Поиск Кабинет

Особенности ассоцированного со старением секреторного фенотипа гастроинтестинальных опухолей (ГИСТ)

Гены & Клетки: Том IX, №3, часть «Б», 2014 год, стр.: 173-178

 

Авторы

Рамазанов Б.Р., Бойчук С.В., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Целью исследования стало изучение механизма кле точного старения и ассоциированного со старением секре торного фенотипа опухолевых клеточных линий в ответ на генотоксическое воздействие доксорубицина.

В исследовании использовали следующие клеточные линии: фибробласты человека линии BJ, клетки остеосар комы человека линии U-2 OS и клеточную линию гастро интестинальной стромальной опухоли GIST-T1. Генотокси ческий стресс индуцировали внесением доксорубицина в концентрации 0,25 мкг/мл. Продолжительность инкубации клеток с химиопрепаратом составляла 5 ч. Наличие двуни тевых разрывов в клетках оценивали по уровню экспрес сии и фокальному накоплению фосфорилированой формы гистона 2А (γ-H2AX), a запуск сигнальных путей репара ции двунитевых разрывов ДНК оценивали по фокальному распределению фосфорилированной формы АТМ-киназы (pATM Ser1981). Синтез опухолевыми клетками интер лейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-8 (ИЛ-8) оценивали методом ИФА на 3, 6, 9, 12 сут. культивирования после 5-часовой экспозиции с доксорубицином.

Установлено, доксорубицин индуцирует повреждения ДНК, что запускает процессы клеточного старения. Вы явлено, что результатом воздействия доксорубицина на фибробласты человека и опухолевые клетки U-2 OS явля ется значительное и время-зависимое увеличение уровня секреции цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8, в то время как GIST-T1 в аналогичных условиях секретируют исключительно ИЛ-6. В отличие от нетрансформированных клеток, опухолевые клетки после экспозиции с доксорубицином претерпевают необратимое повреждение ДНК, активацию программы кле точного старения и продуцируют провоспалительные цитоки ны (Ил-6, 8). Связанный со старением секреторный фенотип в клетках ГИСТ-Т1 отличается от фенотипа, выявленного у других раковых и нормальных клеток. Это может быть при нято во внимание в ходе разработки новых методов лечения пациентов с GIST-T1.

Активация многочисленных путей репарации по вреждений ДНК, так же, как и запуск программы клеточного старения являются общепризнанными барьерами опухолевой трансформации клеток[1]. Известно, что одним из главных факторов, иници ирующим каскад реакций, направленных как на ре парацию повреждений ДНК, так и активацию про граммы клеточного старения является повреждение ДНК, именуемое как «генотоксический стресс»[2]. Клетки, подвергающиеся старению, характеризу ются рядом особенностей: остановкой клеточного цикла, изменением морфологии клеток и органи зации хроматина, повышением активности СА-β галактозидазы в цитоплазме, а также секрецией провоспалительных цитокинов, хемокинов, ростовых факторов и протеаз[3]. В то время как индукция процессов старения в ответ на генотоксическое действие химиопрепаратов и лучевой терапии направлена на относительно быстрое подавление пролиферации опухолевых клеток, сам процесс клеточного старения является достаточно протяженным во времени и сопровождается секрецией множества факторов, которые позже были объединены в название «секреторный фенотип, ассоциированный со старением» (от англ. – senescence associated secretary phenotype (SASP)). Показано, что через секрецию данных факторов стареющие клетки способны оказывать влияние на свое микроокружение, в том числе, воздействовать на процессы пролиферации, дифференцировки и выживания соседних клеток[4]. В результате вокруг стареющих клеток могут создаваться благоприятные условия для роста и размножения клеток, в том числе, для клеток со злокачественным фенотипом[5]. Таким образом, с одной стороны, процесс клеточного старения следует считать важным механизмом, предотвращающим пролиферацию потенциально злокачественных клеток. С другой стороны, наличие у стареющих клеток секреторного фенотипа может оказывать противоположный эффект и вызывать усиление пролиферации опухолевых клеток различного происхождения[6].

Одним из основных компонентов секреторного фенотипа, ассоциированного со старением, являет ся продукция провоспалительных цитокинов, в част ности, интерлейкина-6 (ИЛ-6) и 8 (ИЛ-8). Извест но, что ИЛ-6 является цитокином широкого спектра действия и способен регулировать процессы про лиферации, дифференцировки, а также выживания клеток[7]. Интерлейкин-8 хорошо известен как фактор хемотаксиса нейтрофилов, в качестве кле ток-мишеней данного хемокина могут выступать и эндотелиальные клетки, миграция и пролиферация которых определяет эффективность процессов не оангиогенеза, что, в свою очередь, играет важную роль в кровоснабжении и метастазировании опу холей[8]. Установлено, что секреторный фенотип стареющих клеток, а именно экспрессия интерлей кина-6 может зависеть от функциональной актив ности белков системы распознавания и репарации повреждений ДНК, а именно киназ ATM, NBS1 и CHK2, но не зависит от активационного статуса белка р53[9]. Данные провоспалительные цитоки ны совместно с некоторыми онкогенами способны принимать активное участие в процессах канцеро генеза[10, 11]. Несмотря на достаточно обширные представле ния о роли процессов старения как анти-раковом барьере, так и факторе опухолевой прогрессии, мо лекулярные механизмы регуляции данного процес са, а также факторов, определяющих секреторный фенотип стареющих клеток, остаются не до конца изученными. В настоящем исследовании была пред принята попытка изучить пусковые механизмы кле точного старения и особенности секреторного фено типа нормальных и опухолевых клеток различного происхождения.

Материал и методы

В исследовании использовали следующие кле точные линии: фибробласты человека линии BJ, клетки остеосаркомы человека линии U-2 OS и кле точную линию гастроинтестинальной стромальной опухоли GIST T1. Культивирование клеток проводи ли с использованием соответствующих питательных сред (DMEM и RPMI, ПанЭко, Россия) с содержа нием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), антибиотиков и L-глутамина (ПанЭ ко, Россия). Генотоксический стресс индуцировали внесением доксорубицина (Sigma, США) в концен трации 0,25 мкг/мл. Продолжительность инкубации с химио-препаратом составляла 5 часов, после чего клетки 5-кратно отмывали от препарата полной куль туральной средой и культивировали в течение после дующих 10 дней.

Возникновение двунитевых разрывов ДНК и ак тивацию сигнальных репаративных путей проводи ли методом иммунофлюоресцентной микроскопии (Olympus BX63F) по оценке фокального распреде ления фосфорилированных форм гистона 2А по остаткам серина 139 (γ-H2AX) и АТМ-киназы (рАТМ S1981), соответственно. С этой целью были исполь зованы моноклональные АТ к фосфорилированным формам гистона 2А (H2AX Ser139, Millipore, США), АТМ-киназы (pATM Ser1981, Rockland, США). В ка честве вторичных антител использовали антитела, меченые Alexa-Fluor-488 (Invitrogen, США) и Cy3+ (Jackson ImmunoResearch, США).

Изменения в уровне экспрессии белков γ-H2AX, ламина В1 и актина до и после воздействия химио препарата также оценивали методом иммуноблот тинга с использованием соответствующих антител (Cell Signaling, Santa Cruz и Abcam, cоответственно). Для выявления двунитевых разрывов ДНК и акти вации репарации возникших повреждений оценива ли уровень экспрессии фосфорилированных форм гистона 2А (H2AX Ser139) и АТМ-киназы (pATM Ser1981) (Cell Signaling и Abcam, соответственно). Накопление СА-β-галактозидазы в клетках оце нивали с помощью реагента X-gal (5-бромо-4-хлоро 3-индоил-бета-D-галактозида) по общепринятой методике. Изменение морфологии клеток регистри ровали на микроскопе Leica DM IL (Германия). Синтез опухолевыми клетками интерлейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-8 (ИЛ-8) оценивали мето дом ИФА (Вектор-Бест, Россия) на 3, 6, 9, 12 сут. культивирования после инкубации с доксорубицином (Sigma, США).

Результаты и обсуждение

Было обнаружено, что кратковременная (в течение 5 ч) инкубация всех вышеперечисленных опухоле вых клеточных линий с ингибитором топоизомеразы II типа доксорубицином и последующее их культиви рование в питательной среде индуцирует процесс их клеточного старения, о чем свидетельствовали как время-зависимое изменение морфологии клеток и увеличение их размеров, так и накопление в их цито плазме фермента β-галактозидазы (рис. 1). Извест но, что данный фермент накапливается в лизосомах и других органеллах клеток в процессе клеточного старения, и осуществляет функцию деградации (рас щепления) дефектных биомолекул[12]. Поэтому, повышение уровня экспрессии β-галактозидазы в клетках в настоящее время рассматривается в каче стве одного из основных маркеров клеточного ста рения[13].

Предполагается, что одним из главных факторов, запускающих процесс клеточного старения, являет ся наличие нерепарируемых повреждений ДНК. Для подтверждения правомочности данной гипотезы, был проведен анализ уровня экспрессии гистона 2А, фосфорилированной по остаткам серина в по ложении 139 (γ-Н2AX), являющегося, как известно, общепризнанным маркером повреждений ДНК, а именно, двунитевых разрывов. Было показано, что в клетках остеосаркомы человека линии U-2 OS (в от личие от нетрансформированных клеток, например, фибробластов линии BJ), после кратковременного воздействия на них доксорубицина происходит тран зиторное снижение уровня экспрессии γ-H2AX, но дальнейшее культивирование клеток приводит к су щественному повышению уровня экспрессии данного маркера (рис. 2). Важно отметить, что аналогичные результаты были получены и на других опухолевых клеточных линиях, например, на клетках гастроинте стинальных стромальных опухолей ГИСТ-Т1.

Этот факт свидетельствует о несостоятель ности репаративных процессов в исследованных нами опухолевых клетках. Примечательно, что по вышение уровня экспрессии γ-H2AX в опухолевых клетках находилось в обратной зависимости от уровня экспрессии ядерного белка ламина B1. Ис следования последних лет показали, что уровень экспрессии данного белка в клетках снижается при запуске механизмов старения, индуцированных раз личными стимулами, такими как экспрессия онкогена, повреждений ДНК и пр.[14]. Следовательно, сни жение уровня экспрессии данного белка может яв ляться одним из универсальных маркеров клеточного старения.

Очевидно, что анализ уровня экспрессии белков не может отражать реакции каждой индивидуальной клетки в ответ на повреждение ДНК, а, следователь но, не исключает возможности развития процессов старения в опухолевых клетках без признаков гено токсического стресса. В то же время, в ряде случаев уровень экспрессии определенных белков в индиви дуальных клетках может быть очень высоким и, тем самым, нивелировать тенденцию изменений уровня экспрессии белков в общей популяции клеток.

Поэтому, для получения прямых доказательств о причинно-следственной связи между возникнове нием нерепарируемых повреждений ДНК (а имен но, двунитевых разрывов) и клеточным старением была произведена оценка уровня экспрессии γ-H2AX и морфологических на уровне индивидуальных кле ток с помощью метода иммунофлюоресцентной микроскопии.

Результаты проведенных исследований показали, что на 5-е сут. после транзиторной индукции повреж дений ДНК химиопрепаратом, в опухолевых клетках происходят значительные морфологические изме нения, которые сопровождаются фокальным распре делением γ-H2AX (рис. 3Б). Фосфорилированная форма гистона 2А экспрессировалась исключитель но в клетках с признаками старения, в то время как в клетках контрольной группы, а также в клетках с неизмененной морфологией в опытной группе ана логичных изменений не наблюдалось (рис. 3А и 3Б, соответственно). Примечательно, что часть клеток с признаками старения погибала по механизму апо птоза (рис. 3В), в то время как оставшиеся в живых клетки продолжали длительное время оставаться жизнеспособными и экспрессировать данную форму гистона. Было также отмечено, что в клетках с при знаками старения фокальное распределение γ-H2AX имеет высокий процент ко-локализации с фосфори лированной формой АТМ-киназы (рис. 4), что сви детельствовало о несостоятельности эффекторных механизмов репарации повреждений ДНК в опухоле вых клетках несмотря на активацию игнальных путей повреждений ДНК.

Учитывая литературные данные, свидетельствую щие о корреляции между повышенным уровнем экс прессии интерлейкина-6 и функциональной активно стью систем распознавания/репарации повреждений ДНК (особенно двунитевых разрывов), логичным, на наш взгляд, являлось изучение уровня секреции определенных цитокинов (в первую очередь, ИЛ-6) в нашей экспериментальной модели.

Нами было выявлено, что фибробласты человека линии BJ и опухолевые клетки U-2 OS даже в физио логических условиях секретируют фоновые уровни ИЛ-6 и ИЛ-8, что было подтверждено методом ИФА (иммуноферментного анализа) к данным цитокинам (рис. 5). Кратковременная инкубация клеток с док сорубицином вызывала значительное повышение концентрации вышеперечисленных цитокинов в су пернатантах клеточных культур. Тем не менее, мы обнаружили, что в то время как клетки линии остео саркомы U2-OS наряду с ИЛ-6 также секретировали повышенные количества ИЛ-8, клетки GIST-T1 не обладали аналогичной способностью.

Обнаруженные нами различия в секреторном фе нотипе, ассоциированном с процессами старения, между опухолевыми клетками остеосаркомы и га строинтестинальных стромальных опухолей, вызы вает безусловный интерес и может обуславливать особенности патогенеза данных заболеваний. Сле дует отметить, что ИЛ-8 имеет важное прогности ческое значение в терапии злокачественных ново образований, повышение его уровня способствует инвазивному росту и прогрессированию опухолей[15]. Было установлено, что ИЛ-8 через связыва ние с рецепторами CXCR1 и CXCR2 способен акти вировать тирозинкиназы Сrs и FAK (от англ. p125 focal adhesion kinase), тем самым усиливать проли ферацию, выживаемость, миграцию и инвазивность опухолевых клеток, а также приводить к химиорези стентности[16, 17]. ИЛ-8, продуцируемый опухоле выми клетками, усиливает метастазирование опухо левой ткани, а через индукцию и дифференцировку остеокластов способен приводить к остеолитической диссеминации некоторых типов рака молочной желе зы[18]. Продукция данного цитокина в опухолевых клетках может носить аутокринный или паракринный характер и служить «спасательным» механизмом для опухолевых клеток от стресс-индуцированного апоптоза[19].

Следует принимать во внимание, что основные виды нехирургического лечения больных со злокаче ственными новообразованиями основаны на индук ции в опухолевых клетках генотоксического стресса (химио- и радиотерапия) и могут вызвать состояние клеточного старения, сопровождающееся снижени ем опухолевой массы и роста. В то же время се креторный фенотип клеток, находящихся в данном состоянии, может существенным образом повышать риск рецидива и прогрессии злокачественных новообразований[20].

Заключение

Несостоятельность репаративных процессов и, как следствие, персистирующее повреждение ДНК в опухолевых клетках являются факторами, обу славливающими запуск программы клеточного ста рения. Запуск процессов старения в клетках сопро вождается существенным изменением секреторного фенотипа, проявляющегося в повышенной секреции цитокинов ИЛ-6 и -8. Ассоциированный со старени ем секреторный фенотип клеток опухолевой линии GIST-T1 имеет свои особенности, которые могут вно сить вклад в патогенез гастроинтестинальных стро мальных опухолей (ГИСТ).

Подняться вверх сайта