Поиск Кабинет

Персонализированная клеточная терапия в офтальмологии (II): цитокиновый профиль аутогенного клеточного продукта

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 49-53

 

Авторы

Аветисов С.Э., Суббот А.М., Антохин А.И., Каспарова Е.А., Каспаров А.А., Павлюк А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследовано содержание основных про- и противовоспалительных цитокинов и факторов роста в аутогенных клеточных продуктах, предназначенных для проведения персонализированной клеточной терапии при патологии заднего отдела роговицы. Установлено, что в них присутствуют вещества, обусловливающие эффективность клеточной терапии. Определено влияние условий процессинга клеток при получении клеточного продукта на концентрацию в нем цитокинов и факторов роста. Показано, что цитокиновый профиль клеточного препарата складывается из предсуществующих в сыворотке и плазме крови веществ (TGFβ1, TGFβ2, PDGF-AB, VEGF, ИЛ-4, ИФγ), и компонентов, концентрация которых увеличивается в результате процессинга клеточного препарата – инкубации клеток в течение 4 ч при 37°С (ИЛ-8) и стимуляции их комплексом полиадениловойполиуридиловой кислот (ИЛ-1, -6, ИФ-α и ФНО-α). Проведенная оценка цитокинового профиля клеточного продукта раскрывает механизмы реализации лечебного эффекта персонализированной клеточной терапии.

Для лечения некоторых заболеваний роговицы, нами предложен метод персонализированной клеточной терапии (ПКТ), заключающийся в инкубации крови пациента со стимулятором синтеза цитокинов и факторов роста (комплексом полиадениловойполиуридиловой кислот, полиА:У), сборе сыворотки со взвешенными в ней лейкоцитами и введении полученного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза [1].

Ранняя послеоперационная буллезная кератопатия и эндотелиальные формы офтальмогерпеса являются одними из наиболее тяжелых поражений роговицы и нередко приводят к слепоте. Несмотря на применение современных лекарственных средств и микрохирургических методов, лечение этих заболеваний часто не дает удовлетворительных результатов [2]. Регенеративная медицина, включающая клеточные технологии, – многообещающее и активно развивающееся направление современной медицины, которое может получить широкое распространение в клинической офтальмологии. Результаты использования ПКТ при лечении перечисленных тяжелых заболеваний роговицы показали её высокую клиническую эффективность [3].

Принято считать, что механизмами, обусловливающими эффективность любой клеточной терапии, являются: а) заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая её функцию; б) трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и (или) модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [4, 5].

На сегодняшний день нет убедительных экспериментальных доказательств клеточной пластичности, обеспечивающей замещение поврежденных специализированных клеточных популяций через трансдифференцировку, поэтому заместительный механизм действия клеточной терапии можно с уверенностью рассматривать только в контексте лечения гематологических заболеваний [6].

В то же время в многочисленных исследованиях показано, что лечебный эффект клеточной терапии обеспечивается выработкой КП факторов роста, цитокинов, хемокинов, простагландинов, нейромедиаторов и других биологичестки активных веществ, которые инициируют в патологическом очаге процессы ангиогенеза, ремоделирования матрикса, активации резидентных клеток-предшественниц и осуществляют противовоспалительное и антиапоптотическое действие [7–9].

Роль цитокинов в физиологических, патологических и регенеративных процессах в тканях глаза активно исследуется [10–14]. Эти вещества применяют для лечения заболеваний роговицы, примерами могут служить препараты интерферона и комплексные цитокиновые препараты [15–17]. За рубежом широко используют технологию лечения роговичных дефектов и синдрома «сухого глаза» с помощью дериватов крови – сыворотки или плазмы. Полагают, что в этом случае лечебный эффект достигается за счет наличия в этих продуктах растворимых биологически активных субстанций [18, 19].

Терапевтический эффект при использовании клеток фетальной роговицы человека в лечении буллезной кератопатии также связывают со стимуляцией вводимыми клетками интерфероногенеза и синтеза ИЛ-1 клетками тканевой ниши [20].

Для каждого конкретного метода клеточной терапии вопрос о механизмах лечебного действия требует отдельного изучения, особенно, когда клетки при получении КП проходят стадию процессинга. При приготовлении клеточного препарата для ПКТ используется стиимулятор клеток – синтетический полиА:У, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3 и 7 типа (TLR3 и TLR7) [21]. Кроме того, на клетки оказывают влияние и другие процессы – свертывание крови, имитирующее течение раневого процесса, температура 37°С, увеличивающая интенсивность синтетических процессов. Всё это непосредственно влияет на функциональную активность клеток и, как следствие, на цитокиновый спектр КП.

В связи с вышеизложенным, целью исследования стало определение в составе КП, используемого нами для лечения болезней глаз, биологически активных веществ – цитокинов и факторов роста, которые могут играть центральную роль в механизмах реализации его терапевтических эффектов, а также оценка влияния условий получения КП на концентрацию этих веществ.

Материал и методы

В исследование были включены 35 человек. Протокол исследования был одобрен этическими комитетами РНИМУ им. Пирогова и НИИ глазных болезней РАМН, у всех принявших участие в исследовании людей было получено добровольное письменное информированное согласие.

Получение КП и контрольных образцов. Для получения КП 200 ЕД Полудана (Верофарм, Россия), представляющего собой комплекс полиА:У, растворяли в 2,0 мл воды для инъекций и переносили в стерильную пробирку на 10 мл. Из локтевой вены донора в пробирку с раствором Полудана набирали 8 мл крови, закрытую пробирку инкубировали 4 ч при температуре 37°С, затем центрифугировали в течение 10 мин. при 3000 об/мин (центрифуга Elmi СМ-6М (Elmi, Латвия)). Взвесь клеток в сыворотке собирали, обводя иглой шприца вокруг фибринового сгустка, и переносили полученную клеточную суспензию в стерильную пробирку.

Влияние полиА:У на цитокиновый спектр КП оценивали, сравнивая его с цитокиновым спектром «контрольного» КП, инкубированного в тех же условиях (4 ч при 37°С), но без добавления стимулятора. Влияние процессов коагуляции крови на концентрацию цитокинов выясняли, анализируя пробы плазмы и сыворотки крови, собранные через 45 мин после взятия крови.

Для изучения вклада синтетической активности лейкоцитов в формирование цитокинового профиля КП определяли концентрацию цитокинов в образцах с лизированными клетками (3 млн/мл). Лизис клеток проводили путем двукратного замораживанияоттаивания. Исследовали лизаты стимулированных лейкоцитов КП, лизаты нестимулированных лейкоцитов «контрольного» КП и лизаты свежевыделенных лейкоцитов в плазме.

Определение концентрации цитокинов и факторов роста. В сывороточной части КП и «контрольного» КП, плазме и сыворотке крови определяли концентрацию провоспалительных (ИЛ-1, -2, -6, -8, ФНО-α, ИФα, -γ), противовоспалительных (ИЛ-4, -10) и иммунорегуляторных (ИЛ-17) цитокинов, а также факторов роста, регулирующих функции клеток «эндотелия» роговицы (TGFβ1, TGFβ2, bFGF, PDGF-AB, VEGF). В образцах клеточных лизатов оценивали концентрацию ИЛ–8 и ФНО-α.

Определение проводили с использованием наборов реагентов для иммуноферментного анализа согласно протоколам фирм-производителей: для ИЛ-1, -2, -4, -6, -8, -10, -17, ИФα, -γ, ФНО-α, VEGF – ЗАО «Вектор-Бест», Россия; для TGFβ1 и TGFβ2 – «Bender Medsystems», Австрия; для bFGF – «Biosourse», США; для PDGF-AB – «R&D systems », Великобритания. До момента исследования все образцы хранили при температуре -20°С. Образцы клеточных лизатов перед анализом тщательно перемешивали и центрифугировали для осаждения детрита. Для исключения артефактов измерения проводили в двух лунках планшета для каждой пробы. Планшеты промывали с использованием автоматического промывателя Labsystems Autowash II (Thermo, Финляндия). Результаты регистрировали на иммуноферментном анализаторе Униплан, (Пикон, Россия) при длине волны 450 нм.

Статистический анализ. Для статистического анализа данных использовали программу BioStat (AnalystSoft, Канада). Полученные данные проверяли на нормальность распределения с использованием критериев Шапиро – Уилка, Колмогорова – Смирнова и Д'Агостино. При нормальном распределении данных для оценки различий средних значений в выборках до и после воздействия оцениваемого фактора использовали парный двухвыборочный тест Стьюдента. При отклонении распределения от нормального применяли непараметрический критерий Уилкоксона для парных сравнений. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты определения цитокинов и факторов роста представлены в табл. 1 и 2.

Как видно из табл. 1, в сывороточной части КП присутствовали в высокой концентрации цитокины ФНО-α, ИЛ-1,-6,-8, ИФα, уровни ИЛ-4, ИФγ и TGFβ1, TGFβ2, PDGF-AB, VEGF были в пределах тех, которые регистрировались в сыворотке. В сывороточной части «контрольного» КП присутствовала высокая концентрация ИЛ-8, уровни ИЛ-4, ИФγ, TGFβ1, TGFβ2, PDGF-AB, VEGF находились также в пределах сывороточных, концентрации ИЛ-1, -6 и ФНО-α были на минимальном уровне, содержание ИФα было меньше, чем в сывороточной части КП. Таким образом, добавление стимулятора полиА:У при получении КП приводило к TLR-опосредованной активации клеток и синтезу провоспалительных цитокинов ФНО-α, ИЛ-1,-6 и ИФ-α. На уровень ИЛ-4, -8, ИФγ и факторов роста добавление стимулятора не влияло.

Из табл. 2 видно, что в свежеполученной плазме и сыворотке крови присутствовали такие же концентрации ИФγ и ИЛ-4 и факторов роста TGFβ1, TGFβ2, PDGF-AB, VEGF, как и в сывороточной части «контрольного» КП; концентрации ИЛ-8, ФНО-α, bFGF находились на минимальном уровне; ИЛ-1, -6 – не определялись.

Сыворотка отличалась от плазмы по своему цитокиновому составу: концентрации ИФα, ИЛ-8, TGFβ2, PDGF-AB, VEGF были больше, чем в плазме, концентрации ИЛ-4 и ИФγ – меньше. Однако, такие различия находятся в пределах среднестатистических показателей для жителей России.

ИЛ-2, -10, -17 не определялись ни в КП, ни в контрольных образцах. Вероятно, в данных условиях было недостаточно времени или стимулирующих факторов для синтеза этих цитокинов.

В образцах лизатов лейкоцитов в плазме концентрация ИЛ-8 была выше, чем в бесклеточной плазме, из чего можно заключить, что этот цитокин присутствует в депонированной форме в лейкоцитах периферической крови. В сывороточной части КП концентрация ИЛ-8 была выше, чем в лизате лейкоцитов в плазме. Это значит, что его наличие в КП опосредовано не только дегрануляцией депонированного ИЛ-8, но и синтезом этого цитокина de novo во время инкубации. Концентрация ИЛ-8 в лизате стимулированных лейкоцитов КП не отличалась от концентрации в лизате нестимулированных лейкоцитов «контрольного» КП. Следовательно, стимуляция клеток с помощью полиА:У не влияет на синтез лейкоцитами ИЛ-8, и увеличение его концентрации инициируется другими условиями процессинга. Различия в концентрации ИЛ-8 между образцами сывороточной части КП и лизатом лейкоцитов КП отсутствовали, что свидетельствует о том, что через 4 ч инкубации синтез этого цитокина практически завершен.

В образцах лизатов лейкоцитов в плазме присутствовал ФНО-α, его концентрация была выше, чем в бесклеточной плазме. Следовательно, ФНО-α на момент лизиса был депонирован в лейкоцитах. Во время процессинга происходило его внутриклеточное накопление за счет синтеза во время инкубации, о чем свидетельствует его повышенная концентрация в лизатах лейкоцитов КП (как стимулированных, так и нестимулированных). Отсутствие достоверных концентрационных различий в образцах лизатов стимулированных и нестимулированных лейкоцтов в КП указывает на то, что синтез ФНО-α, также как и ИЛ-8 был инициирован условиями процессинга, а не стимуляцией полиА:У.

Однако следует отметить, что присутствие стимулятора обеспечивало высвобождение из клеток вновь синтезированного ФНО-α. Это подтверждается тем, что в сывороточной части КП концентрация ФНО-α была значительно выше, чем в сывороточной части «контрольного» КП. Различия в концентрации ФНО-α между сывороточной частью и лизатом стимулированных лейкоцитов КП отсутствовали, то есть через 4 ч инкубации со стимулятором синтез клетками этого цитокина и его выделение завершались.

Таким образом, механизм появления ИЛ-8 и ФНО-α в КП следующий: эти цитокины выделяются из внутриклеточных депо за время инкубации, кроме того, часть синтезируется de novo, однако на уровень их синтеза полиА:У не влияет, он усиливает высвобождение из клеток синтезированного ФНО-α.

Из анализа полученных результатов можно заключить, что цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:

1) выделенных в ответ на стимуляцию полиА:У (ИЛ-1,-6, ФНО-α, ИФ-α);

2) спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8);

3) «предсуществующих» в плазме и сыворотке крови (TGF-β1, PDGF-AB, TGF-β2, VEGF, ИФ-γ и ИЛ-4).

Наличие широкого спектра цитокинов и факторов роста в составе сывороточной части КП позволяет рассматривать её в качестве отдельного терапевтического инструмента. Мы обозначили эту часть клеточного препарата как ПАС – процессированная аутологичная сыворотка. Она используется в качестве самостоятельного терапевтического препарата для лечения болезней роговицы.

Концентрации TGFβ1, PDGF-AB и VEGF в КП на порядок превышают их физиологические концентрации в водянистой влаге передней камеры глаза, обеспечивающие в норме нерепликативное состояние заднего «эндотелия» роговицы. В экспериментальных исследованиях in vitro указанные факторы роста применяют для стимуляции пролиферации «эндотелия» роговицы в концентрациях, превышающих физиологические [22–25]. При проведении интраоперационной ПКТ водянистая влага передней камеры глаза заменяется на КП, содержащий лейкоциты и процессированную аутологичную сыворотку. Тем самым изменяется микроокружение «эндотелиоцитов» и обеспечивается цитопротективный и регенеративный эффект. Можно предположить, что в данном случае in vivo наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGFβ1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного bFGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения.

Значение провоспалительных цитокинов в патогенезе заболеваний роговицы традиционно связывают с развитием воспалительных реакций, так как их уровень во влаге передней камеры неизбежно повышается при развитии патологического процесса [26].

Однако повышение содержания провоспалительных цитокинов может быть и элементом регенерации. Так, ФНО-α регулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез bFGF эндотелиоцитами после деструкции роговицы [27, 28]. Провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, чем, предположительно, стимулируют пролиферативную активность «эндотелия» роговицы, снимая один из механизмов ингибирования митоза [29]. Все вышеозначенные процессы приводят к наблюдаемому эффекту – восстановлению барьерной функции «эндотелия» роговицы. Установлено, что лейкоциты, введенные в переднюю камеру глаза, находятся там в течение недели [30]. После интракамеральной инъекции КП начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов продолжаются in vivo, таким образом обеспечивается пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ, обусловливающих клинический эффект ПКТ.

Результаты определения цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис. 1).

Согласно приведенной схеме, выделившиеся в результате стимуляции полиА:У провоспалительные цитокины, вместе с ИЛ-8, ослабляют межклеточные контакты, чем снимают контактное ингибирование митоза, позволяя «эндотелиоцитам» пролиферировать или мигрировать, закрывая зону дефекта. Антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена. Они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию «эндотелия». Прямой противовирусный эффект обеспечивается наличием в КП ИФα.

Выводы

1. В КП содержится широкий спектр цитокинов.

2. Стимуляция клеток при помощи полиА:У приводит к повышению концентрации в КП ИЛ-1,-6, ФНО-α, ИФα.

3. В процессе получения КП спонтанно синтезируется ИЛ-8.

4. В свежеполученной сыворотке и плазме крови «предсуществуют» факторы роста TGFβ1, PDGF-AB, TGFβ2, VEGF, ИФγ и ИЛ-4.

5. Стимуляция клеток при помощи полиА:У и условия инкубации КП не повышают концентрацию TGFβ1, PDGF-AB, TGFβ2, VEGF, ИФγ и ИЛ-4 по сравнению с «предсуществующим» уровнем.

Подняться вверх сайта