Поиск Кабинет

Новые плазмидные конструкции, предназначенные для терапевтического ангиогенеза и несущие гены ангиогенных факторов роста — VEGF, HGF и ангиопоэтина-1

Гены & Клетки: Том V, №1, 2010 год, стр.: 47-52

 

Авторы

Макаревич П.И., Шевелев А.Я., Рыбалкин И.Н., Каширина Н.М., Липатова Л.Н., Цоколаева З.И., Шевченко Е.К., Белоглазова И.Б., Болдырева МА., Рубина КА, Власик Т.Н., Парфенова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Одним из путей увеличения эффективности генной терапии критической ишемии нижних конечностей является создание векторов, обладающих высокой экспрессионной активностью.

В данной работе нами испытывался плазмидный вектор PC4W, имеющий ряд регуляторных элементов, которые позволяют повысить экспрессию трансгена в клетках и тканях животных.

Плазмидные конструкции на базе вектора PC4W, несущие кДНК генов человеческого HGF (pC4W-hHGFopt), VEGF165 (pC4W-hVEGFopt) и ангиопоэтина-1 (pC4W-hAng-1 opt), испытывались in vitro в культуре клеток НЕК2ЭЗТ. Уровень факторов роста после кальций-фосфатной трансфекции оценивался по данным вестерн-блоттинга и ИФА и сравнивался с коммерческими плазмидами рсОЫАЗ, несущими гены аналогичных ростовых факторов. Для оценки экспрессии факторов роста в ишемизированной ткани мышей BALB-c использовался метод ПЦР с обратной транскрипцией.

Данные иммуноблоттинга и ИФА кондиционных сред транс-фецированных клеток показали, что при использовании вектора PC4W уровень факторов роста удалось повысить в 2—2,5 раза по сравнению с коммерческими плазмидами рсОЫАЗ. Дополнительное увеличение экспрессии достигается за счет оптимизации нуклеотидных последовательностей экспрессируемых генов.

Методом ПЦР было показано, что в течение 14 сут. в ишемизированной ткани сохраняется mPFIK человеческого FIGF, что соответствует данным литературы.

Полученные результаты показывают, что новые плазмидные конструкции, предназначенные для экспрессии ангиогенных факторов роста как in vitro, так и in vivo, обладают высокой активностью в культуре клеток человека и в тканях животных и позволяют продуцировать факторы hVEGF1B5, hFtGF и hAng-1 в более высоких количествах, чем конструкции на базе коммерческого вектора рсОЫАЗ, несущего неоптимизированные последовательности генов этих факторов. Конструкции в настоящий момент проходят предклинические испытания на моделях ишемии у экспериментальных животных и в дальнейшем будут использованы для разработки комбинированной генной терапии ишемических заболеваний.

Ишемические заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), критическая ишемия нижних конечностей (КИНК) и ишемические нарушения мозгового кровообращения являются одной из основных причин инвалидизации и смертности населения, представляя собой наряду с онкологическими заболеваниями самую значимую медико-социальную проблему как в развитых государствах, так и в странах третьего мира.

Критическая ишемия нижних конечностей, обусловленная стенозирующими поражениями артерий нижних конечностей, по статистическим данным, возникает у 18^22,5% больных сахарным диабетом 2 типа[1, 2]. Ежегодно КИНК диагностируется у 500^1000 пациентов на каждый миллион больных сахарным диабетом[1 ]. Данное заболевание характеризуется быстрым прогрессированием и ранним развитием ишемических и гнойно-некротических осложнений. В целом же, около 90% ампутаций проводится именно по поводу ишемии нижних конечностей[3].

Лечение КИНК включает целый ряд мер медикаментозного характера, изменение образа жизни, коррекцию сопутствующей патологии, однако, зачастую наиболее выраженный эффект дают хирургические методы восстановления нарушенного кровотока — шунтирование, ангиопластика, атерэктомия и т.д.[4, 5]. Вместе с тем, существует определенная категория больных с множественными критическими стенозами сосудов нижних конечностей, у которых описанные выше лечебные мероприятия недостаточно эффективны. Это же относится и к лицам, которым уже было выполнено хирургическое вмешательство, в результате чего все последующие операции по восстановлению перфузии становятся крайне затруднительными или невозможными[6, 7]. Это диктует необходимость разработки принципиально новых методов лечения КИНК. Таким альтернативным подходом является лечебная тактика, получившая название «терапевтический ангиогенез» или биологическое шунтирование, в основе которой лежит экзогенная стимуляция естественного процесса реперфузии ишемизированной ткани с помощью ангиогенных факторов роста или их генов, а также прогениторных клеток.

Ангиогенез и артериогенез являются естественными реакциями организма на ишемию, призванными восстановить кровоснабжение ткани за счет образования новых сосудов и ремоделирования существующих арте-риолярных соединений. При этом происходит активация синтеза ангиогенных факторов роста в очаге ишемии и мобилизация эндотелиальных клеток-предшественниц из костного мозга с последующей миграцией в область неоваскуляризации (васкулогенез)[8]. Стимуляция этого процесса с помощью генной терапии получает все большее распространение как потенциальный метод лечения КИНК и других заболеваний ишемической природы. Для индукции ангиогенеза в ишемизированных тканях используют плазмиды и вирусные конструкции, несущие кДНК ангиогенных факторов роста — основного фактора роста фибробластов CbFGFJ, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF) и ряда других. Безопасность плазмидных векторов, показанная во многих работах, позволила достаточно быстро перейти к клиническим испытания[9]. При этом оказалось, что существенной проблемой является низкая эффективность трансфекции скелетной мускулатуры in vivo (не более 1—2%)[10]. Для решения данной проблемы предлагается использование различных способов повышения эффективности трансфекции (электропорация, ультразвуковое, магнитное воздей- ствие)[11], а также создание новых векторов, обладающих повышенной экспрессией в ткани, что позволит создать в ней терапевтические концентрации фактора роста.

Ангиогенез является комплексным процессом, в котором каждый этап находится под контролем определенных цитокинов и факторов роста[8]. Это стало обоснованием для попыток применения комбинаций рекомбинантных белков или плазмид с генами различных факторов роста. В ряде экспериментальных работ было показано, что применение комбинаций факторов роста с взаимодополняющими эффектами на ангиогенез позволяет добиться более эффективного восстановления перфузии ишемизированных скелетных мышц[12], уменьшения числа ампутаций и, способствуя формированию более зрелых сосудов[13], уменьшению выраженности отеков[14].

В настоящей статье описаны результаты исследования функциональной активности новых оригинальных плазмидных конструкций, несущих оптимизированные последовательности генов факторов роста и созданных на базе нового вектора pC4W, характеризующегося более высокой эффективностью экспрессии трансгена, чем существующие коммерческие аналоги. Зкспресси-онную активность плазмид с генами HGF, VEGF и ангио-поэтина-1 изучали в культуре клеток и в тканях экспериментальных животных. Данные плазмиды в различных сочетаниях потенциально пригодны для повышения эффективности терапевтического ангиогенеза.

Материал и методы

Плазмидные конструкции. Зкспрессионныый вектор pC4W[15] содержит следующие функциональные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии трансгена (рис. 1): промотор PCMV ранних генов цитоме-галовируса человека, интрон IVS2 гена бета-глобина кролика[16], последовательность инициации трансляции, идентичная соответствующей последовательности вектора pGL3 (Promega, США), модифицированный по-сттранскрипционный регуляторный элемент WPRE вируса гепатита лесного сурка[17] и сигналы полиаденили-рования мРНК гена гормона роста быка и ранних генов вируса SV40. Участок клонирования, предназначенный для встраивания трансгена, расположен между последовательностью инициации трансляции и элементом WPRE.

кДНК фактора роста эндотелия сосудов человека (hVEGFI 65), фактора роста гепатоцитов человека (hHGF) и ангиопоэтина-1 человека (hAng-1) получали методом RT-PCR с использованием в качестве матрицы суммарной РНК из печени человека и клонировали в экспресси-онный вектор pcDNA3 (Invitrogen, США) с получением, соответственно, плазмид pcDNA3-hVEGF165, pcDNA3-hHGF и pcDNA3-hAng-1. Также кДНК генов hVEGFI 65 и hAng-1 клонировали в экспрессионный вектор pC4W с получением плазмид pC4W-hVEGF165 и pC4W-hAng-1. Для контроля эффективности трансфекции использовали плазмиду pcDNA3-EGFP, несущую ген зеленого флуоресцентного белка.

С помощью оптимизации последовательности нами были получены плазмидные конструкции pC4W-hVEGFopt[18], pC4W-hHGFopt[19] и pC4W-hAng-1 opt[20], несущие оптимизированные гены, соответственно, фактора роста эндотелия сосудов человека, фактора роста гепатоцитов человека и ангиопоэтина-1 человека (Ang-1opt) в векторе pC4W. Оптимизация генов заключалась в следующем: среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковых последовательностей указанных природных генов, выявляли такие, которые встречаются в генах человека наиболее редко. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты меняли на триплеты, кодирующие ту же аминокислоту, но при этом встречающиеся в генах человека наиболее часто. Кроме того, из кодирующих белок областей исходных генов теми же методами удаляли сигналы разрушения мРНК «АТТТА»[21] и сигналы по-лиаденилирования «ААТААА» с целью повышения стабильности матричных РНК. После модификации все аминокислоты природных генов VEGF165, HGF и ангио-поэтина-1 остались неизмененными.

Плазмидную ДНК получали в бактериях Е. coli штамма DH-5a. После трансформации соответствующими плазмидами бактерии культивировали согласно стандартной методике, а затем из них выделяли плазмидную ДНК при помощи колоночной технологии с использованием набора «Giga Endofree Kit» (Qiagen, США) в соответствии с протоколом производителя. Апирогенность выделенной ДНК оценивалась с помощью LAL-теста[Associates of Cape Cod, США).

Культура клеток и трансфекция. Для анализа продукции человеческих факторов роста hVEGF165, hHGF, hAng-1 использовали культуру клеток почки эмбриона человека НЕК293Т (System Bioscience, США). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки плода коровы. Для трансфекции 2 мкг плаз-мидной ДНК (1мг/мл) смешивали с 200 мкл 0,ЗМ СаС12 и 200 мкл 24HBS (50 мМ HEPES, 280 мМ NaCI, 1,5 мМ Na2HP04, pH 7,1) и добавляли к клеткам, растущим на чашке Петри диаметром 35 мм. Через 6-8 часов культуральную среду заменяли на среду DMEM без сыворотки, и клетки подвергали депривации в течение 48 ч. Образцы культуральной среды, собранные по истечении периода депривации, смешивали с коктейлем ингибиторов протеаз (Sigma, США) в соотношении 100:1 и хранили при -70°С до использования.

Гель-электрофорез и вестерн-блоттинг. Электрофорез образцов культуральной среды объемом 20^24 мкл проводили в полиакриламидном геле в присутствии до-децилсульфата натрия с последующим переносом белков из геля на PVDF-мембрану (Millipore, США). Для иммунодетекции использовали моноклональные антитела мыши к соответствующему фактору роста человека (RS.D Systems, США) и вторичные антитела козла к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена. Визуализацию связанных антител проводили при помощи двухкомпонентной системы ECL (Amersham, США) с последующей экспозицией на рентгеновской пленке в течение 1—10 мин в зависимости от интенсивности свечения. Для сравнения использовали препараты рекомбинантных белков hVEGF, hHGF и hAng-1 (BD Biosciences, США).

Количественное определение hVEGF, hHGF и hAng-1 методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Для определения содержания факторов роста в образцах культуральной среды использовали соответствующие наборы фирмы BioSource, США.

Модель ишемии задней конечности мыши и внутримышечное введение плазмидной ДНК. За основу была взята модель, описанная S. Takeshita и соавт.[22]. Для создания тяжелой острой ишемии использовали самцов мышей линии BALB-c весом 25^30 г, основным отличием которых от мышей часто используемой линии C57BI является незначительное развитие коллатерального кровотока и крайне тяжелая степень ишемии, возникающая после операции. Во избежание тотальных некрозов модель была модифицирована и представляла собой лигирование и иссечение a. femoralis и V. femoralis на протяжении средней трети бедра с сохранением п. ischiadicus. После операции 8 животных случайным образом распределяли в одну из двух групп: группу HGF (4 животных) и группу отрицательного контроля (4 животных). Животным группы HGF в каждую из трех крупных мышц бедра im. rectus femoris и в обе головки т. biceps femoris) однократно вводили по 50 мкл 0,9% раствора NaCI, содержащего плазмидную ДНК pC4W-hHGFopt в концентрации 1 мкг/мкл (суммарно 150 мкл). Животным группы отрицательного контроля аналогичным образом вводили 150 мкл 0,9% раствора NaCI. До и после операции всех животных содержали в одинаковых условиях, соответствующих требованиям института. На 7 и 14 сут. после операции по два животных каждой группы забивали, мышцы т. rectus femoris и т. biceps femoris замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С до дальнейшего анализа.

Выделение РНК и обратная транскрипция. Образцы мышц взвешивали и гомогенизировали в керамической ступке, охлажденной в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли из 30^40 мг мышечной ткани с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США), согласно протоколу производителя с последующей обработкой ДНКазой-1 (Qiagen, США) для гидролиза остаточной плазмидной ДНК и очисткой на колонках (Qiagen, США). Для получения кДНК 2 мкг тотальной РНК подвергали реакции обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы «Reveret-Aid» (Fermentas, Литва). Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Амплификацию фрагмента кДНК hHGF проводили с использованием Taq-полимерэзы (Fermentas, Литва) в стандартном буфере для ПЦР, содержащем 2mM MgCI2, 25нг кДНК, по 5рМ прямого и обратного праймеров, 0,2мМ dNTP и 3U Taq-полимерэзы. В качестве прямого и обратного праймеров использовали олигонуклеотиды, соответственно, 5'-ATGGTCATGGACCCTGGT-3' и 5'-GCCTGGCAAGCTTCATTA-3' (Синтол, РФ). ПЦР проводили в следующих условиях: денатурация ДНК в течение 5 мин при 95°С; затем 30 циклов, включавших денатурацию ДНК 30 сек при 94°С; отжиг праймеров 30 сек при 59°С и элонгацию ДНК 45 сек при 72°С. Вслед за этим проводили заключительную инкубацию 2 мин при 72°С. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Размер амплифицируе-мого фрагмента составлял 423 п.н.

Результаты

Определение содержания эндотоксина в плазмидных ДНК

Результаты LAL-теста показали, что содержание бактериальных эндотоксинов во всех плазмидных ДНК не превышало 10 ЕЗ/мг ДНК, что соответствует чистоте, заявленной производителем наборов для выделения плазмид — не более 100 ЕЗ/мг ДНК (Qiagen).

Продукция факторов роста HVEGF165, hHGF и hAng-1 трансфецированными клетками НЕК293Т

Клетки НЕК293Т трансфецировали плазмидами, несущими кДНК hVEGF165, hHGF и hAng-1. Эффективность трансфекции, оцененная по количеству EGFP-no-ложительных клеток при трансфекции плазмидой pcDNA3-EGFP, составляла 70 75%.

Содержание факторов роста в образцах культуральной среды, собранных через 48 ч после трансфекции, определяли при помощи иммуноферментного анализа (рис. 2) и методом вестерн-блоттинга (рис. 3).

Полученные результаты демонстрируют, что при использовании плазмидных конструкций на базе нового вектора pC4W содержание соответствующих факторов роста в культуральной среде во всех случаях оказывается выше, чем при использовании конструкций на базе традиционного вектора pcDNA3. Кроме того, оптимизация нуклеотидных последовательностей в генах hVEGFopt, hHGFopt и hAng-1opt дополнительно приводит к существенному увеличению продукции факторов трансфецированными клетками.

Анализ мРНК hHGF в тканях экспериментальных животных

В мышечных тканях животных, перенесших операцию лигирования и иссечения a. femoralis и v. femoralis и однократную иньекцию плазмидной ДНК pC4W-hHGFopt, экспрессию мРНК фактора роста гепатоцитов человека детектировали методом ПЦР до 14 сут. после инъекции. ПЦР-анализ (рис. 4) показал наличие мРНК hHGF в тканях животных, забитых на 7-е и 14-е сут. после операции и введения плазмиды. Амплифицируе-мый фрагмент кДНК hHGF отсутствует в образцах, полученных от контрольных животных, инъецированных раствором NaCI.

Обсуждение результатов

Проведено сравнительное исследование функциональной активности оригинальных плазмидных конструкций, созданных на базе нового вектора pC4W, несущих оптимизированные последовательности генов факторов роста hVEGFI 65, hHGF и hAng-1. В экспериментах по трансфекции культуры клеток человека НЕК293Т показано, что новый вектор имеет явное преимущество перед традиционным коммерческим вектором pcDNA3 в отношении уровня экспрессии трансгена. Кроме того, дополнительное увеличение экспрессии достигается за счет оптимизации нуклеотидных последовательностей экспрессируемых генов.

Результаты, полученные в опытах на животных, подтверждают экспрессионную активность плазмидных конструкций данного типа при введении в ткани животных. После однократной инъекции плазмидной ДНК в мускулатуру мышей с экспериментально вызванной ишемией задней конечности мРНК трансгена удается обнаружить через 7 и 14 сут. Эти данные во многом, согласуются с имеющимися в литературе, где максимальное количество мРНК трансгена регистрировали между третьим и седьмым днем после введения плазмиды в мышцы животных, а затем оно постепенно снижалось до следового уровня к 21-м сут.[14].

Полученные результаты показывают, что созданные новые плазмидные конструкции pC4W-hVEGFopt, pC4W-hHGFopt и pC4W-hAng-1 opt, предназначенные для экспрессии ангиогенных факторов роста, обладают активностью в культуре клеток человека и позволяют продуцировать факторы hVEGFI 65, hHGF и hAng-1 в более высоких концентрациях, чем конструкции на базе коммерческого вектора pcDNA3, несущего неоптими-зированные последовательности генов этих факторов.

Конструкции в настоящий момент проходят доклинические испытания на моделях ишемии скелетных мышц и миокарда у экспериментальных животных и в дальнейшем будут использованы для разработки подходов к комбинированной генной терапии ишемических заболеваний, основанной на применении взаимодополняющих сочетаний генов ангиогенных факторов роста.

Работа выполнена на базе лаборатории Ангиогенеза и лаборатории Клеточной Инженерии Института экспериментальной кардиологии ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехноло-гий; ООО «МОНА» и ООО «Генная и клеточная терапия».

Подняться вверх сайта