Поиск Кабинет

Патоморфологическое исследование печени мышей Mus musculus C57BL6 на фоне атерогенной диеты

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 37-40

 

Авторы

Гайфуллина Р.Ф., Катина М.Н., Абдулхаков С.Р., Касимова Л.Р., Абдулхакова А.Р., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Атеросклеротическое поражение сосудов – одна из ведущих причин наступления смерти и инвалидизации населения в мире. Печень играет большую роль в патогенезе атерогенной дислипидемии, развитии и прогрессировании атеросклероза. Мы исследовалии влияние атерогенной диеты на морфологию печени мышей Mus musculus C57BI6, содержащихся на атерогенной диете. Эта линия мышей, в отличие от некоторых других линий, способна к естественному развитию атеросклероза. Спустя 14 недель скармливания животным атерогенной диеты мы наблюдали выраженную гепатомегалию (масса печени составила 9% массы тела животных), деформацию дольчатой структуры печени. Также были обнаружены явления микро- и макровезикулярного стеатоза, апоптоза, фиброза, обнаружена воспалительная лейкоцитарная инфильтрация. Таким образом, печень не только играет важную роль в развитии дислипидемии, но и сама является органом-мишенью при нарушении обмена липидов.

Атеросклеротическое поражение сосудов способно привести к таким тяжелым патологическим состояниям как ишемический инсульт и инфаркт миокарда – заболеваниям, являющимся ведущими причинами смерти и наступления инвалидности во всех развитых странах мира [1]. Именно поэтому актуально исследование атерогенеза и поиск новых методов борьбы с атеросклерозом. С этой целью используются модели атеросклероза у лабораторных животных путем скармливания им атерогенной диеты и за счет генетических модификаций (например, АроЕ-нокаутные мыши, LDLR-дефицитные мыши) [2]. Однако атеросклероз это мультифакториальное заболевание, обусловленное генетической предрасположенностью, образом жизни, вредными привычками, связанное с заболеваниями других органов и систем [3]. Вследствие того, что генно-модифицированные модели позволяют изучать только отдельные аспекты атерогенеза, остаются актуальными модели с использованием атерогенной диеты, позволяющие изучать заболевание в условиях, наиболее приближенных к образу жизни и диете людей [4].

Мыши Mus musculus C57BI6 являются линейными инбредными не трансгенными животными. У них отмечается атеросклеротическое поражение аорты при содержании их на атерогенной диете [5]. Существуют различные виды атерогенных диет, большинство из них основаны на большом количестве жиров в рационе и добавке холестерина. Можно предположить, что скармливание животным такого нефизиологичного для них корма может оказать воздействие не только на процесс атерогенеза, но и на морфологию и функцию других органов и систем. Печень ответственна за синтез Apo-белков, входящих в состав липопротеинов, синтез и обмен холестерина, за счет чего она активно участвует в патогенезе дислипидемии, которая выявляется у 20–80% больных неалкогольной жировой болезнью печени [6].

Моделирование атеросклероза на животных с помощью специальных диет изучается с начала XX в. в известных работах отечественных ученых Н.Н. Аничкова и С.С. Халатова. Поэтапно изучена морфология атеросклеротических поражений крупных сосудов [2]. Однако практически не встречается сообщений об экстраваскулярных изменениях в организме животных при содержании их на атерогенной диете. В данном исследовании исследовано воздействие скармливания животным атерогенной диеты на морфологию печени.

Материал и методы

Лабораторные животные. В нашем исследовании использовались взрослые самцы мышей Mus musculus C57BI6. Животные SPF-категории получены из питомника лабораторных животных «Пущино». Всего было 10 животных, из них 5 содержались на атерогенной диете, 5 составляли контрольную группу, содержавшуюся на стандартном рационе вивария. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Российской Федерации, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам [7].

Атерогенная диета. В качестве атерогенной диеты использовался модифицированный рацион Paigen, в состав которого входят: холевая кислота (Вектон, 81-25-4) 0,5%, холестерин (Panreac, 371274) 2%, подсолнечное масло 20%, стандартный корм для лабораторных животных (Лабораторкорм) 77,5%. Животные содержались на атерогенной диете в течение 14 нед., после чего были выведены из эксперимента.

Морфологическое исследование. Для микроскопического исследования морфологических изменений в печени животных на фоне атерогенной диеты использовали иммунофлуоресцентное окрашивание поперечных криостатных микросрезов ткани печени. Проводили формалиновую перфузию животных 10% раствором формалина, выделенную печень помещали в вышеуказанный раствор формалина на 24 ч, после чего раствор заменялся на раствор для хранения тканей (30% раствор сахарозы (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере PBS (Биолот, Россия) с добавлением азида натрия (Sigma, 71290) в качестве консерванта). Для изготовления срезов использовали микротом-криостат НМ560 Cryo-Star (Carl Zeiss, Германия), толщина срезов 8 мкм. Полученные срезы подсушивали на воздухе в течение 2 ч, регидратировали 5 мин в растворе PBS, инкубировали при комнатной температуре в увлажненной камере с 0,1% раствором Тритона Х-100 в течение 20 мин для пермобилизации мембраны, инкубировали с 10% раствором лошадиной сыворотки (Биолот) в PBS для блокирования неспецифического связывания антител. Затем срезы инкубировали в течение 1 ч с первичными антителами, разведенными в соотношении 1:100 в растворе PBS с добавкой 1% лошадиной сыворотки. Инкубировали 45 мин с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромами (ослиные антитела к IgG кролика, конъюгированные с AlexaFluor 488, Invitrogen, США; ослиные антитела к IgG мыши, конъюгированные с AlexaFluor 555, Invitrogen, США). Процедуру повторяли для другой пары первичных и вторичных антител, после чего срезы красили DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole; Invitrogen, D1306) для визуализиции ядер клеток. Между каждой процедурой проводилось тщательное отмывание срезов в растворе PBS трехкратно по 5 мин.

Для выявления признаков стеатоза печени применяли окрашивание на нейтральные жиры с помощью Oil Red O (Sigma, O0625), который окрашивает жиры в ярко-красный цвет. Для этого срезы печени инкубировали с изопропиловым спиртом в течение 10 мин, далее окрашивали стандартным рабочим раствором Oil Red O в течение 1 ч, тщательно промывали и окрашивали ядра гематоксилином в течение 5 мин. Срезы заключались в водорастворимую среду ImmuMount (Thermo Scientific, США). Результаты анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Сравнительное исследование печени экспериментальной и контрольной групп животных показало достоверное увеличение массы печени грызунов, содержащихся в течении 14 нед. на атрогенной диете, по сравнению с контрольной группой на 9±0,9% и 2,3±0,1% от массы тела соответственно.

При окрашивании микросрезов ткани печени Oil Red O выявлены признаки диффузного мелко- и крупнокапельного стеатогепатоза, больше выраженного в перипортальной области (рис. А, Б). В контрольной группе животных таких изменений не наблюдалось (рис. В).

При иммунофлуоресцентном окрашивании с антителами к CD45, общему маркеру лейкоцитов, выявлена массивная очаговая лейкоцитарная инфильтрация (рис. Ж). На микропрепаратах, окрашенных гематоксилином, также выявляются признаки диффузной и очаговой лейкоцитарной инфильтрации, преимущественно в перипортальных областях (рис. Б).

При микроскопии заметна выраженная деформация дольчатой структуры печени, расширение сосудов портальной системы. В зонах наибольших изменений при иммунофлуоресцентном окрашивании с антителами к коллагену выявляется его повышенная экспрессия, что является признаком развивающегося фиброза печени.

Также обнаруживается повышенная экспрессия про- (каспаза-3) и антиапоптотических (Bcl-2) факторов (рис. Г, Д). Патологические изменения в ткани печени более выражены в перипортальных областях.

При анализе срезов печени животных контрольной группы признаков стеатоза, очагов воспаления, апоптоза клеток и развивающегося фиброза выявлено не было (рис. 1В, Е, И).

Обсуждение

В данной работе впервые охарактеризованы экстра-аортальные изменения в организме мышей при содержании их на атерогенной диете. Показано, что при содержании мышей C57BI6 на атерогенной диете в течение 14 нед. развивается выраженная гепатомегалия (масса печени экспериментальных животных 9% от массы тела, в контроле – 2,3%).

Атерогенная диета приводит к выраженной деформации дольчатой структуры печени, очаговой и диффузной воспалительной лейкоцитарной инфильтрации, апоптозу гепатоцитов вдоль портальных трактов, микро- и макрокапельному стеатозу печени лабораторных животных.

Вышеописанная картина во многом аналогична таковой при неалкогольной жировой болезни печени. Это заболевание часто встречается у лиц с различными видами нарушения обмена веществ, ожирением, метаболическим синдромом, также способствующих развитию и усугублению атеросклеротического поражения сосудов. Таким образом, было показано, что печень не только активно участвует в патогенезе атерогенной дислипидемии, но и сама выступает в роли органа-мишени при нарушениях липидного обмена, и дислипидемия оказывает выраженное воздействие не только на процесс атерогенеза, но и на состояние печени.

Полученные данные позволяют использовать модель атеросклероза на мышах также и в качестве модели неалкогольной жировой болезни печени, а возможно и других патологий обмена веществ. Также данная модель позволяет исследовать взаимосвязь между нарушениями функции печени в сфере липидного и холестеринового обмена и развитием и прогрессированием атеросклеротического поражения сосудов.

Подняться вверх сайта