Поиск Кабинет

Оптимизация условий получения и ведения культур фибробластов кожи и десны человека

Гены & Клетки: Том IX, №2, 2014 год, стр: 53-60

 

Авторы

Зорин В.Л., Копнин П.Б, Зорина А.И., Еремин И.И., Лазарева Н.Л., Чаузова Т.С., Самчук Д.П., Петрикина А.П., Еремин П.С., Корсаков И.Н., Гринаковская О.С., Котенко К.В., Пулин А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для определения оптимальных условий получения культуры фибробластов из биопсийных образцов кожи и десны человека проведена сравнительная оценка 11 сывороток эмбрионов (плодов) крупного рогатого скота различных производителей, аутосыворотки человека, а также 3 бессывороточных (serum-free media, SFM) и 4 низко-сывороточных (serum-reduced media, SRM) образцов среды. Критерием оценки на этапе получения первичной культуры служила эффективность колониеобразования (эКО), а на последующих пассажах – время удвоения (T1/2) клеточной популяции фибробластов.

Результаты показали, что в зависимости от используемой сыворотки и питательной среды способность фибробластов кожи (Фк) формировать колонии может меняться в 4 и более раз, а фибробластов десны (Фд) в 1,5–1,8 раза. Проведенный клональный анализ показал, что фибробласты в культуре формируют три типа колоний, отличающихся по количеству и морфологии клеток. Соотношение типов колоний меняется в зависимости от используемой среды. При культивировании клеток установлено, что при использовании одной и той же среды (DMEM) добавление разных сывороток обеспечивает различное время удвоения клеточных популяций Фк и Фд.

В целом, успех получения первичной культуры фибробластов обусловливается, в первую очередь, выбором питательной среды и сыворотки, обеспечивающими формирование крупных клеточных колоний, представленных фракцией быстро пролиферирующих клеток. При дальнейшей экспансии культуры главным становится использование сред, обеспечивающих высокую скорость роста клеточной популяции.

Введение

В последние несколько лет методики, основанные на использовании клеточных технологий, активно внедряются в клиническую практику в различных областях медицины [1–6]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСКкм) являются наиболее изученным и широко используемым в регенеративной медицине типом клеток. В качестве адекватной замены ММСКкм многими исследователями рассматриваются фибробласты, выделенные из кожи (Фк) и десны (Фд) человека [7–14]. В соответствии с нашими предварительными экспериментами получение значительного количества фибробластов (~108 клеток) из небольшого (3–4 мм3) биопсийного образца делится на два этапа. Первый этап заключается в получении первичной культуры фибробластов и существенно зависит от состава культуральной среды, в которой должны содержаться ростовые факторы, обеспечивающие размножение эксплантированных в низкой плотности клеток. Второй этап, заключающийся в экспансии первичной культуры в условиях высокой плотности посева (~104 кл./см2), также определяется ростовыми компонентами культуральной среды, но в значительно меньшей степени, по-видимому, в силу способности самих фибробластов синтезировать ряд факторов роста: фактор роста кератиноцитов (keratinocyte growth factor, KGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), инсулиноподобный фактор роста (insulin-like growth factor, IGF) и фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF) [15]. Традиционно источником ростовых факторов в культуральной среде является фетальная сыворотка крупного рогатого скота (fetal bovine serum, FBS). Свойства сыворотки в силу множества факторов, влияющих на ее состав при производстве, могут значительно варьировать [16], что отражается на получении первичной культуры фибробластов.

В настоящее время в мировой практике наблюдается тенденция к замещению FBS аутосывороткой, использованию низкосывороточных сред и сред, вообще не содержащих компонентов животного происхождения [17, 18]. Получение материала в таких условиях является предпочтительным для клеточной терапии. Для выбора оптимально подходящей для культивирования клеток среды и сыворотки в данной работе проведено сравнение различных образцов по критериям эффективности колониеобразования (эКО) фибробластами человека и времени последующего удвоения (Т1/2) полученных культур.

Материал и методы

Получение первичной культуры фибробластов кожи и десны человека. Здоровым донорам (n = 10, в возрасте 25–45 лет) после получения информированного согласия под местным обезболиванием 2% раствором лидокаина проводили биопсию кожи заушной области, а также слизистой оболочки полости рта (десны) в ретромолярной области. Объем биоптата составлял 3–4 мм3. Ткани помещали в стерильные пробирки (BD Falcon, США) с транспортировочной питательной средой (DMEM/F12, 2% FBS (HyClone, США), 200 ед./мл пенициллина, 200 мг/мл стрептомицина, 200 ед./мл амфотерицина (Stem Cell Technology, Канада)), маркировали и доставляли в течение 2 ч при температуре +4°С в лабораторию. Для получения аутосыворотки в день биопсии забирали 40–50 мл венозной крови из кубитальной вены.

Ткани биоптатов подвергали ферментативной обработке 0,05% коллагеназой II типа (Sigma, США) при температуре 37°С в течение 12 ч. Полученную суспензию клеток пипетировали с последующим центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали и полученные суспензии одиночных фибробластов культивировали при 37°C, 5% CO2 в стандартной культуральной среде DMEM (Sigma, США) с добавлением 20% сыворотки FBS Defined (HyClone, США), 40 мкг/мл гентамицина (Sigma, США) в течение 14 сут. В дальнейшем клетки снимали с поверхности флаконов 0,05% раствором трипсина (Sigma, США) и пассировали с плотностью 104 кл./см2 в той же культуральной среде, но с уменьшенным до 10% содержанием сыворотки. Клетки пассировали при достижении культурой 80–90% монослоя. Замену среды осуществляли каждые 3 сут. В работе использовали культуральную посуду фирмы Corning-Costar (США).

Иммунофлуоресцентный анализ. Выделенные фибробласты на четвертом пассаже высевали на покровные стекла и культивировали в течение 2–3 сут. После этого для визуализации актина культуры клеток окрашивали фаллоидином, специфично связывающим F-формы цитоскелета фибробластов, с флуоресцентной меткой (Invitrogen, США). Количество актина измеряли на микроскопе Axioplanтм 200 (Carl Zeiss, Германия) с камерой Axiocamтм HRm (Carl Zeiss, Германия), используя для обработки изображений программное обеспечение AxioVisionтм (Carl Zeiss, Германия).

Тестирование сывороток и сред по критерию эффективности колониеобразования фибробластов (эКО) кожи и десны. эКО оценивали на 4 пассаже. Фибробласты эксплантировали с низкой плотностью (3–4 кл./см2) и культивировали в течение 14 сут. в среде DMEM с 20% содержанием тестируемых сывороток (табл. 1). В случае тестирования низкосывороточных (MesenPro, AdvMEM, AdvDM, AdvDM-F12) и бессывороточных (StemPro, Panserin 401, Panserin 411) сред (табл. 2) фибробласты предварительно адаптировали к условиям культивирования по предлагаемой производителями схеме.

Затем клетки снимали с пластика и высевали в указанной выше плотности и культивировали в течение 14 сут. в исследуемых средах. эКО определяли по стандартной методике: колонии окрашивали красителем KaryoMAX® Giemsa Stain Stock Solution (Gibco, США), подсчитывали количество образовавшихся колоний, определяли количество и форму составляющих их клеток. При подсчетах не учитывали колонии, содержавшие менее 50 клеток.

Определение времени удвоения (T1/2) популяции фибробластов. Фибробласты эксплантировали в плотности 104/cм2 и культивировали до достижения культурой 90% монослоя. Подсчет клеток производили в камере Горяева. Время удвоения популяции оценивали по формуле:

где N – число клеток, посеянных в начале культивирования; Tк – длительность культивирования одного пассажа в часах; Nк – конечное число клеток через Тк. В качестве оценочного параметра использовали средние значения, полученные на 4, 5 и 6 пассажах. Cтатистический анализ. Обработку результатов проводили по U-критерию Манна – Уитни при p<0,05 (GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software).

Результаты

Предварительно был охарактеризован иммунофенотип используемых в работе клеток, который оказался схожим с фенотипом ММСКкм. По данным проточной цитофлуориметрии культуры фибробластов характеризовались отсутствием гемопоэтических (CD34, CD45) и эпителиальных (цитокератины 14–16, 19) и наличием мезенхимных (CD73, CD90, CD105) поверхностных маркеров. При иммуноцитохимическом анализе установлено, что клетки также экспрессировали внутриклеточные белки фибробластов – коллаген I и III типов, эластин и виментин. Фк и Фд человека не отличались между собой как по общим маркерам мезенхимальных клеток, так и по специфическим маркерам фибробластов (рис. 1).

Влияние культуральных сред и сывороток на эКО кожи и десны. В зависимости от используемой сыворотки (см. табл. 1) эКО Фк варьировала от 13±2% до 51±8%, а Фд – от 34±20% до 75±6% (рис. 2). Такие различия позволили разделить сыворотки на две группы. Сыворотки первой группы – FBS MSC, FBS SA, FBSrg, FBSch и FBSdef способствовали высокой эКО обоих видов фибробластов (51±8% Фк и 75±6% Фд), сыворотки второй группы – Fetcl3, FBS ESC, FBS USA, FBS EU и FBS gold характеризовались низкой эКО Фк (10±1%) и умеренной эКО Фд (42±13%). Низкая эКО как Фк, так и Фд наблюдалась при использовании FCS. Аутологичная сыворотка крови HuS обеспечила среднюю по величине эКО Фк (31±3%) и Фд (54±4 %) (см. рис. 2). В бессывороточных средах (StemProMSC, Panserin 401 и Panserin 411 (см. табл. 2)) Фк практически не образовывали колоний (4±2%). эКО в средах со сниженным содержанием сыворотки (AdvMem, MesenProMSC) и среде Q333 составила для Фк и Фд соответственно 26±4 и 54±2 %.

Типы колоний Фк и Фд человека и влияние сывороток и культуральных сред на образование различных типов колоний. В ходе анализа эКО отмечено, что Фк и Фд формируют колонии, отличающиеся между собой по морфологическим признакам входящих в их состав клеток и по размерам. Нами выделены следующие типы колоний: полиморфно-клеточные колонии, состоящие из 100±50 полиморфных фибробластов; веретеновидно-клеточные колонии, состоящие из 1500±500 и 2500±500 веретеновидных Фк и Фд соответственно; и смешанные колонии, состоящие из 500±200 и 1000±300 веретеновидных и полиморфных Фк и Фд соответственно (рис. 3).

Анализ образования колоний при культивировании клеток в присутствии сывороток второй группы (Fetcl3, FBS ESC, FBS USA, FBS EU и FBSgold) показал, что все типы колоний Фк формируются с одинаково низкой эффективностью 5±2%, а Фд в среднем в пять раз эффективнее формировали веретеновидно-клеточные колонии (28±10%). В то же время формирование смешанных и полиморфно-клеточных колоний Фд было также неэффективно (6±3%) (рис. 4).

Использование сывороток первой группы (FBSdef, FBSch, FBSrg, FBS MSC и FBS SA) в среднем в 3–4 раза улучшало эффективность формирования веретеновидно-клеточных колоний Фк (36±7%) и в 5–10 раз Фд (67±9%) в сравнении с эффективностью формирования смешанных колоний (9±4%) (рис. 4). При использовании HuS эффективность образования веретеновидно-клеточных колоний Фк (19±2%) и Фд(43±4%) была соответственно в 2 и 4 раза выше по сравнению со смешанными (9±1% – для Фк и Фд). Полиморфноклеточные колонии практически не формировались как Фк (2±1%), так и Фд (2±1%).

Среди сред с низким содержанием сыворотки только MesenProRS и AdvMem поддерживали образование веретеновидно-клеточных колоний Фк с эффективностью соответственно 23±8% и 13±6%, а таких колоний Фд – с эффективностью 41±4% и 41±15% соответственно (см. рис. 4). Эффективность формирования других видов колоний оказалась низкой и составляла 3±2 % как для Фк, так и для Фд. Влияние сыворотки на среднее время удвоения популяции фибробластов. Среднее время удвоения в зависимости от сыворотки варьировало для популяции Фк от 34±1 ч до 67±2 ч, а для популяции Фд – от 28±1 ч до 64±1 ч (табл. 3).

Использование аутосыворотки (HuS) приводило к наименьшему среднему времени удвоения популяции Фк и Фд (за 34±1 и 28±1 ч соответственно). Из всех сывороток крупного рогатого скота сыворотки эмбрионов (плодов) коров FBS ESC и FBSdef обеспечивали самое быстрое удвоение популяции Фк (41±2 ч и 47±1 ч соответственно) и Фд (37±1 ч и 42±1 ч соответственно). Наименее эффективными оказались сыворотки FBS MSC, Fetcl3 и FBS USA, при использовании которых время удвоения Фк составило от 65±4 до 67±2 ч и Фд от 55±1 до 64±1 ч (см. табл. 3).

Время удвоения популяций Фк и Фд в бессывороточной среде Panserin411 составляло 55±5 и 54±5 ч соответственно, в среде StemProMSC рост клеток был существенно медленнее, для удвоения популяции Фк и Фд требовалось соответственно 72±7 и 66±7 ч. В низкосывороточных средах advDM/F12, advMEM и advDM время удвоения было сравнимо со временем удвоения в среде, содержащей такие сыворотки как FBS EU, FCS, FBSrg, FBSch, FBS SA и FBSgold (табл. 3). Наиболее эффективной низкосывороточной средой в наших условиях оказалась MesPro, обеспечившая такое же время удвоения популяций (44±4 и 36±3 ч для Фк и Фд), как и наиболее эффективная по эКО среда, содержащая FBSdef. Полная среда Q333, созданная для культивирования фибробластов, обеспечила скорость удвоения популяции Фк 50±5 ч и Фд 48±3 ч (см. табл. 3).

Обсуждение

Влияние сыворотки на колониеобразование, типы колоний и время удвоения популяции фибробластов. Выделение первичной культуры фибробластов из биопсийного материала небольшого объема всегда сопряжено с существенными трудностями. В связи с этим возможность получения значительного количества клеток определяется условиями культивирования, подбором оптимальной культуральной среды и, во многих случаях, сыворотки. Основными требованиями к качеству сывороток являются отсутствие токсических и иммуногенных агентов, а также наличие ростовых факторов [17]. Сыворотка, обозначаемая как Newborn Bovine Serum (NBS) или Newborn Calf Serum (в публикациях иногда обозначают как FCS), производится из крови телят, собранной в первые две недели после рождения. Такая сыворотка обычно содержит более 15 г/л IgG и более 65 г/л общего белка, что делает ее чрезвычайно иммуногенной для человека. Сыворотка эмбрионов (плодов) коров (Fetal Bovine Serum, FBS), как правило, содержит не более 1 г/л IgG и 0,5 г/л общего белка и большое количество ростовых факторов, позволяющих эффективно размножать клетки млекопитающих [17]. Чаще всего для получения первичных культур используют именно FBS. Однако необходимо учитывать, что свойства различных партий FBS значительно варьируют, что существенно влияет на клоногенную активность и скорость пролиферации фибробластов. Отмечено, что даже партии сыворотки одного производителя могут отличаться друг от друга, приводя к существенному изменению основных параметров культуры [16].

Полученные в нашей работе результаты по величинам эКО Фк и Фд позволили разделить все сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота на две группы. Cыворотки первой группы – FBSdef, FBSrg, FBSch, FBS MSC и FBS SA обеспечивали высокую эКО Фк и Фд (51±8% и 75±6% соответственно). Фибробласты десны в этих условиях формировали в 1,5 раза больше колоний, чем фибробласты кожи. эКО при использовании сывороток второй группы – Fetcl3, FBS ESC, FBS USA, FBS EU и FBS gold оказалась совсем низкой для Фк (10±1%), но вполне допустимой для Фд (42±13%). Исходя из нашего опыта, использование в качестве источника ростовых факторов сывороток первой группы – FBSdef, FBSrg, FBSch, FBS MSC и FBS SA, позволяет наиболее эффективно решить задачу первого этапа. При этом Фд формировали в 4 раза больше колоний, чем Фк. Способность Фд формировать колонии в меньшей степени, чем у Фк, зависела от входящей в культуральную среду сыворотки. эКО Фк отличалась при использовании сывороток двух групп в 4,8 раза, тогда как эКО Фд для этих сывороток отличались только в 1,7 раза.

Оценка используемых сывороток по времени удвоения популяций Фк и Фд в среде DMEM при плотности посева 104/cм2 позволила разделить их на три группы. Быстрое удвоение обеспечивалось такими сыворотками как FBS ESC, FBSdef, FBSrg, FBS EU и FCS, среднее по скорости – сыворотками FBS SA, FBSch, FBSgold, а самое медленное – сыворотками FBS MSC, Fetcl3 и FBS USA. Cыворотки FBSch, FBS MSC и FBS SA, обеспечивая высокую эКО, не способствовали максимальной скорости пролиферации фибробластов. Наоборот, быстрое удвоение популяции наблюдалось при использовании сывороток, которые не поддерживали высокую колониеобразующую активность ни одного вида фибробластов, а именно FBS ESC, FBS EU и FCS. Высокая эКО Фк и Фд и минимальное время получения нужного количества клеток обеспечивалось только при использовании FBSdef. Таким образом, по нашему мнению, оценка эКО и времени удвоения популяции (Т1/2) фибробластов являются необходимыми оценочными параметрами для выбора сыворотки и питательной среды для получения фибробластов для клеточной терапии.

эКО и пролиферативная активность культуры фибробластов в условиях использования аутологичной сыворотки, бессывороточных и низкосывороточных сред. Существующая в настоящее время тенденция в использовании питательных сред направлена на исключение из их состава сывороток животного происхождения из-за возможной контаминации патогенными агентами [16]. В этой связи предпочтение отдается специализированным бессывороточным средам или средам со значительно сниженным содержанием сыворотки. В качестве альтернативы FBS рассматриваются такие компоненты, как тромбин-активированный тромбоцитарный лизат, тромбоцитарно-обогащенная плазма, пулированная сыворотка IV группы крови [17, 18].

В нескольких работах было отмечено, что замена FBS в питательной среде на сыворотку или плазму человека, не приводит к снижению скорости пролиферации ММСКкм [19–22].

Полученные нами данные показали, что HuS обеспечивала среднюю эКО и превосходила использованные в работе FBS в 1,3–2,0 раза по влиянию на скорость пролиферации Фк и Фд. На уровне HuS поддерживали образование колоний среды с десятикратно сниженным содержанием сыворотки (SRM) – MesenProRS и AdvMem, тогда как эКО в средах AdvDMEM и AdvDMEM/F12 была невысокой. Полное отсутствие сыворотки в среде оказалось существенным для колониеобразования. Так, в средах StemProMSC, Panserin 401 и Panserin 411 (SFM) фибробласты теряли способность образовывать колонии. К тому же в среде StemPro MSC SFM удвоение популяции Фк и Фд было очень медленным. Лучшие низкосывороточные среды, AdvMem и MesenPro, поддерживали образование колоний фибробластами в два раза менее эффективно, чем сыворотки первой группы, но были также эффективны, как и сыворотки второй группы. Результаты показали, что ни одна из протестированных в работе бессывороточных/низкосывороточных сред не может быть использована на этапе получения первичной культуры из биоптата. Однако эти среды, за исключением StemProMSC, могут быть использованы на этапе клеточной экспансии. Полная среда для фибробластов Q333 по параметрам эКО и T1/2 Фк сопоставима с наиболее эффективными низкосывороточными средами AdvMem и MesenPro.

Таким образом, использование аутологичной сыворотки молодых здоровых доноров вместо эмбриональной (при наличии такой возможности) может оказаться предпочтительным как на этапе получения первичной культуры, так и при ее экспансии. Сыворотка пациентов старшей возрастной группы и пациентов с наличием в анамнезе хронических заболеваний (в частности, сахарного диабета и др.) в связи с изменением ее белкового состава и снижением содержания ростовых факторов не будет являться адекватной заменой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Бессывороточные (Panserin 401 и Panserin 411) и низкосывороточные (MesenProMSC, AdvMEM, AdvDM/F12 и AdvDM) среды могут служить адекватной заменой FBS на этапе экспансии культуры фибробластов, выделенных из кожи и десны человека.

Морфологический анализ колоний фибробластов. Нами отмечено, что при использовании сывороток первой группы происходило в 3-7 раз большее образование колоний веретеновидных, быстро пролиферирующих клеток, чем при использовании сывороток второй группы. Именно такими фибробластами определяется скорость экспансии культуры. Особенностью полученных при использовании аутосыворотки колоний являлось образование небольшого количества веретеновидно-клеточных колоний, обладающих в 1,5–2 раза большими, чем при использовании FBS, размерами. В среднем такие колониеобразующие единицы за время культивирования при использовании аутосыворотки давали потомство, состоящее из 8000 Фк и 16000 Фд (~13–14 популяционных удвоений), тогда как при использовании FBS потомство состояло из 1000–2000 Фк (~10–11 удвоений популяции) и 2200–2800 Фд (~12–13 удвоений популяции).

Заключение

Выделение первичной культуры фибробластов из биопсийного материала небольшого объема представляет существенную сложность. Использование сред с добавлением сывороток, которые обеспечивают высокую эффективность образования колоний (в первую очередь веретеновидно-клеточных) при размножении посеянного в низкой плотности малого количества клеток позволило получить первичную культуру фибробластов практически из любого биопсийного образца кожи и десны человека. Получение первичной культуры фибробластов в бессывороточных средах в наших опытах оказалось безуспешным. На последующих же пассажах могут быть использованы среды с меньшим клоногенным потенциалом, в том числе и некоторые бессывороточные. Разработанные методы мы рассматриваем как оптимальные, позволившие в наших условиях выделить и нарастить достаточный объем клеток из биоптатов кожи и десны человека.

Подняться вверх сайта