Поиск Кабинет

Овальные клетки — предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты?

Гены & Клетки: Том I, №2, 2006 год, стр.: 55-58

 

Авторы

Киясов А.П., Гумерова А.А., Титова М.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Цель работы - изучение закономерностей экспрессии маркеров овальных клеток в ходе пренатального гистогенеза печени крысы и человека, а также в гепатоцитах человека in vitro. Печень крыс получали на различных сроках гестации и в течение первого месяца после рождения. Эмбрионы и плоды человека получены в результате легальных медицинских абортов. Материал фиксировали и заливали в парафин по стандартной методике или готовили криостатные срезы, далее окрашивали иммуногистохимическим непрямым иммунопероксидазным и стрептавидин-биотиновым методами с использованием коммерческих моноклональных антител к цитокератинам-7, -8, -18, -19. Гамма-глутамил-транспептидазу выявляли гистохимически. Результаты исследований показали, что гепатобласты крысы и человека экспрессируют цитокератин-19 и гамма-глутамилтранс-пептидазу, тогда какхолангиоциты экспрессируют цитокератин-7 (и только с момента начала образования внутрипече-ночныхжелчных протоков). Более того, гепатоциты человека в условиях культивирования вновь начинают экспрессировать цитокератин-19. Полученные данные показывают, что маркеры овальных клеток (цитокератин-19 и гамма-глута-милтранспептидаза) являются маркерами дифференцирующихся гепатоцитов, что не позволяет отождествлять овальные клетки со стволовыми клетками печени.

Последние два десятилетия развития современной биологии и медицины по праву можно назвать прорывом в области изучения стволовых клеток. В настоящий момент ни у кого не вызывает сомнений, что большинство органов способны к регенерации, а клеточным источником восполнения утраченных в процессе жизнедеятельности или болезни клеток являются стволовые клетки органа. На фоне такого прорыва кажется невероятным, что в органе, способность к регенерации которого известна со времен античности из мифа о Прометее, до сих пор не найдена стволовая клетка.

Впервые вопрос о стволовой клетке печени был поднят в 1958 году J. Wilson и E. Leduc [1], которые изучали регенерацию печени мышей на фоне хронического повреждения метионином. Они установили, что при длительном хроническом повреждении печени целостность паренхимы может восстанавливаться, несмотря на отсутствие пролиферации гепа-тоцитов. На основании полученных данных было высказано предположение, что регенерация паренхимы может происходить за счет малодифференцированных «стволовых клеток», которые имеются в печени. Предположение J. Wilson и E. Leduc подтверждается многочисленными данными, которые к настоящему времени получены на различных экспериментальных моделях [2, 3, 4, 5]. Наиболее распространенными моделями активации стволового компартмента печени являются повреждение органа В-галактозамином [6], дипином [7, 8, 9], диэтилнитрозамином и ацетиламинофлуорином [10, 11]. При воздействии на печень перечисленных химических веществ нарушается целостность паренхимы и одновременно блокируется репопуляция гепатоцитов. На этом фоне в пери-портальных областях наблюдается интенсивная пролиферация мелких клеток с узким ободком цитоплазмы и овальным ядром. Эти клетки называют овальными клетками. Такие же клетки были найдены и в печени человека [12, 13, 14]. Очень часто овальные клетки отождествляют со стволовыми клетками печени - «putative hepatic stem cells» [15].

Овальные клетки имеют «смешанный» фенотип. Наряду с экспрессией альфа-фетопротеина, глютатион-Б-транс-феразы-Р, фетальных форм альдолазы, пируваткиназы и лактатдегидрогеназы, которые характерны для гепатоблас-тов и фетальных гепатоцитов, они, как и зрелые гепатоциты, синтезируют альбумин. Кроме того, они экспрессируют цитокератин (ЦКР) -19 и гамма-глутамилтранспептидазу (g-ГТП], характерные для холангиоцитов [6, 16, 17, 18]. Для выявления овальных клеток чаще всего используют антитела против ЦКР-19, а также гистохимическую реакцию на g-ГТП. Для идентификации популяции овальных клеток имеются и специально созданные моноклональные антитела, позволяющие маркировать эти клетки [19]. Широко используемыми являются моноклональные антитела OV-6 [20], которые связываются с компонентами цитоскелета овальных клеток и холангиоцитов, но не окрашивают гепатоциты, а также подобные им антитела к мембранному антигену А6 [9, 21]. Поскольку морфологически и по экспрессии ЦКР 19 и у-ГТП овальные клетки подобны холангиоцитам, а по своим биохимическим характеристикам они ближе к гепатоцитам плода [5], принято считать, что эти клетки бипотентны и могут давать начало и гепатоцитам, и холангиоцитам. Дополнительную информацию о происхождении, а главное - природе овальных клеток можно получить, если понять процессы, происходящие не только при регенерации органа, но и в ходе эмбрионального гистогенеза печени.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на белых лабораторных беспородных крысах. Для получения датированной беременности самок подсаживали на ночь к самцам. День обнаружения спермиев во влагалищных мазках считали первым днём беременности. Начиная с 14-х сут беременности крыс дека-питировали под эфирным наркозом, у плодов извлекали печень, готовили криостатные срезы. Кроме плодов крыс для исследования брали печень новорожденных, 1, 3, 6, 8, 9, 11, 13, 14-дневных и взрослых крыс.

Печень эмбрионов и плодов человека различных сроков гестации (начиная с 4-й недели эмбрионального развития] получали в результате легальных медицинских абортов. Также были изучены биоптаты печени больных хроническими гепатитами с минимальными патологическими изменениями в печени. Печень человека фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике.

Выделение и культивирование гепатоцитов человека проведено в лаборатории гепатологии Католического университета г. Леувена (Бельгия) под руководством проф. С.Х. Япа. Г епатоциты выделяли из донорской печени, непригодной для трансплантации, методом двойной перфузии раствором кол-лагеназы [22]. Клеточную суспензию дважды фильтровали через нейлоновые фильтры и центрифугировали. После второго центрифугирования клетки ресуспендировали в среде Williams E, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и противогрибковые препараты. Клетки культивировали в чашках Петри на покровных стеклах, покрытых печеночным биоматриксом [23]. Жизнеспособность выделенных клеток определяли по окрашиванию три-пановым синим. Фиксировали в абсолютном ацетоне через 1, 3, 5, 8, 13 и 17 дней культивирования и хранили при -20°С.

Срезы печени крысы и человека, а также покровные стекла с культурой гепатоцитов человека окрашивали иммуногистохимически непрямым иммунопероксидазным и стрептавидин-биотиновым методами с использованием коммерческих моноклональных антител и визуализацион-ных систем фирм DAKO (Дания), NOVOCASTRA (Великобритания). В работе использованы антитела к цитокератинам -7, -8, -18, -19. Гамма-глутамилтранспептидазу выявляли гистохимически [24].

Результаты и обсуждение

Экспрессия маркеров овальных клеток и холангиоцитов в онтогенезе

В печени взрослых крыс и человека иммунореактивность с антителами к ЦКР-7 и -19 наблюдали только в клетках как крупных, так и мелких внутрипеченочных желчных протоков. Продукт иммуногистохимической реакции был локализован только в цитоплазме холангиоцитов. Гепатоциты и другие клетки печени не окрашивались этими антителами (рис. 1А).

А. Печень крысы

В ходе пренатального онтогенеза крыс ЦКР-19-позитив-ные клетки впервые были выявлены в печени на 17-18-й дни гестации (рис. 1 Б). Эти клетки располагались на границе между паренхимой и клетками соединительной ткани вокруг ветвлений крупных приносящих сосудов печени. Окрашенные клетки морфологически были схожи с гепатоцитами. Начиная с 19-20-го дней гестации мы наблюдали экспрессию ЦКР-19 почти во всех клетках паренхимы печени. Наибольшее количество ЦКР-19-позитивных гепатоцитов наблюдали на 21-й день гестации и в первые дни постнатального развития (рис. 1 В). В течение первых двух недель постнатального онтогенеза количество гепатоцитов, экспрессирующих ЦКР-19, уменьшалось, а к концу второй недели этот ЦКР находили лишь в эпителиальных клетках желчных протоков.

Иммунореактивность с антителами против ЦКР-7 впервые была отмечена на 18-19-й дни гестации. ЦКР-7-позитивные клетки выявлялись сначала как единичные мелкие клетки, которые с 20-го дня гестации образовывали группы из нескольких клеток, а с 21-го дня можно было видеть хорошо выраженные холангиолы (рис. 1Г). Процесс формирования новых внутрипеченочных желчных протоков наблюдали не только в пренатальном онтогенезе, но и в течение первых недель постнатального развития. На всех сроках пре- и постнатального онтогенеза ЦКР-7 выявлялся только в клетках желчных протоков, и не было отмечено экспрессии этого белка в гепатоцитах. Что касается g-ГТП, то активность этого фермента в ходе пренатального онтогенеза печени крыс была отмечена как в гепатобластах и гепатоцитах (рис. 2 А), так и в мегакариоцитах. Таким образом, ЦКР-1 9 и g-ГТП не являются маркерами только холангиоцитарной дифференцировки.

Б. Печень человека

Было обнаружено, что экспрессия ЦКР-19 в пренатальной печени человека, как и в печени крыс, может иметь место при отсутствии ЦКР-7. До 16-й недели развития эмбриональные клетки паренхимы печени человека содержат в своей цитоплазме ЦКР-19 (рис. 2Б). С 11-12-й недели начиналось формирование внутрипеченочной системы желчных протоков. Клетки, экспрессирующие холангиоцитарные ЦКР, появлялись в области будущих портальных трактов. Сначала появлялись единичные клетки, а затем наблюдали группы клеток, содержащих в своей цитоплазме ЦКР-7 и -19. Окончательная дифференцировка протоков происходила в момент формирования трубчатых структур. Развитие желчных протоков не заканчивается в пренатальном онтогенезе, поэтому дифференцировку протоков наблюдали и в неонатальной печени.

Феномен транзиторной экспрессии холангиоцитарных [«bile duct specific») ЦКР в пре- и постнатальных гепатоцитах печени мыши был описан N. Shiojiri [25]. Однако японский исследователь использовал поликлональную кроличью сыворотку, не позволяющую распознать, какой именно ЦКР [7 или 19) присутствует в иммунопозитивных клетках. Наши результаты показывают, что можно говорить о транзиторной экспрессии лишь ЦКР-19 - одного из маркеров овальных клеток, который, является антигеном, на который реагируют моноклональные антитела «OV-6» [26]. Таким образом, фенотип овальных клеток соответствует фенотипу гепатобластов.

Экспрессия цитокератинов в первичной культуре гепатоцитов человека

Необычная для зрелых гепатоцитов экспрессия ЦКР-19 неоднократно отмечена при хроническом вирусном гепатите В и циррозе печени, в клетках гепатобластомы и гепатоцеллюлярной карциномы [27]. Появление ЦКР-19 в клетках гепатоцеллюлярной карциномы на фоне вирусного гепатита В рассматривается как активация стволового ком-партмента печени. То есть предполагается, что эти клетки являются потомками стволовой клетки, поскольку экспрессируют «эмбриональный ЦКР-19» [28]. В то же время было отмечено, что экспрессию ЦКР-19 можно наблюдать в пе-рипортальных дифференцированных гепатоцитах после массивных некрозов паренхимы [29, 30]. Понимание сущности феномена экспрессии ЦКР-19 в клетках паренхимы зрелой печени важно для правильной интерпретации событий. Если дифференцированные гепатоциты лишены возможности экспрессировать ЦКР-19, то появление в паренхиме клеток, которые содержат этот белок, на самом деле отражает активацию стволовых клеток печени. Это, в свою очередь, дает возможность использовать ЦКР-19 в качестве маркера стволового компартмента. Однако нельзя исключить, что гепатоциты в определенных условиях могут экспрессировать ЦКР-19 и, следователыю, наличие этого белка в клетках паренхимы не может быть строгим аргументом, позволяющим говорить об активации стволовых клеток. Для ответа на поставленные вопросы была изучена экспрессия ЦКР в первичной культуре гепатоцитов человека.

Иммуноцитохимический анализ культивируемых клеток показал, что в течение первых пяти дней основная масса выделенных и культивируемых клеток была представлена гепатоцитами, которые окрашивались только антителами к ЦКР-8 и -18. Иммунореактивность с анти-ЦКР-7 и -19 на этих сроках исследования наблюдали лишь в единичных мелких клетках. Последние, по-видимому, являются холан-гиоцитами, которыми была контаминирована суспензия выделенных гепатоцитов. Начиная с 8-го дня культивирования, мы наблюдали окрашивание гепатоцитов по типу цитоплазматической сети антителами против ЦКР-19 [рис. 2В). То есть, с конца первой недели культивирования гепатоциты, в дополнение к ЦКР-8 и -18, начинали экспрессировать ЦКР-19. Иммуноцитохимический анализ с анти-ЦКР-7 показал, что эти антитела реагируют только с холангиоцитами, которые на второй неделе культивирования образуют небольшие группы мелких клеток [рис. 2Г). На всех сроках исследования цитоскелет гепатоцитов не окрашивался антителами к ЦКР-7.

Реверсия эмбрионального фенотипа гепатоцитов, наблюдаемая in vitro, ставит под сомнение адекватность использования антител к ЦКР-19 как к белку, являющемуся линейным маркером холангиоцитов, и позволяет объяснить наблюдаемую при ряде заболеваний печени реэкспрессию этого белка гепатоцитами. Нарушение межклеточных взаимодействий в регенерирующей печени глубоко меняет фенотип клетки и экспрессию генов цитокератинов [31]. Такого рода нарушения могут инициировать экспрессию генов, которые не свойственны данному клеточному типу. Было отмечено, что в ходе дифференцировки клеток паренхимы экспрессия определенных генов зависит от плотности расположения гепатоцитов [32]. Культивируемые гепатоциты крысы, лежащие отдельно от монослоя, экспрессируют ЦКР и ви-ментин. Экспрессия последнего прекращается в момент установления клеткой механического контакта с другими гепатоцитами [33]. Результаты исследования показали, что в первичной культуре клеток паренхимы печени в гепатоцитах имеет место реэкспрессия ЦКР-19. Причиной подобной реэкспрессии может явиться нарушение механизмов межклеточных взаимодействий и изменение нормального микроокружения в условиях культивирования.

Практически одновременно с нашей публикацией [34], в J. Hepatology была опубликована статья немецких ученых [35], в которой также было показано, что in vitro в гепатоцитах человека начинается экспрессия ЦКР-19. Наше предположение о регуляции экспрессии гена ЦКР-19 межклеточными взаимодействиями между гепатоцитами было подтверждено культивированием клеток паренхимы в трехмерном коллагеновом «сандвиче». В этих условиях, когда имеет место трехмерное взаимодействие между клетками, гепатоциты не экспрессировали ЦКР-19.

Проведенный анализ экспрессии маркеров овальных клеток в печени крыс и человека в пренатальном онтогенезе показал, что и ЦКР-19 и g-ГТП являются нормальным фенотипическим признаком гепатобластов человека и дифференцирующихся гепатоцитов в печени крыс. Следовательно, экспрессия этих белков в овальных клетках подтверждает лишь, что они являются аналогами гепатобластов, и именно поэтому они экспрессируют также альфа-фетопротеин и альбумин. Полученные в нашем исследовании данные не противоречат тому, что в печени млекопитающих может существовать стволовая клетка. Кандидатом на эту роль могут быть не кроветворные стволовые клетки, а внутрипеченочная популяция [36], которая может быть среди клеток канальцев Геринга [37]. В то же время не следует ставить знак равенства между овальными клетками и стволовыми клетками печени. Откуда же точно происходят овальные клетки/гепа-тобласты и нет ли других кандидатов на роль региональной стволовой клетки печени, предстоит еще выяснить.

Подняться вверх сайта