Поиск Кабинет

Оценка стадий апоптоза и распределения фосфатидилсерина в мембране ядросодержащих клеток пуповинной и периферической крови при различных технологиях криоконсервации

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 50-54

 

Авторы

Бабийчук Л.А., Михайлова О.А., Зубов П.М., Рязанцев В.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Криоконсервация ядросодержащих клеток (ЯСК) пуповинной и периферической крови для последующего применения в клинической практике является единственно возможным способом их долгосрочного хранения. Целью работы была оценка стадий апоптоза и распределения фосфатидилсерина в мембране ЯСК после криоконсервации различными методами. Замораживание фракции ЯСК проводили под защитой криопротекторов различного механизма действия. Было показано, что выделение ЯСК в полиглюкине и последующее их замораживание с использованием криопротектора ДМСО (в конечной концентрации 5%), а также выделение клеток методом двухэтапного центрифугирования с последующим замораживанием с использованием криопротектора полиэтиленоксида (ПЭО, в конечной концентрации 10%), позволяют сохранить неповрежденными большинство клеток пуповинной и периферической крови. Криоконсервация ЯСК, выделенных с использованием фиколла, независимо от используемого криопротектора, приводит к существенному нарушению асимметричного распределения липидов в мембране и значительно снижает количество живых клеток. Установлено, что ЯСК пуповинной крови более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервации, чем клетки периферической крови, что проявляется в достоверных отличиях количества живых клеток практически во всех случаях до и после их криоконсервации.

В последнее время для лечения различных заболеваний системы крови все чаще используют гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), выделенные из пуповинной и периферической крови[1–3]. Широкое применение ГСК, которые входят в состав ядросодержащих клеток (ЯСК), стало предпосылкой к созданию банков крови, где образцы хранятся в жидком азоте или его парах (при -196°С ÷ -150°С) в течение длительного времени без потери их биологических свойств. Имея сложную внутриклеточную организацию, ЯСК крови нуждаются в тщательном подборе технологии криоконсервации, которая позволит сохранить функциональную активность кле ток после размораживания[1, 4–6].

Учитывая небольшие объемы пуповинной крови и трудности, связанные с получением ГСК из периферической крови, очень важной задачей является сохранение максимального количества клеток без потери их жизнеспособности и пролиферативной активности после криоконсервации. Это приводит к необходимости разработки новых и усовершенствованию существующих методов криоконсервации клеток[7].

Технология криоконсервации ЯСК крови состоит из нескольких этапов, каждый из которых является принципиально важным. Это связано с тем, что дестабилизация клеток на любом из этапов может привести к потере количества и функциональной активности клеток после криоконсервации и, как следствие, снижению клинической эффективности заготовленного препарата ЯСК. Одним из таких видов повреждения клеток может быть нарушение структурно-функциональных свойств их плазматической мембраны, и, прежде всего, изменение трансбислойного распределения липидов, что, в конечном счете, может отразиться на возможности реализации основных функций мембраны, таких как барьерная, транспортная и регуляторная. Нарушение асимметричного распределения фосфолипидов в плазматической мембране, которое сопровождается экстернализацией фосфатидилсерина во внешний монослой[8], служит сигналом для утилизации данных клеток макрофагами.

В то же время, наряду с нарушениями асимметричного распределения липидов, при криоконсервации может происходить нарушение целостности мембран и фрагментация ДНК клеток. Сочетанный анализ данных повреждений позволяет оценить общее состояние клеток в суспензии, а именно определить количество клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза и (или) некроза.

В связи с этим, целью данного исследования была оценка стадий апоптоза и распределения фосфатидилсерина в мембране ядросодержащих клеток пуповинной и периферической крови после криоконсервации различными методами.

Материал и методы

Объект исследования – ЯСК периферической и пуповинной крови человека, заготовленной на глюкозо-цитратном растворе. Пуповинную кровь получали из вены пульсирующей пуповины, после подписания роженицей добровольного информированного согласия.

Процедура криоконсервации ЯСК состоит из нескольких этапов: выделение фракции ЯСК из цельной крови, обработка клеток криопротектором и замораживание-размораживание.

Концентраты ЯСК выделяли несколькими методами: методом седиментации в 3% полиглюкине (ЯСК 1)[9], разработанным нами методом двухэтапного центрифугирования цельной крови с последующим получением концентрата ЯСК в аутоплазме (ЯСК 2)[10] и методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (ЯСК 3)[11].

В качестве криопротекторов в работе использовали: проникающий в клетку диметилсульфоксид (ДМСО) в конечной концентрации 5% и непроникающий (не требующий отмывания после размораживания[12]) полиэтиленоксид с м.м. 1500 (ПЭО) в конечной концентрации 10%, приготовленный на растворе 0,01 М фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,15М NaCl, pH 7.4.

Концентрат ЯСК 1 замораживали с использованием 5% ДМСО, концентрат ЯСК 2 – с использованием 10% ПЭО, а концентрат ЯСК 3 замораживали либо с 5% ДМСО, либо с 10% ПЭО.

Затем суспензию клеток переносили в криопробирки объемом 1,8 мл и замораживали до -196°С по специально разработанной двухэтапной программе на программном замораживателе CryoSON[13]. Размораживание осуществляли на водяной бане при 37°С.

Количество ЯСК определяли стандартным методом с помощью камеры Горяева[14]. Сохранность клеток определяли как отношение количества клеток в исследуемом образце (либо после обработки клеток криопротектором, либо после криоконсервации) к количеству клеток после выделения соответствующим методом, выраженное в процентах. Фенотипирование ядросодержащих (CD45+) клеток, определение степени нарушения асимметричного распределения фосфолипидов в мембране, а также оценку стадий апоптоза клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитометре FACS Calibur с использованием реагентов CD45+, AnnexinV FITC detection KIT I, 7AAD (Becton Dickinson, США). Данные проточной цитометрии оценивали с помощью программного обеспечения CELLQuest Pro (Becton Dickinson, США).

Стадии апоптоза клеток[15] оценивали при одновременном использовании маркера начальной стадии апоптоза, AnnexinV FITC, и витального ДНКкрасителя 7-аминоактиномицина D (7AAD), который проникает в клетки на поздних стадиях апоптоза или некроза, и не проникает в живые клетки с интактной мембраной[16].

AnnexinV – Са2+-зависимый фосфолипидсвязывающий белок с Мм 35–36 кДа, с высоким сродством к фосфатидилсерину. По связыванию AnnexinV с клетками, характеризующимися наличием на внешней стороне мембраны фосфатидилсерин, который в норме локализован только на внутренней стороне мембраны, можно судить о степени нарушения распределения липидов в бислое.

Данный метод позволяет идентифицировать четыре различных состояния клеток: живые клетки (AnnexinV¯7AAD¯-клетки), клетки, находящиеся на начальной стадии апоптоза (AnnexinV+7AAD¯клетки), мертвые клетки, находящиеся на стадии позднего апоптоза и (или) некроза (AnnexinV+7AAD+) и мертвые некротические клетки (AnnexinV¯7AAD+) Данные представлены в виде М±m, статистическую значимость различий между выборками оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с уровнем значимости р<0,05. Объем выборки составлял не менее 5 экспериментов.

Результаты и обсуждение

В наших предыдущих работах было показано[9], что после выделения клеток методом седиментации в полиглюкине и двухэтапным центрифугированием (ЯСК 1 и 2) сохранялась высокая жизнеспособность клеток, а изменения асимметричного распределения фосфолипидов в мембране практически не наблюдалось. Однако, при выделении клеток в градиенте плотности фиколла (ЯСК 3) отмечалось значительное снижение жизнеспособности клеток и изменение асимметричного распределения фосфолипидов в мембране.

В настоящее время наиболее широко используемым методом криоконсервации ЯСК пуповинной крови является метод с применением криопротектора ДМСО. В представленном исследовании, кроме данного метода, был применен безотмывочный метод криоконсервации ЯСК с использованием криопротектора ПЭО, эффективность которого была показана при замораживании цельной пуповинной крови[15].

Неотъемлемым параметром оценки эффективности методов криоконсервации является определение количества клеток как до, так и после замораживания-размораживания. Оценка данного параметра показала, что обработка криопротекторами клеток как пуповинной, так и периферической крови практически не влияла на их сохранность (рис. 1). Однако после этапа криоконсервации сохранность ЯСК 1 и 2 была значительно выше, чем ЯСК 3, независимо от типа использованного криопротектора как в периферической (рис. 1А), так и в пуповинной (рис. 1Б) крови. Анализ состояния плазматической мембраны ЯСК исследовали методом проточной цитофлуориметрии по связыванию белка AnnexinV с ядросодержащими клетками, который обладает высокоспецифичным сродством к отрицательно заряженным фосфолипидам, в частности к фосфатидилсерину, в норме находящемуся на внутренней поверхности бислоя клеточной мембраны[17].

Проведенные исследования показали, что на этапе обработки клеток криопротекторами в образцах ЯСК 1 и 2 существенных нарушений в распределении фосфатидилсерина не наблюдалось, в отличие от ЯСК 3, где доля AnnexinV+-клеток увеличивалась и была более выражена у ЯСК периферической крови (рис. 1).

Однако после криоконсервации были выявлены значительные нарушения в асимметричном распределении фосфолипидов в мембране, что особенно выражено для всех образцов ЯСК периферической крови, где выход фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны наблюдался у 20-30% клеток, и ЯСК 3 пуповинной крови, где процент AnnexinV+ клеток составлял порядка 15% (рис. 1).

В то же время, ЯСК 1 и 2 пуповинной крови были более устойчивыми к действию повреждающих факторов замораживания-размораживания: после криоконсервации ЯСК 1 доля AnnexinV+-клеток составляла порядка 7%, а у ЯСК 2 – около 10% (рис. 1). В дальнейших исследованиях был применен метод оценки стадий апоптоза клеток. Было показано, что обработка ЯСК криопротекторами (табл. 1) не приводила к значимому изменению количества клеток, находящихся на различных стадиях апоптоза и (или) некроза, по сравнению с клетками после вы деления соответствующими методами.

Необходимо отметить, что существенные отличия между периферической и пуповинной кровью наблюдались только в количестве клеток, находящихся на стадии позднего апоптоза/некроза (AnnexinV+7AAD+). Из табл. 1 следует, что ЯСК периферической крови обладают меньшей устойчивостью к изменениям физико-химических параметров среды в результате их обработки криопротекторами, что проявляется в достоверных отличиях количества живых клеток от таких же показателей пуповинной крови для всех исследуемых образцов, кроме ЯСК 1.

После замораживания-размораживания клеточных суспензий видно, что большая часть ЯСК 1 и ЯСК 2 остаются неповреждеными (табл. 2).

При этом в пуповинной крови данный показатель достоверно выше, чем в периферической, и составляет порядка 80 и 73%, соответственно (рис. 2). Такое высокое количество сохранных (см. рис. 1) и неповрежденных (табл. 2) клеток после замораживания-размораживания может свидетельствовать в пользу состоятельности данных методов криокон сервации.

Оценка стадий апоптоза и (или) некроза в клеточных суспензиях, выделенных с использованием фиколла (ЯСК 3), показала, что неповрежденными остаются всего около 50% клеток при замораживании с 5% ДМСО и порядка 40% клеток, замороженных с 10% ПЭО. Такая низкая доля живых клеток в препарате может стать причиной его неэффектив ности при клиническом применении.

Последующий анализ поврежденных клеток в препаратах показал, что в периферической крови количество ЯСК, находящихся на различных стадиях апоптоза и (или) некроза, менялось в зависимости от метода их выделения. Так, после криоконсервации ЯСК 1 и 2 поврежденные клетки практически равномерно распределялись между исследуемыми зонами апоптоза и (или) некроза. А после криоконсервации ЯСК 3 как с использованием ДМСО, так и ПЭО, более 30% клеток в образцах находилось в зоне некроза, до 20% клеток – на начальной стадии апоптоза, всего около 6% клеток – в состоянии позднего апоптоза и (или) некроза.

Повреждения ЯСК пуповинной крови имели другую направленность: как видно на рис. 2, независимо от метода криоконсервации, большинство поврежденных клеток характеризовалось нарушением целостности мембраны и фрагментацией ДНК при сохранении в ней упорядоченности фосфолипидов, что характерно для стадии некроза. Таким образом, видно, что основные потери клеток происходили в результате их быстрой гибели под влиянием повреж дающих факторов замораживания-размораживания, на которые клетки не могли или же не успевали от реагировать с помощью своих защитных систем. При этом очевидно, что независимо от способа криоконсервации, менее зрелые ЯСК пуповинной кро ви, обладали большей криоустойчивостью в отличие от более зрелых клеток периферической крови.

Заключение

Проведенные исследования показали, что выделение ЯСК в полиглюкине и последующее их замораживание с использованием 5% ДМСО, а также выделение клеток методом двухэтапного центрифугирования с последующим замораживанием с использованием 10% ПЭО, позволяют сохранить неповрежденными большинство клеток пуповинной и периферической крови.

Криоконсервация ЯСК, выделенных с использованием фиколла, независимо от используемого криопротектора, приводит к существенному нарушению асимметричного распределения липидов в мембране и значительно снижает количество живых клеток. Установлено, что ЯСК пуповинной крови более устойчивы к повреждающим факторам криоконсервации, чем клетки периферической крови, что проявляется в достоверных отличиях количества живых клеток практически во всех случаях до и после их криоконсервации.

Подняться вверх сайта