Поиск Кабинет

Новый тип тканеинженерной конструкции на основе политетрафторэтилена с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием

Гены & Клетки: Том V, №3, 2010 год, стр.: 71-76

 

Авторы

Григорьян А.С., Киселёва Е.В., Штанский Д.В. Филонов М.Р., Хамраев Т.К., Топоркова А.К., Гастиев А.Б., Фаркашди Ш.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Описана методика получения тканеинженерной конструкции на основе высокопористого политетрафторэтилена (ПТФЭ) с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием (МБНП) состава Ti-Ca-P-C-0-N. Показано, что на подложке из ПТФЭ с МБНП происходит активная адгезия и пролиферация мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. В условиях остеогенной стимуляции происходит интенсивное коммитирование клеток, позволяющее получить популяцию преостеобластически дифференцированных элементов, что было подтверждено положительной иммуноцитохимической реакцией на остеопонтин и остеонектин. В опытах in vivo на модели экспериментально воспроизведенных критических дефектов свода черепа у кроликов проведена оценка влияния трансплантации тканеинженерных конструкций на основе высокопористого ПТФЭ с МБНП состава Ti-Ca-P-C-0-N, на поверхности которых культивированы аутогенные стромальные клетки из жировой ткани на формирование костного регенерата. Через 3 и 6 мес. после трансплантации под тканеинженерной конструкцией показано формирование костного регенерата, полностью закрывавшего дефект.

Ключевые слова: тканеинженерные конструкции, функциональное покрытие, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани, регенерация костной ткани, краниопластика.

Тканевая инженерия — это междисциплинарная область, совмещающая принципы биологии и инженерии для создания биомедицинских (биоинженерных) конструкций, которые восстанавливают (частично или полностью) целостность, поддерживают или улучшают функции поврежденных или утраченных тканей и органов[1 ].

Тканевая инженерия, основанная на использовании мультипотентных стволовых клеток, заключает в себе такие компоненты как: выделение стволовых клеток, выращивание их культуры на носителе (подложке)[2].

В качестве клеточного компонента тканеинженерных конструкций до недавнего времени, в основном, выступали стромальные клетки костного мозга (СККМ)[3, 4]. Однако клетки с характеристиками СККМ обнаружены также в жировой ткани[5] и других тканях. Клетки стромы жировой ткани (СКЖТ) обладают рядом преимуществ: они доступны для выделения в больших количествах, культивирования и последующей имплантации полученной клеточной массы, их способность к остеогенной дифференцировке в меньшей степени, чем у СККМ, зависит от возраста донора[6—8].

Большинство материалов, которые на современном этапе развития тканевой инженерии предлагается использовать в качестве подложки для тканеинженерных конструкций, относится по своему типу к биоре-зорбируемым. Предполагается, что резорбируемые подложки должны обладать рядом физико-химических и биологических характеристик, оптимизирующих рост культивируемых клеток и вместе с тем регенерацию утраченных тканевых структур при имплантации биоинженерных конструкций.

Однако хирургические вмешательства при пластике костных дефектов из-за широкой вариабельности конкретных условий, подлежащей лечению костной патологии (локализация, характер костной ткани, конфигурация кости и т.д.), требуют от материала подложек, применяемых с этой целью тканеинженерных конструкций, значительно более широкого, а главное гибко меняющегося по необходимости диапазона физико-химических и механических характеристик (скорость резорбции, прочность и т.д.), нежели те, которые могут обеспечить используемые материалы. В связи с этим до сегодняшнего дня проблема разработки и поиска новых типов материалов для подложек тканеинженерных конструкций не потеряла своей актуальности.

Известны попытки культивирования остеогенных клеток на нерезорбируемых имплантационных материалах. Применение этих материалов, в частности, металлов (титан и его сплавы), в качестве подложек позволяет активировать процессы остеогенеза в пе-риимплантатной зоне и повысить остеоинтеграцион-ный потенциал металлических имплантатов[9—11].

В работе ставилась задача исследовать возможность использовать с этой целью высокопористые мембраны из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с наноструктуриро-ванным многофункциональным биосовместимым нере-зорбируемым покрытием (МБНП) элементного состава Ti-Ca-P-C-0-N.

Материал и методы

Осаждение покрытия Ti-Ca-P-C-0-N на ПТФЭ подложки осуществляли путем магнетронного распыления синтезированной методом самораспространяющегося высокотемпературного синтеза композиционной мишени TiC0 5 + Са10(Р04)в(0Н)2 в газовой смеси аргона с азотом, при парциальном давлении азота 14%. В процессе напыления давление в вакуумной камере и температура подложки составляли соответственно 0,2 Па и 120—150°С. Толщина покрытия составляла 0,9—1,1 мкм[12-14].

Метод выделения и культивирования СКЖТ. Аутогенные СКЖТ выделяли из подкожной жировой ткани из паховой области кролика с помощью механического измельчения и ферментативной обработки 0,1% коллагеназой I типа (Worthington, США) с последующей отмывкой и центрифугированием в градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, США). Клеточный осадок трижды отмывали в среде ДМЕМ (Биолот, Россия). Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки (HyClone, Новая Зеландия). На 3-ем пассаже культуры СКЖТ пассировали на имплантаты и культивировали в течение 14 сут. в остеогенной среде: среда ДМЕМ, 10% ФТС, 0,01 мкМ 1,25-дигидрок-сивитамин D3 (Sigma, США), 50мкМ аскорбат-2-фос-фат (Sigma, США), ЮмМ в-глицерофосфат (Sigma, США). За сутки до трансплантации, подложки с индуцированными к остеогенной дифференцировке СКЖТ кролика переводили на среду без сыворотки.

Для оценки остеогенной дифференцировки клетки засевали в концентрации 2,5x104 клеток/см2 в 6-лу-ночные планшеты. Затем среду культивирования меняли на остеогенную. Дифференцировку клеток оценивали через 14 сут. по цитохимической окраске на щелочную фосфатазу (NBT/BCIP Stock solution (Roche Diagnostics)), окраске на кальцификацию внеклеточного матрикса ализариновым красным S (Sigma, США) и иммуноцитохимическому окрашиванию на экспрессию остеогенных белков. Антитела против остеокальцина, остеопонтина и остеонектина производства Chemicon (США), визуализация вторичными антителами — Alexa-488 или Alexa-546 (Molecular Probe, США).

Для исследования методом сканирующей электронной микроскопии (СЗМ) была проведена процедура фиксации клеток на поверхности пластин ПИФЗ. После удаления фиксирующего раствора образцы промывали фосфатно-солевым буфером и проводили дегидратацию материала, после удаления этанола образцы помещали на 30 мин. в гексаметилдисилазан, после чего высушивали на воздухе. Окончательное высушивание образцов осуществляли методом перехода через критическую точку на аппарате Hitachi CPD-1 (Critical Point Dryer). После чего их фиксировали на предметные столики и напыляли смесью золото-палладий, используя установку Eiko-IB3 (Ion coater) при следующем режиме: ионный ток — 6 мА, межэлект-родное напряжение — 1,5 kV, что позволяло получать толщину слоя напыления около 25 нм. Изучение объектов проводили на аппарате CamScan S-2 (Cambridge Scanning) в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 20 kV. Захват и обработку видеоизображения на персональном компьютере реализовывали с использованием программно-аппаратного комплекса Microcapture 2.2 (системы для микроскопии и анализа).

Методика экспериментальной операции. Эксперимент проводили на 8 кроликах-самцах породы Шиншилла весом около 2500 г. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало рекомендациям Хельсинкской Декларации и рекомендациям, содержащиеся в Директивах Европейского Сообщества (№86/ 609 ЕС). Под общей анестезией Zoletil («Virbac Sante Animate», Франция) с соблюдением правил асептики, после обработки операционного поля, производили разрез кожи, обнажали свод черепа и с помощью фрезы, при малых оборотах с постоянным охлаждением физиологическим раствором, создавали полнослойный дефект 10410 мм. Затем проводили краниопластику, фиксируя пластины титановыми микровинтами. Животные были разделены на 2 группы по 4 кролика в каждой: основная группа — дефект закрывали тканеинженерной конструкцией с аутогенным СКЖТ, культивированными на мембранах высокопористого ПТФЭ с наноструктуриро-ванным МБНП; группа сравнения — дефекты закрывали мембранами без культуры клеток. Мягкие ткани укладывали на место, кожу ушивали узловыми швами vicril 4/0. Рана заживала первичным натяжением.

Животных выводили из эксперимента в сроки 3 и 6 мес. Костные фрагменты свода черепа кроликов с имплантатами фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, затем декалыдинировали в 25% растворе Трилона Б. Декалыдинированные образцы проводили через спирты возрастающих концентраций и заключали в парафин. Срезы готовили с помощью ротационного микротома Microm НМ 355S (Германия) толщиной 6^7 микрон и окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение препаратов и микрофотосъёмку производили в оптической цифровой системе Axioplan 2 imaging (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Результаты культивирования клеток на имплантатах. Было показано, что адгезия и заселение поверхности имплантата клетками культуры происходит лишь в образцах с наноструктурированным МБНП, при его отсутствии клеток на поверхности имплантата не обнаружено. С помощью люминесцентной и СЗМ показано, что через 14 сут. после культивирования в остеогенной среде поверхность имплантатов была заселена многоотростчатыми фибробластоподобными клетками (рис. 1).

Для оценки остеогенной дифференциации СКЖТ культивировали на пластике в остеогенной индукционной среде. Через 14 сут. культивирования в остеогенной среде СКЖТ кролика на пластике образуют многослойные участки, при этом усиливается экспрессия щелочной фосфатазы — положительная окраска на щелочную фосфатазу (рис. 2), однако внеклеточный матрикс еще не подвергается кальцификации (негативная реакция с ализариновым красным S). Имму-ноцитохимический анализ экспрессии специфических белков остеогенеза выявил, что клетки находятся на начальных стадиях дифференцировки, поскольку обнаруживалась экспрессия остеопонтина и остеонекти-на (рис. 3), а экспрессии позднего маркера дифференцировки остеокальцина не наблюдалось.

Таким образом, гибридные имплантаты из высокопористого ПТФЗ с наноструктурированным МБНП могут служить основой для создания биоинженерных конструкций с мультипотентными клетками, в том числе СКЖТ, для регенерации дефектов костной ткани.

Апробация тканеинженерных конструкций из ПТФЗ с МБНП в опытах in vivo. На следующем этапе работы исследовали остеорегенераторный потенциал биоин-женерной конструкции на модели экспериментально воспроизведенных критических дефектов теменной кости у кроликов. В работе использовали аутогенные СКЖТ кроликов.

Гистологическое исследование показало, что в сроки 3 и 6 мес. у кроликов основной группы под тканеинженерными конструкциями с аутогенными СКЖТ образовывалась новая костная ткань, прикрывающая дефекты кости на всём их протяжении, а так же местами обширные участки жировой и фиброзной ткани (рис. 4а). Костные структуры, прикрывающие дефект черепа, были непрерывны. В поры ПТФЗ интенсивно прорастала клеточноволокнистая соединительная ткань, содержащая кровеносные сосуды (рис. 46). На значительном протяжении поры ПТФЗ содержали новообразованные костные трабекулы (рис. 4в). В группе сравнения под гибридными имплантатами без клеток в костных дефектах формировалась фиброзная соединительная ткань (рис. 4г).

Заключение

Таким образом, как показали опыты на кроликах с дефектами свода черепа под тканеинженерными конструкциями из высокопористого ПТФЭ с нанострукту-рированным МБНП состава Ti-Ca-P-C -0-N фиксированными над костными дефектами формируется полноценный костный регенерат, закрывающий на всём протяжении указанные дефекты. Это свидетельствует о высоком остеоиндукционном потенциале, которым обладают гибридные имплантаты указанного типа (биоинженерные конструкции). Приведенные данные свидетельствуют о том, что уровень коммитирования клеток, который достигается при описанном методе культивирования СКЖТ, позволяет получить популяцию преостеобластически дифференцированных клеток, обладающую мощным остеогенетическим потенциалом, достаточным для восстановления костной ткани в объёмах критических костных дефектов свода черепа, костная ткань которого, как известно, обладает относительно низким регенерационным потенциалом.

Таким образом, гибридные имплантаты, обладающие, как показали наши исследования, высокой биосовместимостью и остеоинтеграционным потенциалом могут служить успешной альтернативой известным титановым пластинам и конструкциям из производных акриловых смол, широко применяемым в настоящее время в клинической практике черепно-челюстно-лицевой хирургии.

Появление нового отечественного конкурентно-способного материала из высокопористого ПТФЭ с нано-структурированным МБНП и композиций для хирургического лечения обширных дефектов свода черепа и плоских костей лицевого скелета чрезвычайно актуально.

Подняться вверх сайта