Поиск Кабинет

Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция) с помощью гистонов и других ядерных белков

Гены & Клетки: Том VI, №3, 2011 год, стр.: 29-40

 

Авторы

Соловьева В.В., Кудряшова Н.В., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В последнее время перспективным подходом в невирусном переносе генов стала доставка генов посредством белков (protein/peptide-mediated gene delivery). В предыдущих исследованиях было показано, что гистонные и другие ядерные белки могут служить эффективными векторами для переноса генов в клетки. Трансфекция эукариотических клеток комплексами нуклеиновых кислот с гистонами (гистонофекция) эффективно проходит с различными представителями семейства гистонных белков. Наличие ДНК-связывающих доменов и специфических сигнальных последовательностей ядерной локализации позволяет применять гистоны (Н1/Н5, Н2А, Н2В, Н3, Н4) и другие ядерные белки (такие, как белки семейства HMG и гистоноподобные прокариотические белки) для переноса рекомбинантных генов. Положительный заряд молекул гистонных белков способствует электростатическому взаимодействию с отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот и нейтрализации зарядов, что позволяет комплексам преодолевать отрицательно заряженную клеточную мембрану. Таким образом, гистонофекция является перспективным методом для невирусного переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот при генной терапии.

Разработка эффективных систем доставки генов – одна из основных задач генной терапии. Технологии доставки генов значительно продвинулись в последние годы. Однако возникают проблемы доставки генов, связанные с низкой эффективностью, высокой стоимостью и трудоёмкостью подготовки векторов. Остаются нерешенными вопросы токсичности, иммуногенности, онкогенности векторов и кратковременности экспрессии трансгенов.

Системы доставки генов могут быть условно разделены на две группы: вирусные и невирусные. Вирусные системы основаны на применении рекомбинантных вирусов (ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы и др.), полученных с помощью генной инженерии и оптимизированных для переноса генов [1–2]. Основные преимущества вирусных систем – высокая эффективность генетической модификации и длительность экспрессии трансгенов. Однако клиническое применение вирусных векторов ограничено их иммуногенностью и онкогенностью. В последнее время большие усилия были сосредоточены на разработке систем невирусной доставки генов: физические (электропорация, соникация, генные пушки и т.д.), химические (липоплексы, полиплексы, катионные наночастицы и т.д.), «голые» генетические конструкции (плазмиды, олигонуклеотиды и т.д.) [3].

Одним из направлений развития полиплексных систем доставки нуклеиновых кислот (трансфекции) – применение катионных пептидов и белков в качестве генетических векторов [4–9]. К преимуществам использования пептидов и белков для доставки генов относят: простоту производства и использования рекомбинантных белков, высокую чистоту и однородность, способность направленного транспорта полиплексов (комплексы ДНК-белок) в определённые типы клеток за счёт специфичных лиганд-рецепторных взаимодействий, а также отсутствие ограничений на размер и тип доставляемой в клетки нуклеиновой кислоты.

Известно, что ядерные белки, такие как гистоны, конденсируют ДНК и могут быть использованы для трансфекции клеток [5, 10–11]. Гистоны – положительно заряженные белки, которые взаимодействуют с ДНК путём электростатических взаимодействий, являются основным компонентом хроматина. Существует два различных типа гистонов: линкерные (H1/Н5) и нуклеосомные (H2A, H2B, H3, H4) [12– 13]. Трансляция гистонов происходит в цитоплазме клеток, после чего гистонные белки транспортируются в ядро. У гистонов есть специфические сигнальные последовательности – сигналы ядерной локализации (NLS, от англ. nuclear localization signal), которые обеспечивают их проникновение в ядро [14]. Наличие NLS и значительный положительный заряд позволяет гистонам эффективно конденсировать и переносить рекомбинантные нуклеиновые кислоты.

Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов и других ядерных белков

Существуют различные методы невирусной доставки рекомбинантных генов для трансфекции культур клеток [2, 15]. Выбор системы доставки зависит от типа клетки и вида доставляемой биомолекулы (ДНК, РНК, белки). Некоторые типы клеток, в том числе широко используемые трансформированные «бессмертные» клеточные линии, могут быть трансфицированы многими коммерчески доступными трансфицирующими агентами, такими как Lipofectin® и Lipofectamine®. Другие типы клеток, например, первичные культуры клеток, трудно трансфицировать стандартными методами. Гистонные белки обладают естественной способностью связываться с ДНК, что делает их потенциальными векторами для биобезопасной и эффективной доставки биомолекул в клетки. Ещё в 1965 г. было показано, что гистоны и катионные полиамины, такие как поли-L-лизин, протамин и поли-L-орнитин, стимулируют поглощение альбумина опухолевыми клетками in vitro [16–18]. С развитием биомедицины способность гистонов переносить экзогенные белки и нуклеиновые кислоты в клетки стали рассматривать и в контексте использования в генной терапии.

Трансфекция с помощью линкерного гистона H1

Большинство невирусных методов доставки нуклеиновых кислот эффективны для трансформированных «бессмертных» культур клеток, однако недостаточно эффективны для трансфекции первичных культур. В связи с этим, остро встаёт вопрос поиска новых методов невирусной трансфекции различных культур клеток. Гистоны могут выступать доставщиками нуклеиновых кислот в первичные клеточные линии как самостоятельно, так и в комбинации с другими трансфекционными агентами.

Известно, что гистон H1 может использоваться для доставки ДНК во многие клеточные линии [19– 32]. Показана эффективная трансфекция гистоном H1 кардиомиоцитов, эндотелиальных клеток человека и первичных клеток крысы [21, 25, 27]. Гистон H1, выделенный из ядерного экстракта клеток тимуса телёнка, эффективен для трансфекции культур клеток in vitro, особенно в присутствии кальция хлорида и хлорохина [29]. Необходимость присутствия ионов кальция для доставки генов с помощью гистона H1 также показана и в других работах [19, 30]. Значительно повышало эффективность трансфекции использование гистона H1 в комбинации с DOSPER® (от англ. 1,3-Di-Oleoyloxy-2-(6-Carboxyspermyl)propylamid) – липосомным трансфекционным агентом для трансфекции первичных культур клеток [25]. V. Budker с соавт. (1997) показали, что гистон Н1 повышает эффективность трансфекции систем на основе амфифильных полиаминов [20]. Другие авторы показали, что гистон H1 может переносить ДНК, мРНК и малые интерферирующие РНК (миРНК) в трансформированные и первичные культуры клеток. Эффективность трансфекции была сопоставима или даже превосходила системы на основе липосом [31]. Для определения функциональных доменов гистона H1 человека, отвечающих за его основные функции, I. Puebla с соавт. (2003) с помощью методов генной инженерии создали различные усечённые варианты белка и исследовали их на способность конденсировать ДНК и трансфицировать трансформированные и первичные культуры клеток [31]. Фрагмент H1.4F, содержащий полный С-конец и фрагмент средней части гистона Н1 (387 нуклеотидов 3'-концевой последовательности кДНК гистона Н1 человека), показал наибольшую эффективность трансфекции. Это подтверждают другие исследования, в которых показано, что С-концевая часть гистона Н1 играет важную роль в конденсации ДНК [32]. Полипептид H1.4F способен доставлять как ДНК, так и РНК, что важно для создания векторной системы подавления экспрессии генов посредством механизма РНК-интерференции. Показано, что полипептид H1.4F менее токсичен для клеточных культур по сравнению с липосомными трансфекционными агентами [31].

H.J. Jung с соавт. (2008) показали, что рекомбинантный С-концевой пептид (H1C, 61 аминокислота) гистона H1 из золотой рыбки Carassius auratus способен конденсировать ДНК и защищать её от деградации. Полипептид H1C способен эффективно доставлять ДНК в клетки млекопитающих в отсутствии ионов кальция. При трансфекции клеточных линий (293Т человека и NIH/3T3 мыши) полипептидом H1C экспрессия репортерных генов lacz и egfp была в несколько раз выше, чем при трансфекции агентом Lipofectamine® [33].

Трансфекция с помощью нуклеосомных гистонов H2A, H2B, H3 и H4

D. Balicki с соавт. (1997) разработали метод генного переноса посредством гистона Н2А. Они показали, что в сравнении с другими гистонами H2A наиболее эффективен для трансфекции различных культур клеток [10]. N-концевой пептид гистона H2A, состоящий из 37 аминокислотных остатков, способен трансфицировать клетки in vitro. Авторы предположили, что Н2А конденсирует ДНК, образуя незаряженный комплекс, который проникает через плазматическую мембрану и доставляет ДНК в ядро [11]. Гистоны H1 и Н2А, видимо, трансфицируют клетки с помощью различных механизмов, так как удаление С-концевого фрагмента гистона Н2А незначительно сказывается на его трансфекцинной активности [11], а C-концевой фрагмент гистона H1 играет важную роль в H1-опосредованной трансфекции. Мутации или удаление N-концевой части гистона Н2А приводят к потере его трансфекционной активности [11].

H. Liu и I. Soderhall (2007) использовали гистон Н2А для доставки двуцепочечной РНК (дцРНК) в клетки кроветворной ткани американского сигнального рака, Pacifastacus leniusculus. Эффективность трансфекции гистона Н2А была выше, чем у трансфекционного агента Effectene® и липосомных систем доставки нуклеиновых кислот. Важно отметить, что высокая эффективность гистона Н2А сочетается с низкой токсичностью и специфичностью для трансфицированных клеток, выделенных из кроветворной ткани Pacifastacus leniusculus [34].

Было показано, что реконструированный хроматин в комплексе с гистонными белками H2B, оптимизированными для ядерной доставки, может использоваться в качестве эффективного средства доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в ядро клеток млекопитающих (клеточная линия MCF7), в результате чего повышается уровень экспрессии трансгена (более чем в 6 раз больше по сравнению с трансфекционным реагентом Lipofectamine®) [35].

K.M. Wagstaff с соавт. (2007) показали, что гистон H2B эффективно доставляет ДНК посредством гистон-опосредованной трансдукции (HMT, от англ. Histone-Mediated Transduction) в различные клеточные линии. Эффективность трансфекции гистона Н2В в 2,5 раза выше, чем у коммерческих липосомных агентов. Эффективность трансфекции увеличивалась при использовании димера гистонов Н2А и H2B, содержащего два домена белковой трансдукции (PTD, от англ. protein transduction domains) [36].

В работах I. Demirhan и O. Hasselmayer с соавт. (1998, 2001) исследована эффективность комбинирования гистонофекции и липофекции для доставки генов в клетки, найдены оптимальные соотношения ДНК-липидов-гистонов [28, 37]. Авторы показали, что наибольшая эффективность генной трансфекции наблюдается с гистонами Н3 и Н4, однако в отличие от результатов, полученных D. Balicki с соавт., гистон Н2А не способен к трансфекции клеток. Комплексообразование имеет решающее значение для трансфекции, и различие между результатами этих двух групп возможно из-за различных типов линий клеток-мишеней, условий трансфекции, источника и чистоты препаратов гистонных белков [10]. Интересно, что перенос гена, опосредованный гистонами H3 и H4 [28], не зависит от дополнительных кофакторов, таких как кальция хлорид и хлорохин, которые играли важную роль в экспериментах с гистоном Н2А [10–11].

Для экспрессии трансгена важна внутриядерная локализация плазмидной ДНК. В работе H. Kamiya с соавт. (2010) гистонные белки использовались для доставки плазмидной ДНК (pYK-CMV-luc) в клетки линии HeLa. Однако авторы показали, что комплексы гистона H3 с плазмидной ДНК обладали более низкой транскрипционной активностью. Это, по-видимому, связано с высокой стабильностью нуклеопротеинового комплекса, что предотвращало взаимодействие плазмидной ДНК с транскрипционным аппаратом клетки [38].

Трансфекция с помощью гистоноподобных белков и пептидов неэукариотического происхождения

Гистоноподобные белки и пептиды неэукариотического происхождения также могут служить векторами для трансфекции. Показано, что гистоноподобный белок архебактерий HPhA (от англ. archaeal histone-like protein-based) из Pyrococcus horikoshii штамма OT3 может образовывать стабильные нековалентные комплексы с нуклеиновыми кислотами и улучшает их доставку в различные типы клеточных культур [39]. Эффективность трансфекции при этом зависит от соотношения HPhA к ДНК, времени инкубации и добавления кальция хлорида. Важно, что цитотоксичность HPhA ниже, чем у липосомных трансфекционных агентов. В других исследованиях авторы использовали белок HPhA в качестве вектора для доставки гена p53 (опухолевый супрессор). Уровень экспрессии и активности гена p53 оценивали in vitro и in vivo. Было показано, что HPhA, по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine®, повышает эффективность доставки гена р53 и его противоопухолевую активность [40]. Белок HPhA способен защищать нуклеиновые кислоты от действия нуклеаз, что важно для сохранения функциональной активности трансгенов [39].

Другие исследования показали, что гистоноподобный белок TmHU (от англ. heat unstable) из термофильных бактерий Thermotoga maritima может также выступать вектором для трансфекции ДНК в различные эукариотические клетки. Белок HU чрезвычайно стабилен, и его можно выделять из рекомбинантного штамма Escherichia coli. Белок TmHU может повышать эффективность других методов трансфекции, например липофекции, а также защищать ДНК от деградации и термической денатурации [41]. Как и гистоны, TmHU содержит NLS, которые обеспечивают его проникновение в ядро эукариотических клеток [41]. Также показано, что предварительная конденсация ДНК гистоноподобным белком HU из микоплазмы Acholeplasma laidlawii в 2–4 раза увеличивает эффективность трансфекции эукариотических клеток (клеточная линия HEK293) [42]. Эффективность трансфекции оценивали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии по интенсивности флуоресценции маркерного белка GFP в клетках.

Трансфекция с помощью негистонных ядерных белков

Описано применение белков группы высокой подвижности HMGs (от англ. high-mobility group) в качестве невирусных генных векторов in vitro и in vivo [43–49]. HMGs – группа ядерных хромосомных белков, участвующих в «упаковке» хроматина и процессах транскрипции, репликации, рекомбинации и репарации [50]. Эти белки описаны в начале 1970-х годов [51] как группа негистоновых белков. HMGs подразделяются на 3 группы: HMGB (HMG-1/2), HMGN (HMG-14/-17) и HMGA (HMG-I/Y/ C). В 1988 г. M. Bottger с соавт. обнаружили способность белка HMG1 к конденсации ДНК и её доставке в L-клетки мыши [47]. Эффективность трансфекции была выше, чем при использовании кальций фосфатного метода. Y. Kaneda с соавт. (1989, 1991) разработали векторную систему на основе везикулярных комплексов, полученных инкубацией ДНК-содержащих липосом с вирусом HVJ (вирус Сендая) и мембраной эритроцитов, содержащей белок HMG1 [43, 44]. Авторы показали, что эффективность трансфекции комплексами, содержащими HMG1, в 10 раз выше, чем комплексами с бычьим сывороточным альбумином (БСА). S.V. Zaitsev с соавт. (1997) показали трансфекционную активность белка HMG17 в различных клеточных линиях [27]. Для эффективной трансфекции необходимо присутствие в среде ионов кальция в низкой концентрации. Эффективность трансфекции с помощью белка HMG17 была ниже, чем с использованием гистона Н1 и трансфекционного агента Lipofectamine®.

A.R. Mistry с соавт. (1997) показали способность белка HMG1 к доставке ДНК в клетки линии Caco-2 [49]. Эффективность трансфекции HMG1 была выше, чем у кальций фосфатного метода, однако ниже, чем у трансфекционного агента Lipofectin®. Важно, что комплексы белка HMG1-ДНК не токсичны для культивируемых клеток даже при высоких концентрациях.

Безопасность доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонных и других ядерных белков

Одно из основных препятствий использования невирусных систем доставки генов – их токсичность для клеток. Проводятся исследования токсичности невирусных трансфекционных агентов in vitro и in vivo [15, 52–53], однако точный механизм, лежащий в основе их токсичности, по-прежнему не найден. Было показано, что системы доставки ДНК, основанные на использовании катионных липидов, влияют на морфологию и жизнеспособность клеток. Микроскопическое исследование клеток, обработанных трансфекционными агентами на основе липосом, такими как Lipofectin® или Lipofectamine®, показало морфологические изменения, разрушения клеток и снижение их жизнеспособности [54–56].

Важная особенность гистонных белков – их низкая цитотоксичность. I. Puebla с соавт. показали, что гистон H1 менее токсичен, чем трансфекционные агенты на основе липосом [31]. Другие авторы также показали отсутствие токсичности гистона H1 и гистоноподобных белков [20, 27, 39].

Одним из недостатков использования гистонов в качестве векторов для генной терапии – способность вызывать иммунный ответ. Антитела к гистонам найдены при заболевании Либмана – Сакса (системная красная волчанка, СКВ) [57]. Показано, что гистоны H1 и H2B могут служить сильными иммуногенами при СКВ [58]. Также показано, что гистоны индуцируют иммунный ответ при введении их животным. Например, введение гистонов Н2А, H2B, H3 и H4 представителей рода Leishmania (паразитические протозоа, возбудители лейшманиоза) мышам вызывает специфический Th1 (клеточный) иммунный ответ и подавление Th2 (гуморального) иммунного ответа [59]. Таким образом, доставка генов с помощью гистонов должна применяться в четко определенных ситуациях, при которых возможно использование полезных свойств гистонов и ограничиваются их побочные эффекты.

Другой подход к минимизации иммуногенности гистонов – ограничение размера гистонных полипептидов, не затрагивающее их трансфекционного потенциала. D. Balicki с соавт. (2002) показали, что 37-мер N-концевой пептид гистона Н2А может эффективно трансфицировать клетки нейробластомы мыши NXS2, не вызывая токсического эффекта [11]. I. Puebla с соавт. для трансфекции использовали усечённые фрагменты гистона H1 различных размеров [31]. С-концевой фрагмент, составляющий одну треть от молекулы гистона H1, трансфицировал различные клетки млекопитающих с минимальной токсичностью. Предположительно, короткие пептиды имеют низкую токсичность и низкую иммуногенность. L. Collins с соавт. (2001, 2003) показали, что синтетический пептид полилизин-молоссин (от англ. polylysine-molossin), состоящий из 31 аминокислоты, является эффективным вектором для доставки генов [60, 61]. Исследования in vivo показали его низкую токсичность и иммуногенность.

Еще одно ограничение использования гистонов для доставки генов – быстрое выведение их из крови, что приводит к снижению их эффективности. Для повышения стабильности пептидов и белков их используют в сочетании с химическими полимерами и наночастицами. V.P. Torchilin и A.N. Lukyanov (2003) описали ряд таких полимеров и наночастиц, их характеристики и использование в доклинических и клинических исследованиях [62].

Гистоноподобные и негистонные ядерные белки практически не токсичны для различных клеточных линий [27, 39, 41, 43–44]. Было показано, что гистоноподобный белок HPhA из Pyrococcus horikoshii в 10 раз менее токсичен для клеток линий NIH 3T3 и HL-7702 по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine®, который даже в низких концентрациях приводил к гибели клеток [39]. Белок TmHU также показал в 10 раз меньшую токсичность на клетках линии 293T по сравнению с трансфекционным агентом Lipofectamine® [41]. Везикулярные комплексы, содержащие белок HMG1, эффективно трансфицируют клетки линии LLC-MKz (клетки почки обезьяны) без токсического эффекта для них [43, 44]. Показано, что белок HMG17 менее токсичен для различных клеточных линий в отличие от липосомных агентов [27].

Обобщенные данные по применению гистонных, гистоноподобных и негистонных белков в качестве трансфекционных векторов представлены в таблице.

Механизм доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот с помощью гистонов

Поры в ядерной мембране имеют размер 24 нм, что считается главным препятствием для внутриядерного проникновения комплексов плазмидной ДНК с катионными носителями [4]. Большие белки или комплексы пептида-ДНК транспортируются к ядру активным транспортом посредством «узнавания» последовательностей NLS. Один из подходов для генного переноса заключается в электростатическом связывании рекомбинантных нуклеиновых кислот с белками и полипептидами, содержащими последовательности NLS [63–65]. Кроме того, NLS-пептиды можно ковалентно конъюгировать с ДНК [66]. Инъекции плазмидной ДНК, ковалентно связанной с NLS-пептидом, в цитоплазму эмбриона Danio rerio (англ. zebrafish) приводит к ядерному транспорту в 50–100 раз выше по сравнению с немодифицированной «голой» плазмидной ДНК [67]. M.A. Zanta с соавт. (1999) показали, что NLSпептиды , ковалентно связанные с плазмидной ДНК, могут повышать эффективность трансфекции in vitro в 100 раз [66]. Четыре нуклеосомных гистона Н2А, H2B, H3 и H4 транспортируются из цитоплазмы в ядро по NLS-зависимому пути [68, 69]. У гистона Н1 нет канонических последовательностей NLS. Его ядерный транспорт, по-видимому, связан с положительно заряженным С-концевым доменом. Тем не менее, NLS последовательности остальных гистонов показывают некоторое сходство с NLS полиомавируса SV40 (от англ. Simian vacuolating virus 40) большого Т-антигена и расположены в N-концевой области [70]. Включение NLS последовательности SV40 большого Т-антигена в химерный гистон H1 повышало эффективность ядерного транспорта [21]. D. Balicki с соавт. создали несколько усечённых полипептидов, охватывающих все участки гистона Н2А, и оценили их способность к переносу чужеродной ДНК в клетки COS7 [11]. Высокую эффективность трансфекции показали N-концевые пептиды (первые 37 аминокислот гистона Н2А), содержащие NLS последовательности. Ядерная мембрана – барьер для прохождения ДНК к ядру, поэтому митотические стимулы повышают эффективность стандартных методов трансфекции [71]. При разработке трансфекционных реагентов для использования in vivo проблема ядерного транспорта встаёт особенно остро, так как большинство клеток-мишеней являются непролиферирующими. Существующие системы доставки генов полагаются на ковалентное или не ковалентное связывание NLS пептидов чужеродных белков, таких как SV40 большой Т-антиген. Гистоны могут стать естественным альтернативным подходом для преодоления барьера ядерной мембраны.

Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей генов гистонов человека и мыши показывает, что каждый тип гистонных белков состоит из нескольких подтипов. Первоначальные эксперименты по применению гистонов в качестве трансфекционных агентов основывались на применении гетерогенных смесей гистонных белков из ядерных экстрактов, что затрудняло идентификацию наиболее эффективного белка для переноса нуклеиновых кислот. D. Balicki с соавт. предположили, что эффективность доставки ДНК гистоном Н2А объясняется 2 механизмами: электростатическим связыванием с ДНК (конденсацией) и ядерным транспортом комплексов гистонов Н2А-ДНК посредством NLS последовательностей белка [11]. Мутации положительно заряженных остатков N-концевого домена Н2А приводят к снижению трансфекционной активности, что подчеркивает важность сохранения целостности α-спиральной структуры N-концевой области гистонов Н2А.

Транспорт комплексов ДНК-гистоны через плазматическую мембрану клеток – не единственный фактор высокой трансфекционной активности гистонов. Перенос через плазматическую мембрану осуществляют и другие трансфекционные агенты, такие как поли-L-лизин, Lipofectamine® и полиэтиленимин [72, 73]. Однако преимущество гистонов заключается в том, что они остаются в комплексе с ДНК после проникновения в цитоплазму, участвуют в активном транспорте комплексов ДНК-гистон в ядро, где ДНК участвует в процессах транскрипции [11].

Понимание механизмов взаимодействия с клеточной поверхностью и проникновения внутрь клетки через плазматическую мембрану имеет большое значение для разработки эффективных систем переноса генов. Известно, что белки, пептиды, вирусы и ДНКбелковые комплексы проникают в клетки млекопитающих с помощью процесса рецептор-опосредованного эндоцитоза [74–77]. Кроме того, проникновение макромолекул в клетки может проходить по пути клатрин-независимого эндоцитоза, в том числе с помощью фагоцитоза, макропиноцитоза и кавеолярных везикул [78–80]. Ряд исследований показал, что некоторые пептиды способны пересекать мембрану клетки без участия эндоцитозного механизма [81]. Общее свойство всех гистонов, поли-L-лизина и поли-L-аргинина – высокое содержание положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg и Lys). При физиологическом рН эти молекулы положительно заряжены и, следовательно, вряд ли могут пассивно диффундировать через липидный бислой. Существует распространённая гипотеза, что проникновение комплексов ДНК-переносчик происходит в клетках через эндоцитозный путь [82–83]. I. Kopatz с соавт. (2004) предложили новую модель для клеточного проникновения ДНК с участием протеогликанов как рецепторов ДНК-комплексов [84].

В литературе существуют противоречивые данные о механизмах проникновения комплексов нуклеиновых кислот с гистонами в клетки (рис.). E. HaritonGazal с соавт. (2003) экспериментально продемонстрировали, что гистоны H1, Н2А, H2B, H3 и H4 непосредственно проходят через плазматическую мембрану клеток HeLa and Colo-205 с помощью пассивной диффузии [85]. Было показано, что интернализация гистонов в этих клетках происходит при низкой температуре, недостатке АТФ (аденозинтрифосфат) и высокой молярности сахарозы, что блокирует процесс эндоцитоза. Кавеол-опосредованный эндоцитоз и фагоцитоз не могут участвовать в интернализации гистонов, так как применение специфических ингибиторов этих механизмов не влияет на скорость поглощения гистонов [85, 86]. Проникновение нуклеосомных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, не связанное с эндоцитозом, показано на примере растительных клеток и протопластов [87, 88]. В этом случае поглощение гистонов проходило при 4 °С и не ингибировалось блокаторами эндоцитоза. Используя гистоны, меченые биотинилированием, и ИФА-системы, J. Rosenbluh с соавт. (2005) установили, что гистоны Н2А, Н3 и Н4 могут проходить через липидный бислой больших однослойных или многослойных липосом [89]. В отличие от Н2А, H3, H4, гистон H2B не мог проникать в липосомы.

Однако участие эндоцитоза в прохождении гистонов в комплексе с ДНК в клетку не может быть абсолютно исключено. Действительно, хлорохин повышает активность трансфекции гистона H1 [21, 27]. Хлорохин, как известно, нейтрализует кислую рН эндоцитозных пузырьков, что снижает деградацию макромолекул эндосомальных везикул. Также было установлено, что хлорохин повышает рецепторопосредованный перенос генов – процесс, происходящий с помощью эндоцитоза.

Для определения механизма доставки комплексов гистона H1-ДНК внутрь клетки, S.V. Zaitsev с соавт. (2002) использовали в экспериментах флуоресцентно меченые ДНК и гистон H1 [19]. С помощью флуоресцентной микроскопии и иммунофлуоресценции авторы показали локализацию комплексов гистона H1-ДНК в эндосомах/лизосомах, что свидетельствует о поглощении трансфекционных комплексов с помощью эндоцитоза. Авторами также установлено, что ионы кальция контролируют реорганизацию трансфекционных комплексов в эндосомах/лизосомах и их высвобождение в цитозоле, что важно для экспрессии трансгенов, тогда как поглощение трансфекционных комплексов клетками не зависит от присутствия ионов кальция.

Гистоны могут участвовать в ядерном транспорте не только нуклеиновых кислот, но и других биомолекул. Например, показано, что ковалентное присоединение гистонов к БСА приводило к проникновению комплексов в клетки [85]. В отличие от проникновения в клетку неконъюгированных гистонов, эффективность прохождения комплексов гистона-БСА в клетку снижалась при снижении уровня АТФ в клетке или понижении температуры, что свидетельствует о том, что часть комплексов гистона-БСА проникает в клетку с помощью эндоцитоза.

Для анализа механизма проникновения гистона Н2В в клеточное ядро K.M. Wagstaff с соавт. (2007) создали димер GFP и трех различных частей гистона H2B: N-концевой хвост, который содержал консервативный стандартный NLS; глобулярный домен (неконсервативный), который отвечает за формирование октамера и связывание с ДНК; С-концевой хвост, который играет роль в поддержании структуры нуклеосомы. Было показано, что трансдукция зависит от N-концевого хвоста и глобулярного домена. При добавлении еще одного сигнала ядерной локализации к гистону H2B увеличивалась скорость его проникновения в клеточное ядро. Было показано, что гистоны в комплексе с ДНК проникают в ядро посредством трансдукции белков, а не эндоцитоза [36].

Комбинированные системы доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки

Трансфекционные агенты на основе катионных наночастиц и полимеров – перспективные векторы для генного переноса. Однако многие катионные полимеры в высоких концентрациях токсичны для клеток. Положительно заряженные белки, такие как гистоны, являются биологически безопасной альтернативой традиционным трансфекционным агентам, особенно in vivo. Одно из перспективных направлений – комбинирование различных катионных наночастиц с гистонными белками для повышения эффективности трансфекции. Так, было показано, что экстракт гистонов из тимуса телёнка и из куриных эритроцитов способен связывать ДНК и трансфицировать различные культуры клеток [90]. Однако исследователи наблюдали лишь незначительную экспрессию рекомбинантных репортерных генов. Эффективность трансфекции существенно возрастала при добавлении в комплексы катионного полимера полиэтиленимина (PEI, от англ. polyethylenimine). Ни PEI, ни одни гистоны по отдельности не могли достичь эффективности, сравнимой с комплексами PEI-гистон-ДНК. Эти результаты показывают, что смеси гистонов (рекомбинантных или из природных источников) в сочетании с минимальными концентрациями PEI могут использоваться в качестве низкотоксичных эффективных векторов для трансфекции клеток in vitro и in vivo.

J. Deng с соавт. (2011) синтезировали катионный сополимер низкомолекулярного полиэтиленимина и L-глутаминовой кислоты (PLGE, от англ. Poly (L-glutamic Acid) Grafted Polyethylenimine). Для улучшения эффективности доставки генов PLGE применяли в комплексе с гистонами, содержащими NLS, в качестве кофактора применяли хлорохин. В работе использовался линкерный гистон Н1 и нуклеосомные гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Авторы показали успешное формирование комплексов ДНК-гистонPLGE размером около 200 нм в диаметре. Применение гистона значительно повышало эффективность трансфекции PLGE и экспрессию GFP in vitro (клетки линии HeLa) и in vivo (у плодовой мушки Drosophila melanogaster). Комплексы ДНК-гистон-PLGE низкотоксичны для клеток [91].

Было показано [92, 93], что концевые пептиды гистона Н3 в сочетании с полиэтиленгликолем (PEG, от англ. polyethylene glycol) являются высокоэффективными и нетоксичными средствами доставки генов. M.O. Sullivan с соавт. (2008) создали полиплексы PEG, содержащие триметилированные в четвертой позиции концевые пептиды гистона Н3 (H3K4me3). Наличие NLS-последовательностей позволяло H3K4me3 взаимодействовать с ядерными эффекторными комплексами, инициируя транскрипционную активность. При использовании полиплексов с H3K4me3 экспрессия репортерных генов начиналась в два раза быстрее, чем при использовании полиплексов PEG без пептида H3K4me3. Также авторы разрабатывают способ доставки нуклеиновых кислот с помощью комплексов, содержащих катионные наночастицы золота и H3K4me3 (HMGNs, от англ. histone-mimetic gold nanoparticles) [94]. Такие комплексы имеют сильный положительный заряд, что обеспечивает хорошую конденсацию ДНК и ее защиту от деградации нуклеазами. Было показано, что комплексы HMGN-плазмидная ДНК стабильны в присутствии нуклеаз сыворотки крови. Также эффективны для доставки нуклеиновых кислот комплексы PEI-H3K4me3 [94]. Эффективность трансфекции клеток линии СНО-К1 комплексами PEI-H3K4me3 была выше, чем при использовании PEI и H3K4me3 по отдельности.

Гистонные белки и пептиды успешно применяют в сочетании с другими системами доставки генов, что значительно повышает их эффективность. J.E. Hagstrom с соавт. (1996) для трансфекции клеточной линии NIH3T3 использовали тройные комплексы: плазмидная ДНК-гистон H1-DOPE (от англ. dioleoyl phosphatidylethanlamine) и плазмидная ДНКгистон H1-фосфатидилсерин [24]. Они показали, что тройные комплексы, содержащие гистон Н1 и DOPE, трансфицируют клетки с большей эффективностью, чем двойные комплексы, содержащие только плазмидную ДНК и DOPE. Гистон H1 способствует более плотной упаковке ДНК и стабилизирует её комплексы с липосомными трансфекционными агентами. Гистоны Н2А, H2B, H3 и H4 менее эффективны в сочетании с другими липосомными трансфекционными агентами [24]. Также показано, что в клетках, трансфицированных комплексами гистон H1-плазмидная ДНК-Lipofectin®, экспрессируется в 20 раз больше люциферазы, чем в клетках, трансфицированных комплексами плазмидная ДНК-Lipofectin® [21].

K.M. Wagstaff с соавт. (2008) показали, что реконструированный хроматин в комплексе с гистонными белками H2B, содержащими дополнительные NLS, повышает эффективность электропорации и липофекции [35]. Использование реконструированного хроматина с гистонными белками H2B при электропорации или липофекции (Lipofectamine®) значительно повышало эффективность доставки ДНК в клетки линии MCF7 и экспрессию репортерного гена GFP.

В настоящее время проводятся исследования по разработке адресных (тканеспецифичных) невирусных систем доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот [63]. Эти системы основаны на доставке ДНК при помощи поликатионных носителей (например, поли-L-лизин) с синтетическими олигопептидными лигандами, которые специфичны к рецептору клетки-мишени. Основной недостаток липидной и полимерной систем адресной доставки – произвольное сшивание специфичных липидных и полимерных олигопептидов, что влияет на эффективность доставки, уменьшая её специфичность [64, 65]. Для повышения специфичности доставки были сконструированы генетические конструкции, содержащие последовательности ДНК, кодирующие гистоны и специфические лиганды. F.H. Dai с соавт. (2003) сконструировали серию векторов, содержащих последовательность кДНК, кодирующую гистон Н1, и рецептор эпидермального фактора роста [95]. Эти векторы эффективно и специфично трансфицировали клетки in vitro (клеточные линии: U2OS, клетки остеосаркомы человека, BEL-7402, клетки гепатомы человека, и SKOV3, клетки аденокарциномы яичника человека) и in vivo (мыши линии BALB/c после введения клеток BEL-7402 и SKOV3).

Заключение

Таким образом, применение гистонных и других ядерных белков для переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки – перспективный метод невирусной трансфекции in vitro и in vivo. Гистонные белки могут быть использованы как в виде самостоятельных векторов для генного переноса, так и в виде компонентов более сложных трансфекционных систем, позволяя повысить стабильность нуклеиновых кислот и эффективность транспорта в ядро клетки.

Подняться вверх сайта