Поиск Кабинет

Персонализированная клеточная терапия в офтальмологии. I. Метод получения и цитофенотип аутогенного клеточного продукта

Гены & Клетки: Том VI, №2, 2011 год, стр.: 38-42

 

Авторы

Аветисов С.Э., Суббот А.М., Антохин А.И., Каcпарова Е.А., Каспаров А.А., Павлюк А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Разработан метод получения аутогенных лейкоцитов из периферической крови с активацией их in vitro полиадениловой-полиурациловой кислотой (полиА:У) для лечения заболеваний роговицы. Метод позволяет получить продукт с достаточным для проведения персонализированной клеточной терапии (ПКТ) содержанием жизнеспособных ядросодержащих клеток (до 3×106 клеток/мл) в процессированной аутологичной сыворотке (ПАС). Исследован клеточный состав полученного продукта – содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза, увеличена доля гранулоцитов. Содержание субпопуляций лимфоцитов в клеточном продукте соответствует составу периферической крови за исключением В-лимфоцитов, количество которых снижено в 5 раз. В составе продукта идентифицированы клетки с фенотипом CD14/CD34low, считающиеся способными к мультилинейной дифференцировке. Применение клеточного продукта, полученного по разработанной методике, может быть перспективным в клинике, так как метод отличается минимальной травматичностью для пациента и простотой исполнения.

Введение

Клеточная терапия (КТ) – это применение аутогенных, аллогенных или ксеногенных живых клеток с целью регенерации поврежденной ткани.

В настоящее время применение КТ в клинике является нетривиальным выбором для лечащих врачей. Проведение КТ требует решения ряда вопросов: необходимо иметь постоянно доступный источник клеток, использовать безопасный и экономичный метод их выделения и процессинга, исключить или в крайнем случае минимизировать возможность развития иммунологического конфликта, обеспечить полную биологическую безопасность для пациента, реально оценивать техническую сложность применяемых методов, материальных затрат и законодательных и этических ограничений.

Решением вышеперечисленных проблем являются технологии персонализированной клеточной терапии (ПКТ), в которых для лечения пациента используются его собственные (аутогенные) клетки, полученные и сохраненные заранее либо полученные непосредственно перед проведением ПКТ [1]. Естественно, что для каждой конкретной клеточной технологии будет характерен уникальный алгоритм получения, хранения, процессинга и применения аутогенных клеток или клеточного продукта.

Периферическая кровь относится к доступным источникам материала для клеточной терапии. Клетки крови продуцируют широкий спектр биологически активных соединений (цитокины, факторы роста, гормоны, нейромедиаторы и др.). Кровь является источником различных функционально активных клеток (лимфоцитов) и клеток, имеющих способность к дифференцировке по различным направлениям: гемопоэтических стволовых клеток, мультипотентных мезенхимальных клеток периферической крови, мультипотентных взрослых прогениторных клеток (multipotent adult progenitor cells – МАРС) а также клеток моноцитарного происхождения, способных дифференцироваться в нефагоцитирующие линии – фиброциты, мезенхимальные прогениторы моноцитарного происхождения (monocyte-derived mesenchymal progenitors – MOMP), ранние эндотелиальные предшественники (early EPC) и клетки с фенотипом CD14+CD34low [2]. Вышеперечисленные производные моноцитов представляют большой интерес для клеточной терапии, так как они доступнее, чем костномозговые мезенхимальные стволовые клетки, их количество в периферической крови несравнимо больше, чем CD34+ или CD133+ клеток, а спектр полученной in vitro дифференцировки очень широк – эндотелиальные клетки, кардиомиоциты, остеобласты, гепатоциты, адипоциты, нейроны [3]. Среди них популяция клеток CD14+CD34low отличается тем, что она выделена исследователями без предварительного культивирования, в свежеполученной фракции МНК. Однако сложность заключается в том, что экспрессия CD34 на этих клетках не выявляется при стандартном цитометрическом анализе, а требует использования технологий усиления слабого сигнала: применения липосом, конъюгированных с антителами (antibody-conjugated magnetofluorescent liposomes – ACMFL), или дополнительных реагентов в технологии Fluorescence Amplification by Sequential Employment of Reagents (FASER) [4].

Введение аутологичного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза во время операции на роговице, когда нарушается биологическая герметичность тканевой ниши позволяет значительно усилить лечебный эффект ПКТ. В настоящее время такое применение КТ получило название «интраоперационная клеточная терапия» [5].

Исключительно важным условием проведения регенеративной терапии в офтальмологии, является отсутствие в КП субстанций, которые могут оказать токсическое действие на эндотелий роговицы при введении в переднюю камеру глаза. Технология получения КП должна предоставлять условия, обеспечивающие отсутствие в нем антикоагулянтов, антибиотиков, криопротекторов [6]. Благоприятной особенностью проведения ПКТ на переднем отрезке глаза (интракамеральное введение КП) является возможность использования небольшого количества клеток, для обеспечения терапевтического эффекта – 3–4×106 кл/мл [7].

Спектр стимуляторов, используемых для проведения КТ, ограничен теми субстанциями, применение которых разрешено законодательно. В случае интраоперационной ПКТ в офтальмологии, препарат должен быть разрешен к внутриглазному введению.

Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и стандартизация клеточного продукта [8].

Цель работы – разработать метод получения аутогенных жизнеспособных ядросодержащих клеток из периферической крови человека для интраоперационной персонализированной клеточной терапии в офтальмологии, без использования в процессе получения не разрешенных к клиническому применению препаратов, а также метод их активации и охарактеризовать состав полученного клеточного продукта.

Материал и методы исследования

Протокол исследования одобрен этическими комитетами ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и НИИ ГБ РАМН. У всех включенных в исследование было получено информированное добровольное согласие.

В качестве активатора мы использовали применяющийся в офтальмологии и разрешенный к внутриглазному введению раствор препарата «Полудан», который представляет собой комплекс полиадениловой и полиурациловой кислот (полиА:У, polyA:U), является структурным аналогом двухспиральной вирусной РНК и лигандом Толл-подобных рецепторов 3 типа (Тoll-Like Receptors – TLR-3) [9]. Показано, что полиА:У способен индуцировать синтез клетками крови широкого спектра цитокинов: ИЛ-1,-6,-8, ИФН-γ, ФНО-α [10]. Получены экспериментальные доказательства антиапоптотической активности полиА:У [11]. Кроме того, есть данные о том, что через активацию TLR можно влиять на механизмы дифференцировки клеток [12].

Лейкоциты из периферической крови можно получать разными способами: выделением на градиенте плотности фиколла или осаждением эритроцитов желатином [13,14].

Нами разработан метод получения лейкоцитов, заключающийся в их сборе из периферической крови, собранной без антикоагулянтов, после завершения процессов свертывания, в результате которых большая часть эритроцитов фиксируется в фибриновом сгустке, а часть лейкоцитов остается вне сгустка. Эти лейкоциты собирали вместе с сывороткой крови, которая является составной частью КП.

В составе сыворотки, инкубированной 4 ч при 37°С в присутствии стимулятора (полиА:У) присутствуют синтезированные de novo цитокины, а также эндогенные (фибриноген) и экзогенные (полиА:У) лиганды TLR. В силу этого такая сыворотка принципиально отличается от свежеполученной нативной сыворотки, используемой в диагностических целях и тем более от плазмы крови. Для ее обозначения мы используем термин «процессированная аутологичная сыворотка» (ПАС).

Получение КП осуществляли следующим образом – 200 ЕД Полудана растворяли в 2,0 мл воды для инъекций и переносили в стерильную пробирку на 10 мл. Из локтевой вены пациента в пробирку с раствором набирали 8 мл крови, закрытую пробирку инкубировали 4 ч при температуре 37°С, затем центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин (центрифуга Elmi СМ-6М). Взвесь клеток в сыворотке собирали, обводя иглой шприца вокруг фибринового сгустка, и переносили полученную клеточную суспензию в стерильную пробирку.

В камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток и эритроцитов в полученной суспензии. Оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием окрашивания трипановым синим.

Морфологическую характеристику (оценку содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов) приготовленного КП получали микроскопическим исследованием мазков, окрашенных по Романовскому – Гимзе.

Содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов определяли также на проточном цитофлюориметре BD FACSAria (BD biosciences, США) по параметрам светорассеяния. В рамках определенной популяции лимфоцитов проводили оценку субпопуляционного состава КП – определяли процентный состав клеток, экспрессирующих следующие комбинации поверхностных маркеров: CD3/CD4 – Т-лимфоциты хелперы, CD3/CD8 – Т-лимфоциты цитотоксические, CD19 – В-лимфоциты, CD16/CD56 – NK-клетки. Для иммуноцитохимического окрашивания использовали моноклональные антитела к указанным поверхностным маркерам, коньюгированные с флюорохромами (BD biosciences, США). В качестве контроля использовали изотипические антитела, меченные соответствующими красителями. Для сравнительного анализа измерения проводили в пробах цельной крови.

С помощью проточной цитометрии определяли наличие в КП популяции клеток, с фенотипом CD14+CD34low. После иммуноцитохимического окрашивания с использованием моноклональных антител к CD14 и CD34, коньюгированных с флюорохромами (BD biosciences, США), проводили дополнительную окраску с использованием усилителя флюоресценции слабого сигнала FASER (Miltenyl biotech, ФРГ) для увеличения интенсивности флюоресценции от CD34+-клеток. Для этого клетки инкубировали с реагентом, блокирующим FcR, и активирующим реагентом 10 мин при температуре 4°C в темноте, отмывали клетки и инкубировали с реагентом, блокирующим FcR и усиливающим реагентом 10 мин при температуре 4°C в темноте, затем тщательно отмывали клетки, проводили повторное окрашивание теми же реагентами и анализировали клетки на проточном цитофлюориметре BD FACSAria с использованием пакета программ BD FACSDiva Software. Для сравнительного анализа измерения проводили в пробах цельной крови, полученных стандартным способом с использованием антикоагулянта.

Результаты и обсуждение

Используя разработанный метод сбора клеток, из 8 мл крови получали 5–6 млн ядросодержащих клеток с жизнеспособностью 70–90%. Объем КП (взвесь лейкоцитов в ПАС) составлял 2–4 мл. Концентрацию ядросодержащих клеток в КП доводили до рабочей (3×106 кл/мл) путем центрифугирования и отбора соответствующего объема ПАС.

Предлагаемый метод сбора клеток в аутологичной сыворотке вокруг сгустка свернувшейся крови позволяет получить КП с высоким содержанием жизнеспособных клеточных элементов, достаточным для ПКТ в офтальмологии. Образовавшийся излишек ПАС, используют для промывания передней камеры во время интраоперационнй ПКТ непосредственно перед введением КП.

ПАС в дальнейшем хранится при -20°С и используется для капельных инстилляций или субконъюнктивальных инъекций.

Следует подчеркнуть, что процесс коагуляции крови является дополнительным пусковым механизмом для активации лейкоцитов, так как имитирует течение ранних стадий раневого процесса, в ходе которых высвобождаются эндогенные лиганды TLR, запускающие и усиливающие регенераторные механизмы в клетках [15].

Добавление стимулятора непосредственно при заборе крови, позволяет сократить время и число манипуляций, необходимое для получения КП. Количество эритроцитов в КП составило 0,76±0,43×106 кл./мл. Малое содержание эритроцитов позволяет избежать прокрашивания роговицы и побочных эффектов продуктов распада гемоглобина [16].

По результатам морфологического и цитофлюориметрического анализа установлено, что в КП соотношение гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов отличается от соотношения в цельной крови – содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза и увеличена доля гранулоцитов. Процентное содержание клеточных популяций приведено в табл. 1 и 2.

Показатели процентного содержания гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов были разными в зависимости от метода оценки – при оценке на мазках гранулоцитов и моноцитов наблюдалось больше, чем при цитофлюориметрическом анализе, однако индекс КП/кровь, отражающий изменение содержания этих популяций в КП по сравнению с кровью был одинаковым.

Из табл. 3 следует, что T-хелперы, T-цитотоксические и NK-клетки присутствуют в КП в тех же пропорциях, что и в периферической крови, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в 5 раз.

В результате применения технологии усиления слабого сигнала (FASER) при использовании метода проточной цитометрии нами было установлено наличие в КП клеток с поверхностной экспрессией CD14/34low в количестве ~2% от моноцитов (0,1% от всех лейкоцитов). Иллюстрация результата представлена на рис. 1. Количество региструемых CD14/34low клеток оказалось меньше, чем в работе Romagnani с соавт. (2005) (0,6–8,5% от всех лейкоцитов), при этом мы не наблюдали массивного сдвига моноцитарного гейта в область CD34 положительных значений. Возможно, такая разница обусловлена разными условиями пробоподготовки. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы достоверно оценить содержание CD14/34low клеток в периферической крови и КП.

Заключение

Для современной регенеративной медицины проблема выбора и получения материала для проведения клеточной терапии является приципиальным условием ее практического применения в клинической практике.

Персонализированная клеточная терапия с использованием аутогенных клеточных продуктов, открывает новые возможности для лечения широкого спектра социально значимых заболеваний, в том числе и в офтальмологии, решая ряд имеющихся на сегодняшний день проблем (источник и способ получения клеточного материала, иммунологическая совместимость, правовые, этические и технические аспекты).

Разработанный нами метод проведения ПКТ, позволяющий получить из небольшого объема периферической крови пациента клеточный препарат, представляющий из себя взвесь аутологичных лейкоцитов в насыщенной цитокинами (процессированной) сыворотке, прошел успешную клиническую апробацию и на практике доказал тепапевтическую эффективность и безопасность в офтальмологической клинике.

Метод получения КП отличается простотой выполнения, позволяет получить достаточное количество клеток для проведения интраоперационной ПКТ. Полученные данные о клеточном составе продукта имеют важное значение не только для стандартизации метода при его тиражировании, но и открывают перспективы дальнейшего его совершенствования с целью улучшения «потребительских» свойств.

Подняться вверх сайта