Поиск Кабинет

Новые тканые матрицы на основе рассасывающегося природного полисахарида хитина для культивирования и трансплантации клеток кожи человека

Гены & Клетки: Том I, №4, 2006 год, стр.: 56-61

 

Авторы

Михайлов Г.М., Лебедева М.Ф., Пинаев Г.П., Юдинцева Н.М., Блинова М.И., Панарин Е.Ф.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Из биологически активного полисахарида - хитина, выделенного из панцирей дальневосточного краба и североморской креветки, методом «мокрого» формования растворов получены моно- и по~ лифиламентные нити. Эти нити резорбируются под действием ли-зоцима до образования N-ацетилглюкозамина и гликозамина.

Изучение монофиламентов в условиях культивирования клеток показало сохранение их деформационно-прочностных характеристик.

Из некрученых полифиламентных нитей методом ручного ткачества изготовлены образцы, на которых проведено культивирование нормальных фибробластов кожи человека. Результаты позволяют сделать положительное заключение о возможности выращивания дермальных фибробластов на тканой матрице из хитиновых волокон.

Введение

Восстановление кожных покровов является одной из важ нейших проблем лечения больных с обширными и глубокими ожогами, с трофическими язвами, с травматическими и другими видами повреждений кожи человека. В России ко личество обожженных достигает 20% от всех травматологи ческих больных, при этом летальность достигает 11%. В США каждый год получают ожоги около 2 млн человек, из них 130 тыс. подвергаются госпитализации, 1012 тыс. по гибают. Множество клиник и лабораторий ведут исследова ния по разработке новых методов лечения пострадавших.

Традиционный метод пересадка кожи, взятой у пост радавшего или донора в случаях обширного или глубокого поражения часто бывает осложнен состоянием пациента, размерами сохранившихся участков кожи или другими об стоятельствами, не позволяющими к нему прибегнуть. В качестве пересадочного материала для закрытия раневой поверхности используют лиофилизированную или заморо женную кожу животных или человека или искусственные материалы (ткани, пленки), изготовленные из резорбирую щихся или нерассасывающихся полимеров; культивиро ванные in vitro на полимерных матрицах кератиноциты и фибробласты [1, 2].

Аллотрансплантаты, полученные от трупов или добро вольцев, отторгаются организмом пациента через одну или две недели и, следовательно, являются только временной за щитой пораженной поверхности. Девитализированная за мораживанием в глицерине или лиофилизированная кожа животных или человека способствует восстановлению со единительной ткани и кровеносных сосудов и впоследствии рассасывается. Используют также и искусственную кожу, которая состоит из коллагена или хондроитина, или сеток из волокон, заменяющих дерму, покрытых полупроницаемой силиконовой пленкой. Эта пленка после восстановления тка ней под ней удаляется и заменяется аутотрансплантатом или выращенными и размноженными in vitro кератиноцитами, фибробластами [3].

Методика массового производства кератиноцитов, раз работанная около 30 лет тому назад, для клинических целей применяется только несколькими специализированными центрами. В процессе культивирования количество кератино цитов может увеличиваться в 5 10 тысяч раз. Это означает, что кератиноциты, выращенные из кусочка кожи размером с почтовую марку (1,5 сма), могут покрыть поверхность в 1,5 ма, что почти равно поверхности тела человека. Они об ладают всеми существенными характеристиками керати ноцитов in situ делятся, дифференцируются, образуют бел ковые структуры, необходимые для внутриклеточной связи и регуляции процессов клеточного деления и дифференци ровки, выделяют цитокины [3].

Использование кератиноцитов в свободной форме in vivo не приводит к высокой активности из за короткого време ни их жизни и низкой адгезии к раневой поверхности. С целью пролонгирования действия и увеличения адгезии их к поверхностным тканям раны клетками импрегнировали резорбируемые желатиновые микросферы. Исследования, выполненные на морских свинках, показали, что эти мик росферы ускоряют рост кератиноцитов и образование ка пилляров. Они могут быть использованы для оптимизации регенерации тканей [4].

Однако покровные материалы на резорбирующей основе гораздо удобнее при трансплантации и закрытии раневых поверхностей, они могут быть использованы для культиви рования и последующей пересадки человеческих керати ноцитов и фибробластов. С этой целью были исследованы коллагеновые губки, матричные системы, состоявшие из коллагена, гликозамина и хитозана, а также из коллагена разной степени сшивки дифенилфосфорилазидом [5]. По скольку коллаген частично денатурировался из за низкой термостойкости и растворялся при культивировании фиб робластов, пролиферация была достаточно низкой. На матрицах, образованных коллагеном, гликозамином и хито заном, отмечена высокая скорость роста фибробластов. Авторы отмечают эту систему для культивирования и фор мирования дермального слоя как лучшую из исследованных.

Известны многослойные матрицы. Их авторы [6] испы тали для лечения глубоких ран заменитель кожи, в котором было два слоя из резорбируемых полимеров. Пористый ниж ний слой служил для лучшей адгезии материала к раневой поверхности. На нем было проведено культивирование фиб робластов, а верхний более плотный слой служил подложкой для кератиноцитов.

В качестве матричных материалов были исследованы природные полимеры (коллаген, хитозан), а также создан и исследован обширный ряд синтетических полимеров [6]. Эта работа позволила сформулировать требования к материа лам и выбрать соответствующие требованиям полимеры для матриц при регенерации дермальных тканей (коллаген, поли лактиды и полигликолиды). В частности, для культивирования клеток кожного покрова с последующей трансплантацией их на пораженные участки было предложено использовать по лимеры носители, которые после восстановления кожного покрова могли бы рассосаться, не причинив никакого вреда организму пациента. Это синтетические полимеры полиди оксаноны и полигликолиды, на основе которых изготавливают рассасывающиеся в организме пациента хирургические шовные нити Даксон, Викрил и Этикон.

В отличие от традиционных материалов кетгута и кол лагена, являющихся чужеродными белками и поэтому спо собными вызывать хронические воспаления, некрозы, ин фицирование раны, ее рубцевание и т.д, эти синтетические полимеры не антигенны и не вызывают воспалительных про цессов в окружающих тканях. Однако в последнее время по явились сообщения, что при медленно заживающих ранах, т.е. в условиях, требующих длительного сохранения дефор мационно прочностных свойств имплантированного мате риала, они преждевременно рассасываются и заживление раны не наступает. Также имеются упоминания о повыше нии жесткости материалов, что приводило к затруднениям их использования и дополнительному травмированию тка ней. При хранении, из за гидролиза полимера, они резко снижают свои прочностные характеристики. Кроме этого, продукты резорбции синтетических полимеров не являются специфическими для организма пациента материалами и могут вызывать дополнительные осложнения в процессах регенерации кожного покрова.

Переход от биологически инертных полимеров (полигли колиды, полилактиды) к биологически активным системам (полисахаридам), которые позволяют иммобилизировать факторы роста, регуляции пролиферации клеток, открывает широкие возможности регенерации не только кожных покро вов, но и других жизненно важных клеточных систем орга низма человека. Такими полимерами, из которых возможно изготовление рассасывающихся в организме пациента ма териалов, являются природные полисахариды хитин и его производное - хитозан. Хитин и хитозан распадаются в орга низме пациента энзиматически (расщепляются под воздей ствием лизоцима). Скорость резорбции (рассасывания) этих материалов можно изменять, варьируя степень ацетилиро вания и/или толщину нити. Они устойчивы к гидролизу, что обуславливает их длительную сохранность без существен ного изменения механических свойств. Исследования шов ных материалов подтвердили, что они фиксируют ткани до наступления полного заживления раны, а позднее рассасы ваются бесследно, делая шов косметическим, рубцевания тканей не происходит (7, 8].

Следует особо отметить, что хитин и хитозан активируют фагоцитарную активность макрофагов, что приводит к уве личению количества мигрирующих в очаг воспаления фаго цитов. Эти полисахариды не только ускоряют заживление ран, но и способствуют восстановлению кожи на пораженных уча стках без образования грубых рубцов, потери функциональ ности, ускоряют образование коллагена, индуцируют ново образование кровеносных сосудов, восстанавливают слизистую оболочку полости рта. Побочных эффектов при этом не наблюдается (7, 9].

Природные полисахариды (хитин, хитозан) резорбируются до необходимых организму веществ: N ацетилгликозамина или гликозамина. Они обладают иммуномодулирующим, адъювантным, противомикробным, фунгистатическим, противоопухолевым, радиозащитным, ранозаживляющим, антихолестерическим, гемостатическим действием [10]. Изучение цитохимическими методами метаболизма фаго цитирующих клеток показало, что хитин и хитозан увеличива ют активность ферментов гликолиза (11 ]. Частично деацети лированный хитин, используемый при лечении обожженных участков кожи, также активирует макрофаги, демонстриру ет высокую иммунологическую активность, расщепляется лизоцимом интенсивнее [7].

Эти природные полисахариды являются перспективны ми материалами при создании рассасывающихся матриц для культивирования фибробластов и кератиноцитов. Выра щенные на таких матрицах культуры клеток кожи человека могут быть использованы для лечения ожоговых и травмати ческих ран. Они обеспечат сохранность внеклеточного мат рикса и нужную ориентацию клеток при переносе трансплан тата на раневую поверхность. Можно полагать, что матричные материалы на основе этих природных полимеров окажутся более перспективными, чем материалы на основе коллагена или рассасывающихся синтетических полимеров при куль тивировании и трансплантации клеток кожи человека.

Сырьевой источник, условия выделения хитина опреде ляют свойства конечного продукта. Для получения волокон необходим высокомолекулярный полимер. А так как наибо лее высокомолекулярный хитин может быть получен из пан цирей крабов, то это сырье наиболее предпочтительно для получения волокон. Молекулярная масса хитина зависит от источника, из которого он выделен, и от способа выделения. Как правило, она находится в пределах 100 500 тыс. Da, хотя встречаются образцы и более высокомолекулярные до 1 млн Da. Однако высокая кристалличность и межмоле кулярные взаимодействия не позволяют перерабатывать эти полимеры в изделия через расплав, как синтетические. Мат ричные материалы волокна и пленки могут быть получены только при переработке растворов этих полимеров.

В 1975 г. C.J. Brine и P.R. Austin предложили для раство рения хитина трихлоруксусную кислоту (ТХУК), которая пла вится при 57°С (12]. При добавлении к ТХУК 40% хлоралгид рата и 20% метиленхлорида был получен 2% раствор хитина. В качестве коагулянта использован ацетон. Осажденное волокно нейтрализовали раствором гидроокиси калия в изопропаноле и промывали водой. Полученное волокно име ло прочность (а) 63 кг/мм2 (618 МПа) и удлинение (s) 13%, Сформованные из такого раствора на стеклянной подлож ке пленки обладали а = 104 кг/мм2 (1,02ГПа) и s = 44%. Эти работы показали возможность мокрого формования хитино вого волокна и что, регулируя скорость экструзии и подобрав коагулянт, можно существенно улучшить его механические характеристики [13].

Kifune [14] использовал для растворения хитина смесь ТХУК и хлорированных углеводородов: хлорметана, дихлор метана, 1,2 дихлорэтана, 1,1,1 трихлорэтана, и 1,1,2 три хлорэтана. Концентрация ТХУК в смесях составляла 25 75% (вес). Растворение хитина производили при пониженной температуре и получили 1 10% растворы хитина. Волокно формовали через фильеры с d0TB= 0,04 0,08 мм в ацетон с последующей промывкой в метанольной ванне. Высушен ное волокно имело а = 1,67 3,1 г/денье (2,15 4,00 МПа] при s = 8,7 20,0%. После выдерживания волокна в 0,5% растворе гидроксида натрия прочностные характеристики а качестве рассасывающихся хирургических нитей [16].

Нативный хитин прекрасно кристаллизуется, а это приво дит к повышенной жесткости и хрупкости волокон. В данном случае волокна характеризуются высокой эластичностью, удлинение при разрыве достигает 19 27%. Автор не про водил элементный анализ регенерированного хитина и не определял наличие в волокнах хлора.

P.R. Austin et al„ описали способ получения хитиновых пленок и волокон. Они использовали прядильные раство ры с концентрацией 2% хитина в трихлоруксусной кислоте, растворенной в хлорированных растворителях [17]. Фор мование волокна осуществляли «мокрым способом» при осаждении в ацетон с последующей обработкой полученно го волокна раствором гидроокиси калия в изопропаноле и промывкой водой. Однако полученное волокно по данным элементного анализа содержало 5,03% азота и до 9,455% хлора, от которого оказалось невозможно отмыть получен ное волокно [18]. Можно предполагать, что трихлоруксусная кислота реагирует непосредственно схитином, поскольку после отмывания различными растворителями не удается снизить содержание хлора в целевом продукте ниже 5 10 масс. %. Только при длительном воздействии кипящего 1% раствора едкого натра в н пропаноле удалось снизить содержание хло ра до 1 %. Такое волокно нельзя использовать в качестве хи рургического шовного материала, а соответственно и для изготовления матриц для культивирования клеток.

В перечисленных способах для растворения хитина ис пользуют трихлоруксусную кислоту, которая является агрес сивным реагентом, вызывающим не только интенсивную коррозию оборудования, но и активную деполимеризацию хитина в прядильных растворах на всех стадиях получения конечного продукта.

Названных выше недостатков фактически не имеет ком плексный растворитель на основе диметилацетамида (ДМАА) или N метилпирролидона (N МП) с 5 10% содержанием LiCI. Эту систему, растворяющую хитин, предложил P.R. Austin в 1977 г. [19]. В таком растворителе можно получить 3 5% ра створы хитина, проведя предварительную активацию хитина водой с последующей инклюзией метанолом и безводным ДМАА. В качестве коагуляционной ванны был использован ацетон, окончательную промывку волокна осуществляли во 592 МПа) [20]. Использование в качестве осадителя бутано (493 МПа) [21,22]. Однако использование этих волокон было ограничено их использовали только при получении расса сывающихся нетканых перевязочных материалов. Вероятно, причина была обусловлена высокой хрупкостью волокон, низ ким удлинением при разрыве. В цитированных источниках этой характеристики нитей нет.

Исследуя волокнообразующую способность хитина, мы ус тановили, что причина высокой хрупкости хитиновых волокон обусловлена высокой способностью его к кристаллизации [23]. Было получено хитиновое волокно из 3 3,5% раствора хитина в смеси N МП/ДМАА 50/50 с 5% LiCI при мокром формовании в осадительную ванну состава ДМАА/этилен гликоль/этанол 40/20/40. После промывки водой и сушки волокна имели а = 390 МПа и s = 3%. Исследование полу ченного волокна методом сканирующей электронной микро скопии показало, что оно имеет ленточно фибриллярную структуру и разрушение его при растяжении происходит по хрупкому механизму. Такой характер разрушения связан с высокой упорядоченностью макромолекул хитина в волокне, что следует из данных рентгеноструктурного и электронно микроскопического анализов.

Используя апротонные растворители ДМАА и МП, в кото рых растворяли до 9% хлорида лития, мы получили растворы хитина. Если раствор хитина предохранен от взаимодействия с влагой воздуха, то он сохраняет годами свои свойства (бо лее 5 лет) и из него можно получать волокна с неизменными деформационно прочностными характеристиками. В этом растворителе гидролиз хитина не происходит. Система ДМАА/LiCI экологична, ее компоненты могут быть реге нерированы из растворов.

Увеличение структурной неоднородности системы, при частичном гетерогенном деацетилировании хитина, приво дит к затруднениям в процессах кристаллизации полимера при получении волокна и позволяет повысить его эластичность. При степени деацетилирования хитина < 0,30 волокно за вязывается в узел и сохраняет 40% исходной прочности. Гетерогенное деацетилирование связано с жестким воздей ствием на хитин концентрированной щелочи (30 50%) при высокой температуре и часто приводит к получению продук тов с трудно воспроизводимыми характеристиками. Поэтому включение такой ступени в технологию нецелесообразно из за нестабильности характеристик получаемого сополимера (растворимость, гелеобразование, возможность образова ния глюкуроновых кислот и т.д.), не только осложняющих, но часто делающих невозможным получение прядильных ра створов и формование волокна [24].

В дальнейшем, изучая влияние условий формования на морфологию и механические характеристики волокон, мы разработали условия получения эластичных хитиновых ни тей с достаточной прочностью и сохраняющих прочность в узле до 70% от исходной. Испытания показали, что эти во локна биосовместимы, рассасываются в течение времени, необходимого для полного заживления раны, не аллерген ны, их механические свойства полностью соответствуют существующим требованиям к хирургическим шовным ма териалам. Радиационная, а также обычная жаро паровая стерилизации не изменяют деформационно прочностные характеристики волокон.

Такие волокна можно использовать для изготовления рассасывающихся хирургических шовных материалов, а соответственно и для получения тканых матриц для выра щивания клеток кожи человека.

Материалы и методы

При проведении работ были использованы: диметила цетамид фирмы «Вектон» (РФ), который обезвоживали, перегоняли в вакууме и отбирали фракцию, кипевшую при 42°C и остаточном давлении 7 мм. рт. ст.; хлористый литий кристаллогидрат, обезвоженный при 400°С.

Был использован хитин из крабов, производство АО «Восток Бор», (Дальнегорск) и североморской креветки (Мурманск).

Из измельченного панциря удаляли остаточный белок и зольные элементы.

Обеззоливание измельченных панцирей крабов осуществ ляли при охлаждении до 4 10°С многократной обработкой 1 N соляной кислотой; дистиллированной водой удаляли об разовавшиеся соли. После чего для удаления остаточного белка хитин обрабатывали 1 N водным раствором едкого натра при 35 45°С, промывали водой, водным раствором 1 5% уксусной кислоты, водой, ацетоном и сушили при 60°С в вакууме. Получен хитин с М 170 тыс. Da. Зола и белки от сутствовали.

Растворение хитина осуществляли в комплексном ра створителе ДМАА + 9% LiCI при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Содержание полимера в ра створе 3% масс.

Формование волокна осуществляли на установке ПИФВ01, используя шприц дозатор и фильеру 300/0,08. Осадительная ванна спиртовая, пластификационная ван на вода. Отмывка от волокна хлористого лития осуществ лена горячей водой (80°С) до полного отсутствия в промывных водах иона хлора (проба на азотнокислое серебро). Волокна высушены при 105°С.

Полифиламентные волокна характеризуются прочное тью до 293 МПа (21,1 сН/текс), сохранением прочности в узле до 70% и удлинением при разрыве 7,5%. Диаметр монофиламента Юмкм.

При использовании фильеры 1/0,4 была получена мо нонить с прочностью при разрыве 333 МПа, удлинением 11,7% и с диаметром 80 мкм.

Степень ацетилирования (DA) определяли согласно ме тодике [25]. Навеску полимера или волокна заливали 5 мл раствора 0.1 N соляной кислоты и оставляли на ночь. После такой выдержки проводили титрование щелочью при пере мешивании на магнитной мешалке.

Расчет проводили по формулам:

где N нормальность раствора NaOH (моль/л), А\/ объем раствора между точками перегиба на кривой титро вания (л), т сухой вес образца полимера (г).

Механические испытания выполнены на универсальной разрывной машине Инстрон 110. Диаграммы растяжения получены на базе образца 50 мм при скорости нагруже ния 5 мм/мин. Образцы перед проведением испытания выдерживали сутки в эксикаторе над концентрированным водным раствором ацетата магния, т.е. при относительной влажности 65%.

Рентгенографические исследования проводили на диф рактометре ДРОН 2 и в камере РКВ 86 с использовани ем излучения СиКа, фильтрованного никелем. Волокна образованы хитином, имеющим р структуру и характеризу ются мезоморфной надмолекулярной организацией.

Результаты и их обсуждение

Поверхность и морфология на срезе хитинового моно филамента представлена электронно микроскопическим снимком (рис.1).

Перед сканированием волокно было подвержено луще нию на 1/3 диаметра. На снимке видна поверхность волок на левая сторона снимка, и поверхность лущения, которая характеризует его внутреннее строение. Видны протяженные, кристаллоподобные ламелы, составляющие их микрофиб риллы и поры.

С целью выяснения возможных влияний питательной среды, в которой выращивают клетки, на свойства волокон, образцы (монофиламенты), были проверены в условиях культивирования клеток. Их помещали в питательную среду DMEM, в фосфатный буфер PBS и выдерживали при тем пературе 37°С. После выдержки в течение разного времени, вплоть до 257 часов, волокна изымали для проведения ме ханических испытаний, как в мокром, так и в сухом состоя нии. Результаты испытаний волокон приведены в таблице.

Анализ данных, приведенных в таблице, показывает, что волокно на основе хитина способно длительно сохранять свои механические характеристики в средах для культиви рования клеток. Если исходное волокно имело прочность при разрыве 333 МПа, то после выдержки в течение 257 ча сов при Т = 37°С в среде PBS и последующей сушки его прочность составила 317 МПа, а в среде DMEM 292 МПа; удлинение при разрыве составило 13%.

Волокно в процессе длительного выдерживания в ис пользованных средах сохраняет достаточно высокий уро вень прочности в мокром состоянии (около 250 МПа после выдержки в течение 257 часов) и практически постоянное, близкое к исходному значение удлинения при разрыве порядка 11 %. Это свидетельствует о том, что волокно, дли тельно находящееся в этих средах, не разрушается и, следовательно, может быть использовано в качестве мат ричного материала.

С целью выявления возможности культивирования фиб робластов из полученных некрученых полифиламентных нитей методом ручного ткачества были изготовлены ленты. Чтобы волокна были закреплены в образцах, ленты проклей вали прядильным раствором хитина, из которого были сфор мованы и сами хитиновые волокна. Проклейку осуществляли, форматируя ткань, которую в дальнейшем использовали в качестве образца для культивирования клеток.

Поскольку адгезионное взаимодействие клеток и матри цы является одним из ключевых факторов, определяющих рост и развитие клеток (в частности, кератиноцитов), матричные образцы подвергали поверхностной модификации, изменяя степень ацетилирования поверхности хитиновых волокон. Были разработаны методы поверхностного деацетилирования матриц и оценки степени ацетилирования (СА) хитиновых волокон в матрице. Исходные образцы характеризуются СА = 0,96. Степень ацетилирования остальных матриц из менялась от 0,91 до 0,78.

Известно, что полисахариды являются прекрасными сорбентами. Ткань по сравнению с другими материалами, например, пленками, имеет большую поверхность и, соот ветственно, обладает большей сорбционной емкостью. Можно было ожидать, что помещение ткани в культураль ную жидкость приведет к изменению состава питательной среды, что может повлиять на пролиферацию и апоптоз клеток. В связи с этим были проведены эксперименты по ус тановлению сорбции ионов железа, кальция и магния.

Оказалось, что в модельных условиях ионы биогенных элементов (магния и кальция) из их водных растворов хити ном не сорбируются, а ионы железа сорбируются интенсивно. При этом сорбция ионов железа зависит от их концентрации в растворе и времени контакта. Следовательно, сорбция ионов железа из питательной среды для культивирования клеток может привести к нарушению обмена веществ и, следовательно, к замедлению или прекращению роста клеток.

Для того, чтобы питательная среда в процессе культиви рования клеток не обеднялась, образцы после стерилизации помещали в культуральную среду ДМЕМ с добавлением фе тальной сыворотки коров (Ну Cion), которые меняли каждый день в течение 5 суток. На подготовленные таким образом матрицы высевали нормальные дермальные фибробласты кожи человека. Доза посева клеток на каждый образец со ставляла 105 клеток/сма. Из за того, что тканые матрицы непрозрачны, состояние культивируемых клеток на матрице оценивали методом сканирующей электронной микроскопии.

Результаты тестирования образцов показали, что фиб робласты могут адгезироваться к волокнам и распласты ваться, облегая их слоем с толщиной от 2 до 5 мкм. Между отдельными удаленными волокнами возникают тяжи фиб робластов (рис. 3).

Заключение

Таким образом, из хитина изготовлены волокна и тка ные рассасывающиеся матрицы для культивирования на них клеток кожи человека. Полученные результаты позволяют сделать положительное заключение о возможности выра щивания дермальных фибробластов на тканой матрице из хитиновых волокон.

Подняться вверх сайта