Поиск Кабинет

Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивированных при различном содержании кислорода

Гены & Клетки: Том IV, №3, 2009 год, стр.: 52-57

 

Авторы

Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р., Валюшкина М.П., Дурнова Г.Н., Логинов В.И., Анохина Е.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследовано влияние введения костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) на формирование костной мозоли после экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс. Протестированы клеточные препараты ММСК, предкультивированных в условиях нормок-сии (20% 02, 5% С02, 75% N^ и пониженного содержания кислорода (5%0г, 5% С0г, 90% NРабота выполнена на 32 крысах-самцах линии Вистар, которые были разделены на 4 группы по 8 животных в каждой в зависимости от воздействия после перелома: 1 — контроль, без каких-либо дополнительных воздействий, 2 — введение в зону повреждения культуральной среды без факторов роста, 3 — введение суспензии (0,25 мл, 5x105 ММСК] клеток, культивированных в стандартных условиях, 4 — введение такого же количества ММСК, культивированных при пониженном содержании кислорода. Гистоморфо-метрический анализ костной мозоли на 14 сут. после операции продемонстрировал достоверное увеличение коэффициента утолщения в 1,2—1,3 раза у животных, которым вводили клеточные препараты, по сравнению с контролем. При этом объём костной мозоли у крыс экспериментальных групп был также в 1,3—1,4 раза больше (р<0,05). Это происходило, главным образом, за счёт увеличения объёма хряща, более выраженного при введении ММСК, культивировавшихся в условиях пониженного содержания кислорода. Таким образом, введение ММСК способствовало увеличению объёма новообразованных тканей на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе трубчатой кости у крыс.

В настоящее время, в связи со стремительным развитием клеточных подходов в регенеративной и восстановительной медицине, все больший интерес привлекает возможность получения в короткий срок достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток in vitro. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), которые могут быть выделены из костного мозга, являются в настоящее время наиболее востребованными для репарации различных тканевых дефектов в связи с их высокой пролиферативной активностью в условиях in vitro и способностью к остеогенной, адипогенной, хондрогенной дифференцировке и, возможно, ангиогенной активностью [1—5]. Способность ММСК к дифференцировке в остеогенном направлении дала основание предполагать, что их применение при лечении переломов и повреждений больших участков костей может улучшить процесс заживления, что и было продемонстрировано в ряде исследований [6—8].

Ранее мы показали, что культивирование ММСК из костного мозга крыс в условиях пониженного содержания кислорода приводит к увеличению их пролиферативной активности и повышению устойчивости к различным повреждающим факторам [5]. В настоящей работе мы исследовали влияние введения ММСК, культивируемых при различном содержании 02, на формирование костной мозоли в области экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс.

Материал и методы

В работе использовали среду роста: —-MEM (ICN, США] с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 1 мМ пирувата натрия, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 10% фетальной коровьей сывороки (ФКС) (Hyclone, Новая Зеландия) для культивирования клеток; 20 тМ фосфатный буфер (ФБ) (Gibco, США) для отмывки клеток; 0,02% раствор трипсина с 0,05 % ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки.

Получение и культивирование ММСК из костного мозга. Клетки выделяли из костного мозга бедренной кости 1,5 месячной крысы-самца линии Вистар, по описанной ранее методике [5]. Культивирование выделенных ММСК проводили в С02-инкубаторе в газовой смеси — 20% 02, 5% С02, 75% N2. После первого пассажа часть клеток помещали в С02—инкубатор (N-MMCK), а другую часть — в мультигазовый инкубатор, в котором поддерживалась газовая среда гипоксического состава — 5% 02, 5% С02 и 90%. I\l2 (HYP-MMCK).

В экспериментах по изучению регенеративного потенциала ММСК были использованы клетки второго пассажа.

Для анализа прироста клеток в культуре использовали метод видеомикроскопии. С помощью микроскопа Leica DM IL (объектив х10) (Leica, Germany), снабженного цифровой видеокамерой, изображение архивировали и впоследствии в каждом флаконе анализировали 10 стационарных полей зрения площадью 1,0 мм2 каждые 24 ч, начиная с первых сут. после посадки и до момента пассирования. Клетки подсчитывали с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США). Количество клеточных удвоений рассчитывали по формуле:

Иммунофенотип ММСК на втором пассаже был охарактеризован с помощью моноклональных антител к следующим маркерным молекулам: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, США), а жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).

Клеточные препараты. Для приготовления клеточных препаратов ММСК отделяли от пластика трипси-низацией, инактивировали фермент добавлением среды роста, после чего клетки ресуспендировали в необходимом количестве культуральной среды, не содержащей сыворотку. Транспортировку и хранение клеточных препаратов осуществляли на льду в течение 2—4 ч при температуре +4°С. Перед введением клеточного препарата клетки ресуспендировали и отбирали необходимую аликвоту.

Экспериментальная модель операционного перелома малой берцовой кости у крыс. В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Вистар (32 особи весом около 300 г.). Программа исследования была одобрена Комиссией ГНЦ РФ-ИМБП РАН по биомедицинской этике. Наркотизация животных осуществлялась путём введения в левую икроножную мышцу 0,1% атропина в количестве, соответствующем весу животного (согласно инструкции производителя). Затем в эту же мышцу вводили «Золитил-100» в дозе 8 мг/кг (согласно инструкции производителя). После того, как животное переставало реагировать на раздражение, его фиксировали, выстригали шерсть в зоне планируемого операционного вмешательства и трижды обрабатывали 3% спиртовым раствором йода и 96% спиртом и проводили рассечение кожи в средней части голени [9].

Далее экспериментальные животные были разделены на 4 группы. Животным 1-й группы проводили операционный перелом (группа П) без каких-либо последующих дополнительных воздействий. Животным 2-й группы после перелома в зону повреждения и прилежащую мышечную ткань вводили 0,25 мл среды роста без ФКС (группа П + С). Животным 3-й группы — 0,25 мл (группа N-MMCK), крысам 4-й группы — 0,25 мл среды па П + НУР-ММСК). После операции раны послойно зашивали. В пред- и послеоперационный период животные содержались в стандартных условиях вивария. В периоде реабилитации подвижность животных была в пределах нормы.

Гистологический анализ. Оценку состояния костной мозоли у животных проводили через 14 сут. после оперативного вмешательства. Наркотизированных крыс де-капитировали, выделяли оперированную кость и очищали её от «мягких тканей». Отделяли зону костной мозоли и фиксировали в 4% парафармальдегиде на 0,1 М ФБ (pH 7,0—7,2) с 2,5% сахарозы при +4°С. После фиксации в течение 10 сут. проводили декальцинацию в 10% ЗДТА (pH 7,0—7,2). Затем образцы обезвоживали, заливали в гистопласт и готовили срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, то-луидиновым синим, пикрофуксином. Далее на срезах определяли объем костных мозолей, объем хрящевой ткани и объем новообразованной кости при помощи программы «МОП-ВИДЕОПЛАН», после чего рассчитывали коэффициент утолщения по формуле: диаметр костной мозоли / диаметр нативной кости.

Статистический анализ. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием Г-кри-терия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Культивирование при пониженном содержании кислорода приводило к двукратному увеличению пролиферативной активности ММСК. На 6 сут. культивирования число клеточных удвоений при пониженном содержании кислорода (5%) составляло 4,02+0,9, а в обычных условиях (20% 02) — 1,9+0,3, что согласуется с ранее полученными данными [5].

Культивируемые N-MMCK и Нур-ММСК различались морфологически: в культурах N-MMCK на первом пассаже преобладали сильно распластанные клетки, а среди НУР-ММСК было больше мелких вытянутых клеток (рис. 1). Иммунофенотипирование клеток к маркерам, специфичным для ММСК: CD90 (99,8—100%), CD54 (99,5-98,9%), CD73 (94,70-99,8%), CD44 (96,397,0%), не выявило различий между N-MMCK и НУР-ММСК. Те и другие клетки были негативны по ге-мопоэтическим маркерам CD11b (0,39—1,25%), CD45 (0,35—1,43%). Жизнеспособность N-MMCK и НУР-ММСК в исследуемых культурах также не отличалась и + 3,98% некротических клеток).

Визуальный осмотр костей экспериментальных животных показал, что у крыс всех 4-х групп в месте перелома произошло образование веретенообразных костных мозолей различной величины, достаточно прочно скрепляющих проксимальный и дистальный отломки костей.

Гистологическое исследование области перелома у животных контрольной и экспериментальных групп позволило установить, что консолидация костных отломков во всех случаях шло по типу вторичного заживления. Костная мозоль состояла из эндостальной части, соединяющей костные отломки и представляющей собой фиброзную ткань, и периостальной части, включающей хрящевую ткань, балки ретикулофиброзной кости и фиброзную ткань. Во всех исследуемых группах в эндостальную часть были включены дистальные и/или проксимальные отломки малоберцовой кости. В большинстве случаев отломки были смещены друг относительно друга. Балки ретикулофиброзной костной ткани располагались проксимально и дистально относительно хряща. Поверхность трабекул покрывали остеобласты. Таким образом, на срезах во всех исследуемых группах можно было видеть участки тканей, характерных для костной мозоли (рис. 2), соотношение которых было различным в сравниваемых группах.

В группе П периостальная часть костной мозоли состояла из массива хрящевых клеток и широкопетлистой ретикулофиброзной костной ткани. На границе ретикулофиброзной кости и хряща новообразованная кость содержала большое количество сосудов и остеокластов. В центре трабекул, на границе с хрящом, наблюдались мелкие изогенные группы хрящевых клеток. Пространство между некрозированными участками кости было заполнено фиброзной тканью, врастающей со стороны эндоста (см. рис. 2А).

У животных группы П + С, костная мозоль в качественном отношении не отличалась от группы П, но количественные различия были довольно значительными. Размеры костной мозоли у крыс группы П + С были больше, чем у группы П, в основном за счёт увеличения объёма хрящевой части периостальной мозоли. Сосудистая сеть в этой группе была слабо развита (см. рис. 2Б).

В группе П + НУР-ММСК размеры костной мозоли у крыс были наиболее крупными по сравнению с костной мозолью животных других групп. Увеличение размеров костной мозоли происходило за счёт разрастания хрящевой ткани, в которой определялись врастающие со стороны внутренних слоёв надкостницы пучки соединительной ткани (см. рис. 2В). Кроме того, соединительная ткань обнаруживалась в толще самого хряща в виде отдельных островков. Со стороны молодой костной ткани в хрящевую ткань внедрялись пальцевидные костные отростки, которые замещали разрушающийся хрящ. На поверхности отростков наблюдались остеобласты, а между отростками — многочисленные кровеносные сосуды. В трабекулах молодой кости часто находились единичные хондроциты. Эндостальная мозоль, в основном, состояла из клеток молодой костной ткани.

У животных группы П + N-MMCK объём хрящевой ткани был меньше, чем у крыс группы П + НУР-ММСК. В целом костная мозоль походила на таковую у крыс группы П + НУР-ММСК и отличалась только меньшими размерами (см. рис. 2Г).

Результаты количественного гистометрического анализа костных регенератов, которые подтвердили гистологические наблюдения, представлены в таблице.

Как следует из таблицы, объем хрящевой ткани у крыс в группах П + С, П + N-MMCK и П + НУР-ММСК по сравнению с контрольными животными (группа П) достоверно увеличивался, что хорошо совпадает с увеличением объема костных регенератов в этих же группах животных. В группах П + N-MMCK и П + НУР-ММСК коэффициент утолщения превышал значения такового как по сравнению с контрольной группой П, так и группой П + С. При этом коэффициент утолщения у крыс группы П + НУР-ММСК был больше, чем у животных П + N-MMCK, хотя это отличие и не было статистически значимым. Что же касается объема новообразованной костной ткани, заместившей хрящевую ткань периостальной костной мозоли, то различий в сравниваемых группах не наблюдалось.

Суммируя данные гистологических и гистоморфомет-рических исследований, следует констатировать, что у крыс с переломом малоберцовой кости, которым вводили ММСК, был увеличен размер развившейся костной мозоли, причем это увеличение было несколько больше в группе животных, которым инъецировали ММСК, выращенные в гипоксической среде.

В настоящее время возможность использования технологий клеточной и тканевой инженерии для улучшения заживления и восстановления функциональной активности ткани при различных повреждениях опорнодвигательного аппарата привлекает все больший интерес [1, 4, 8]. Поиск в этой области ведется в основном по двум направлениям: совершенствование носителей для доставки клеточного материала в область повреждения и направленное изменение свойств самих клеток, вводимых в область дефекта. Изменение свойств клеток может осуществляться как с помощью введения дополнительного генетического материала [10], так и за счет модификации свойств клеток, вызванных изменением параметров окружающей их среды [11]. Улучшение регенерации костной ткани после введения в область дефекта ММСК было продемонстрировано в ряде исследований, результаты которых обобщены в обзорах [1, 2, 8].

В нашей работе основной задачей было выяснить будут ли ММСК, культивированные в условиях различного содержания кислорода, влиять на параметры заживления костных дефектов. В связи с этим мы выбрали хорошо охарактеризованную модель экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс [9], которым непосредственно в область перелома сразу после хирургического вмешательства вводили суспензию N- или НУР-ММСК в малом объеме культуральной среды.

Введение ММСК экспериментальным животным при различных повреждениях, таких как острая почечная недостаточность [12], блеомицин-индуцированное повреждение легких [13], дефекты хряща [14], костнохрящевые дефекты [15] и др. приводит к улучшению различных параметров регенерации тканей. Показано, что использование в таких случаях ММСК, предварительно культивированных в гипоксической среде, усиливает эффект, по сравнению с введением нормоксических ММСК. В частности, после введения НУР-ММСК более выражены ангиотропные и васкулотропные проявления в различных моделях ишемии (ишемия нижних конечностей у мышей [15] и др.).

Ранее мы показали, что культивирование ММСК в среде с пониженным содержанием кислорода стимулирует пролиферацию этих клеток и снижает способность к остеогенной дифференцировке, что позволяет получить большее количество малодифференцированных клеток за меньшее время [5]. Мы предположили, что введение таких клеток в область костного дефекта малоберцовой кости может оказаться более эффективным для регенерации костного дефекта, чем введение ММСК, культивированных общепринятым методом при 20% 02. Такой эффект мог бы быть обусловлен более быстрым увеличением клеточной массы за счет пролиферации и более активного участия клеток в регенерации из-за того, что их коммитирование может быть замедлено. Однако, через 14 сут. после операции стимулирующее влияние на регенерацию малоберцовой кости крыс двух сравниваемых клеточных препаратов достоверно не различалось, хотя выявлена тенденция к более выраженным эффектам после введения HYP-MMCK.

Таким образом, проведенное нами исследование продемонстрировало эффективность введения суспензии ММСК, предварительная экспансия которых проведена in vitro в условиях различного содержания кислорода, для улучшения формирования костно-хрящевого регенерата на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе малоберцовой кости у крыс. Однако, вопрос о том, как повлияет введение ММСК на поздние этапы регенерации при переломе трубчатых костей, является предметом дальнейшего изучения.

Подняться вверх сайта