеток, которые:

а) являются ранними мышечными предшественниками и обладают способностью к образованию как мышечных волокон, так и клеток сердечной мышечной ткани;

б) обладают высокой степенью пролиферации, пластичности и способностью к самовозобновлению;

в) способны адекватно реагировать на сигналы микроокружения реципиента;

г) способны направленно мигрировать в мышечную ткань и легко в нее встраиваться [интегрироваться);

д) обладают низкой степенью иммунореактивности [иммунологически толерантны) и хорошо приживаются в тканях реципиента.

2. Разработать эффективные, максимально приближающиеся к условиям in vivo методы культивирования и экспансии клеток in vitro.

3. Определить наиболее предпочтительный способ введения клеток пациенту [внутримышечный, внутривенный либо внутриартериальный).

4. Определить оптимальное количество клеток для одноразовой трансплантации и оптимальную частоту трансплантаций.

5. Установить молекулярные механизмы, способствующие миграции донорских клеток в поврежденные мышечные ткани, их включению в эти ткани и эффективному приживлению и функционированию.

6. Установить оптимальные терапевтические процедуры, направленные на максимальное снижение риска отторжения трансплантированных клеток.

Решение этих вопросов помимо определения оптимального источника клеток и стратегии их введения в каждом конкретном случае, позволит определить проведение оптимальных терапевтических процедур до и после трансплантации клеток. Это, с одной стороны, позволит избежать отторжения трансплантированных клеток [иммуносупрессия), а с другой - обеспечит эффективную направленную миграцию клеток с их последующей интеграцией в необходимые ткани и их трофическую поддержку [введение определенных ростовых факторов, цитокинов, хемокинов).

Подняться вверх сайта