Поиск Кабинет

Оценка качества криоконсервированной ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» в Московском банке стволовых клеток

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 19-23

 

Авторы

Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Карпова Е.Э., Круглова Я.А., Боякова Е.В., Шахпазян Н.К., Гомзяков А.Е.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В статье проведен анализ качества криоконсервированной пуповинной крови (ПК) до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» в Московском банке стволовых клеток. Представлены биологические характеристики криоконсервированной пуповинной крови (клеточный состав, жизнеспособность клеток (CD45+7ADD-), количество CD34+-клеток), заготовленной для клинического применения. Показано, что после долгосрочного криохранения качество криоконсервированной пуповинной крови сохраняется, не изменяется и не зависит от срока криохранения, отмечается незначительное снижение количества ядросодержащих клеток, колониеобразующей активности. Выявлено, что на сохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения влияют метод их выделения, инициальные уровни гематокрита до криохранения и гемоконсерванта CPDA в пуповинной крови.

Опыт эффективных трансплантаций аллогенных гемопоэтических стволовых (ГСК) пуповинной крови (ПК) пациентам с различными заболеваниями показал, что ПК является полноценным источником клеток, способных обеспечить долгосрочное восстановление гемопоэза[1–7]. Использование ПК в качестве альтернативного источника клеток позволило существенно расширить возможности применения аллогенных ГСК, особенно для лечения тех пациентов, которым ранее данный вид терапии был недоступен (представители расовых и этнических меньшинств, длительное ожидание подходящего донора костного мозга). Ежегодно в мире проводится более 2–3 тыс. трансплантаций ПК пациентам с различными заболеваниями, в 2009 г. впервые число трансплантаций ПК превысило количество трансплантаций костного мозга[8].

Спустя 20 лет после первого успешного применения более 20 тыс. образцов ПК, полученных от родственных и неродственных доноров, были трансплантированы 14 тыс. пациентов[4, 9].

Успех трансплантаций аллогенных ГСК ПК во многом зависит от качества и безопасности заготовленного клеточного материала[2, 10–13]. Для восстановления биологических свойств ГСК и применения их в клинической практике криоконсервированная ПК должна быть «разморожена». Однако в процессе замораживания и размораживания в клетках могут возникнуть различные морфофункциональные повреждения (изменение формы и размера клеток, нарушение целостности мембраны, изменение конформации макромолекул), что снижает общее количество жизнеспособных и функционально активных клеток. Глубина этих повреждений напрямую зависит от технологии замораживания и размораживания клеточного материала[14]. Так как скорость восстановления гемопоэза и эффективность трансплантации ПК строго коррелирует с количеством и качеством трансплантируемых ядросодержащих клеток и клеток с CD34+ иммунофенотипом, оценка качества криоконсервированной ПК, находящейся на хранении, является одной из первостепенных задач, стоящих перед современными банками ПК[2, 8, 13, 15].

Целью нашего исследования являлось изучение качества криоконсервированной ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» в Московском банке стволовых клеток.

Материал и методы

Для определения факторов, влияющих на биологические характеристики (клеточный состав, жизнеспособность клеток (CD45+7-ADD), количество CD34+-клеток) и качество криоконсервированной ПК до и после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» было исследовано 600 образцов ПК.

Сбор ПК осуществляли при срочных или оперативных родах (37-41 нед.). Во время беременности все роженицы подписывали информированное согласие. ПК собирали в систему для сбора крови (Green Cross, Корея), содержащую стандартное количество гемоконсерванта CPDA (цитратно-фосфатно-декстрозно-адениновый раствор). Степень разведения образцов ПК гемоконсервантом CPDA зависела от объема собранной ПК.

Выделение клеток ПК с целью уменьшения объема обрабатываемого материала и удаления эритроцитов в асептических условиях проводили двумя способами:

– метод двойного центрифугирования (МДЦ): после первого центрифугирования ПК разделялась на три фракции – «клеточная плазма», лейкоцитарный слой и эритроциты, после второго – получали бесклеточную плазму и клеточный концентрат, содержащий ГСК, с помощью центрифуги «Cryofuge 5500i», (Heraeus, Германия) и автоматического плазмоэкстрактора «Auto Volume Expressor» (ThermoGenesis, США);

– метод автоматического выделения клеток (МАВК) с помощью клеточного сепаратора «Sepax S1000» (Biosafe, Швейцария).

После выделения ядросодержащих клеток непосредственно перед «замораживанием» в каждый образец пуповинной крови вводили криоконсервирующий раствор ДМСО в сочетании с декстраном-40 (или для оценки влияния комбинированных криопротекторов на качество пуповинной крови ДМСО в сочетании с реополиглюкином) в количестве 10% от объема конечного продукта. После этого все обработанные образцы ПК подвергали немедленной криоконсервации в автоматизированном криокомплексе «BioArchive®» (ThermoGenesis, США).

Изъятие и размораживание криоконсервированной ПК из автоматизированного криокомплекса «BioArchive®» для планового контрольного исследования проводилось ежегодно, согласно международным стандартам[16] и составляло 6% от всех заложенных образцов ПК.

Тестирование ГСК ПК

Оценивали следующие параметры (биологические характеристики) ПК до и после криохранения:

1) клеточный состав пуповинной крови, исследуемый при помощи автоматического гематологического анализатора ABX Pentra 60 C Plus (HORIBA ABX Diagnostics Inc., Франция), в режиме автоматической аспирации с определением 26 параметров, а также посредством морфологической оценки мазков, окрашенных по методу Паппенгейма – Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-красителем Мая – Грюнвальда и краской Романовского).

2) количество ГСК пуповинной крови оценивали по экспрессии мембранных маркеров в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами к CD34 и CD45 при помощи проточной цитометрии FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Количество CD34+ клеток в криоконсервированной ПК оценивалось в виде 2 параметров: доля от общего количества лейкоцитов и абсолютное количество CD34+-клеток в 1 мл ПК в одном образце.

3) жизнеспособность полученных ядросодержащих клеток пуповинной крови оценивали с помощью проникающего в клетку красителя 7-ADD, связывающегося с ДНК, с определением количества CD45+ клеток, негативных по реакции с 7-ADD, на проточном цитофлуометре FACSCalibur.

4) колониеобразующая способность ГСК пуповинной крови, которую определяли с помощью культивирования клеточной суспензии в метилцеллюлозе в течении 14 сут. при температуре 37°С в СО2 инкубаторе с подсчетом количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1×105: КОЕ-ГМ – гранулоцитарных-макрофагальных, КОЕ-Г – гранулоцитарных, КОЕ-М – макрофагальных, КОЕ-Эр – эритроцитарных, КОЕ-mix – смешанных. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл пуповинной крови полученные величины КОЕ умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

Выполняли HLA-типирование образцов ПК, для чего выделяли ДНК из клеток с использованием автоматизированной системы KingFisher, проводили молекулярные методы типирования с применением ПЦР обратным дот-блотингом методом SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) и с помощью аллель-специ-фических праймеров (Sequence Specific Primer).

В процессе обработки ПК определяли групповую принадлежность и осуществляли инфекционный контроль.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программ Microsoft Excel, Biostat 2009, OpenEpi 2.3. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Средний срок криохранения образцов ПК составил 3,5±1,3 лет, средний объем криоконсервированных образцов – 20,1±1,0 мл. Доля гемоконсерванта CPDA в криоконсервированной ПК составил 30,3±0,3%. Процент содержания ДМСО в криоконсервированной ПК – 10,0±0,3%.

Был проанализирован клеточный состав 600 образцов ПК до и после криохранения. Абсолютное количество ядросодержащих клеток ПК статистически значимо снижалось после криохранения и составило 3,7±1,0×107/мл и 3,1±0,8×107/мл соответственно (р = 0,02). Процент сохранения ядросодержащих клеток после криохранения составил 87,0±13,3%. Жизнеспособность (CD45+7AAD-) ядросодержащих клеток ПК до (99,3±4,3%) и после криохранения (97,9±7,4%) практически не изменялась. Абсолютное количество мононуклеарных клеток криоконсервированной ПК не изменялось после криохранения. Количество нейтрофилов до и после криохранения ПК статистически значимо снижалось с 1,8×107/мл до 1,4×107/мл (р = 0,03), процент сохранения составил 78,6±21,2%. Абсолютное количество CD34+-клеток после криохранения ПК снижалось с 0,13±0,08×106/мл до 0,09±0,05×106/мл (р = 0,035), и сохранение CD34+-клеток составило 93,7±5,3%.

При оценке КОЕ клеток ПК было показано, что количество колоний КОЕ-mix, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-ГМ и КОЕ-Эр после криохранения ПК в автоматизированной системе «BioArchive®» снижалось (табл.). В ряде зарубежных научных работ были представлены данные по оценке биологических свойств криоконсервированной ПК после размораживания на небольшом количестве образцов ПК. Так, в исследовании итальянских ученых сохранение ядросодержащих клеток (40 криоконсервированных образцов ПК из 40 различных банков ПК) после размораживания составило 78,9±15,4%, из них жизнеспособных клеток 85,5±10,6%, средний срок криохранения – 43,3±26,2 мес.[17]. Аналогичное исследование было выполнено в Японии при оценке качества 54 криоконсервированных образцов ПК из 9 различных банков ПК. Было показано, что процент сохранения ядросодержащих клеток, CD34+-клеток и КОЕ-ГМ составил 96,0±11,3%, 83,0±17,0% и 88,6±41,2%, соответственно[18].

Похожее исследование было проведено в Украине. Авторы показали высокий уровень сохранения ядросодержащих клеток и CD34+-клетокв жизнеспособном состоянии – до 98% и 94–98%, соответственно, а также высокий уровень колониеобразующей способности клеток ПК (общее количество колоний составило 247,6±36,8). Однако в данном исследовании отсутствовала информация о количестве размороженных образцов ПК, их количестве и сроках криохранения[19].

В отечественной литературе было проведено единственное исследование 231 образца ГСК ПК в зависимости от различных способов криоконсервирования и сроков хранения. Было установлено, что для максимального сохранения ГСК ПК в жизнеспособном состоянии криоконсервирование необходимо проводить в программном замораживателе, длительное криохранение должно осуществляться в диапазоне температур -130°С ... -196°С, количество ГСК с иммунофенотипом CD34+/CD45+ в образце ПК прямо пропорционально исходному количеству ядросодержащих клеток[20].

Оценка качества ПК до и после криохранения в зависимости от метода лейкоконцентрации

Все образцы пуповинной крови были разделены на две группы в зависимости от метода лейкоконцентрации: МАВК (n = 256), МДЦ (n = 344). При анализе клеточного состава пуповинной крови в зависимости от метода лейкоконцентрации было выявлено, что процент сохранения нейтрофилов ПК после криохранения был статистически значимо ниже в группе МДЦ 80,21±2,10% по сравнению с группой МАВК 85,31±3,80% (р = 0,0006). При оценке количества жизнеспособных ядросодержащих клеток (CD45+7AAD-) до и после криохранения ПК двумя методами лейкоконцентрации в обеих группах статистически значимых различий выявлено не было.

Процент сохранения CD34+-клеток ПК после криохранения был достоверно выше в группе МАВК 95,61±4,7% по сравнению с группой МДЦ 84,52±5,1% (р = 0,042) (рис.).

При оценке колониеобразующей способности ПК до и после криохранения в группах МАВК и МДЦ статистически значимых различий различий выявлено не было.

Похожее исследование было выполнено во Франции в 2007 г., в котором был показан высокий уровень сохранения ядросодержащих и CD34+клеток при обработке ПК с помощью МАВК – сохранение ядросодержащих клеток достигало 80%, CD34+-клеток – 86%[21]. Однако в данном исследовании не проводилась комплексная оценка всех биологических характеристик ПК до и после криохранения: клеточный состав, жизнеспособность ядросодержащих клеток, колониеобразующая способность ГСК ПК.

До настоящего времени в отечественной литературе отсутствовали публикации о влиянии данных методов на биологические характеристики и качество криоконсервированной ПК после размораживания.

Оценка качества ПК до и после криохранения в зависимости от уровня гематокрита

Все размороженные образцы ПК были разделены на две группы в зависимости от инициального уровня гематокрита в криоконсервированной ПК: низкий уровень – от 12% до 39% (n = 286); высокий уровень гематокрита – от 40% до 69% (n = 314). Процент сохранения ядросодержащих клеток ПК после хранения в группе с высоким уровнем гематокрита был выше 89,51±4,54%, чем в группе с низким уровнем – 84,83±4,98% (р = 0,01). При анализе мононуклеарных клеток, нейтрофилов и эритроцитов ПК до и после криохранения в зависимости от уровня гематокрита ПК статистически значимых различий выявлено не было.

При оценке жизнеспособности ядросодержащих клеток ПК (CD45+7AAD-) до и после криохранения в группах с низким и высоким уровнем гематокрита ПК достоверных различий также не было установлено. Процент сохранения CD34+-клеток в группе образцов с низким уровнем гематокрита был значимо выше, чем в группе с высоким уровнем гематокрита – 96,32±3,46% и 90,06±5,83% соответственно (р = 0,006).

При оценке колониеобразующей способности ГСК

ПК до и после криохранения было показано, что процент сохранения колониеобразующей способности ГСК в группах с низким и высоким уровнем гематокрита статистически значимо не менялся. Полученные нами данные противоречат аналогичному исследованию, проведенному в Испании, в котором было выявлено, что колониеобразующая способность ГСК ПК с высоким уровнем гематокрита (45%) снижалась до 40% по сравнению с ПК с низким уровнем гематокрита (23%) – 64%[11].

Оценка качества ПК до и после криохранения в зависимости от уровня гемоконсерванта CPDA

Учитывая, что процентное содержание гемоконсерванта CPDA в каждом образце ПК индивидуальное, все размороженные образцы были разделены на две группы в зависимости от уровня гемоконсерванта: низкий уровень CPDA – от 15 % до 29% (n = 236); высокий уровень CPDA – от 30% до 60% (n = 364). Статистически значимых различий при оценке абсолютного количества ядросодержащих клеток, нейтрофилов, эритроцитов ПК и процента их сохранения до и после криохранения в зависимости от концентрации гемоконсерванта CPDA выявлено не было. Также различий не было показано при сравнении количества жизнеспособных ядросодержащих клеток ПК после криохранения при различном содержании CPDA.

Процент сохранения CD34+-клеток ПК в группе с высоким уровнем CPDA был достоверно выше, по сравнению с группой с низким уровнем CPDA 99,0±0,3% и 88,5±0,6% соответственно (р = 0,012).

Колониеобразующая способность ГСК ПК в группах с высоким и низким уровнем CPDA до и после после криохранения статистически значимо не изменялась.

Оценка качества ПК до и после криохранения в зависимости от сроков криохранения

Все образцы ПК после изъятия из автоматизированной системы «BioArchive®» были разделены на две группы в зависимости от сроков криохранения: короткий – от 1 года до 3 лет (n = 352), длительный – 4 до 6 лет (n = 248).

При сравнении биологических характеристик ПК (клеточный состав, жизнеспособность (CD45+7AAD-), количество CD34+-клеток и колониеобразующая способность) в обеих группах статистически значимых различий не было выявлено, т.е. криоконсервированная ПК после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» сохраняла свои биологические свойства (качество) независимо от срока хранения.

Полученные нами результаты согласуются с данными других исследователей. В исследовании, проведенном в Японии, было установлено, что стандартные протоколы криоконсервирования ГСК ПК в жидком азоте с использованием криопротектора ДМСО в конечной концентрации 10% и методов программного замораживания позволяют в течение десятилетий сохранять более 80% ядросодержащих клеток и 90% гемопоэтических стволовых клеток в жизнеспособном состоянии[22]. Эти данные были подтверждены в исследованиях H.E. Вroxmeyer с соавт. (1999, 2009), которые показали также высокий процент сохранения ядросодержащих клеток ПК и клеток-предшественниц гемопоэза после 10, 15 и 24 лет хранения в жидком азоте[9, 22].

Выводы

1. Установлено, что качество криоконсервированной ПК после долгосрочного криохранения в системе «BioArchive®» сохраняется. Отмечается незначительное снижение количества ядросодержащих клеток и нейтрофилов; CD34+-клеток; колониеобразующей способности ГСК ПК.

2. Криоконсервированная ПК, полученная методом автоматического выделения клеток после долгосрочного криохранения, содержит больше нейтрофилов и CD34+-клеток, по сравнению с криоконсервированной ПК, полученной методом двойного центрифугирирования.

3. Криоконсервированная ПК с инициальным уровнем гематокрита от 12% до 39% после долгосрочного хранения содержит больше CD34+-клеток и меньше ядросодержащих клеток по сравнению с криоконсервированной ПК с инициальным уровнем гематокрита от 40% до 69%.

4. Криоконсервированная ПК с инициальным уровнем гемоконсерванта CPDA от 30% до 60% после долгосрочного криохранения содержит больше CD34+-клеток и меньше мононуклеарных клеток, по сравнению с криоконсервированной ПК с инициальным уровнем CPDA от 15 % до 29%.

5. Показано, что качество криоконсервированной ПК после долгосрочного криохранения в системе «BioArchive®» не зависит от срока хранения.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что ПК, криоконсервированная в Московском банке стволовых клеток, после криохранения сохраняет свои биологические характеристики и практически не изменяет их после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», является качественным альтернативным источником ГСК и может быть рекомендована к использованию в клинической практике.

Подняться вверх сайта