Поиск Кабинет

Нейрорегенераторная терапия травматической болезни спинного мозга: роль и перспективы использования трансплантации стволовых клеток

Гены & Клетки: Том II, №1, 2007 год, стр.: 36-44

 

Авторы

Зайцев А.Ю., Брюховецкий А.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В обзоре представлены современные представления о состоянии проблемы, существующих подходах и данные экспериментальных и клинических исследований по трансплантации различных типов стволовых клеток при травматической болезни спинного мозга на экспериментальных моделях у животных и в клинической практике. Показана перспективность применения клеточных технологий в коррекции неврологического дефицита при повреждении спинного мозга и неоднозначность данной проблемы. Рассмотрены возможные осложнения применения клеточной терапии в эксперименте и клинической практике, обсуждаются перспективы дальнейшего развития.

Введение

Неуклонный рост научно-технического прогресса привел к постоянно увеличивающейся урбанизации и механизации жизни населения. В свою очередь, это породило гигантские масштабы травматизма, что позволяет рассматривать данную проблему уже не только как медицинскую, а как острую социально-экономическую. Ежегодно в индустриально развитых странах мира от травм и их последствий погибают сотни тысяч людей и еще миллионы людей получают тяжелые увечья. В течение нескольких десятилетий травматические повреждения стали третьей по частоте причиной смерти (после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний] и первой причиной смерти в наиболее молодом и трудоспособном возрасте (18-45 лет].

По данным разных авторов, частота повреждений позвоночника и спинного мозга составляет от 0,44 до 4% всех травм (от 320 до 654 пострадавших на 10 млн населения], а статистический анализ позволяет прогнозировать 800 и более травмированных на 10 млн населения в ближайшем будущем. При этом отмечается постоянный значительный рост позвоночно-спинномозговой травмы (ПСМТ], и несмотря на значительные достижения в хирургии и анестезиологии-реаниматологии смертность от данной патологии остается достаточно высокой. Она колеблется от 16% до 64% пострадавших, в зависимости от уровня и тяжести повреждения позвоночника и спинного мозга. Сходным образом обстоит дело и с последствиями ПСМТ. В Российской Федерации ежегодно более 8000 человек становятся инвалидами вследствие ПСМТ [1 ]. Экономические затраты на лечение и медико-социальную реабилитацию пациентов с последствиями ПСМТ значительны. К примеру, только в США они составляют 14,5 млрд долларов в год.

Лечение травмы спинного мозга (СМ] является одной из наиболее трудных проблем современной неврологии и нейрохирургии. Со времен Рамон-и-Кахаля общепризнано, что не существует способов восстановления поврежденного СМ. Традиционно считалось, что возможность регенерации СМ резко ограничена в связи с необратимыми морфологическими изменениями в нервной ткани после повреждения. Однако за последнее время накоплены огромные экспериментальные данные и ограниченный клинический материал, свидетельствующий о принципиальной возможности регенерации в центральной нервной системе (ЦНС] и возможном восстановлении ее нарушенных функций [2-4]. Полученные научные факты позволяют с современных позиций пересмотреть канонизированные представления о регенераторном потенциале и саногенетических механизмах в ЦНС, а также предложить новые стратегии и концепции лечения повреждений СМ (рис.]. Большинство исследователей в этой области полагают, что будущее принадлежит технологиям регенераторной медицины. Основным инструментом регенераторной медицины являются различные клеточные технологии от трансплантации клеток (клеточная терапия] до генотерапии и тканевой инженерии [5, 6].

Клеточная терапия травматического повреждения СМ

В начале XX в. были предприняты первые попытки восстановления СМ с помощью трансплантации. Так, F. Tello в 1911 г. впервые применил трансплантацию кожного нерва бедра на модели ушиба СМ у собак [9]. Значительно позже, в 1940 г., O. Sugar и R.W. Gerard обнаружили спраутинг аксонов реципиента после трансплантации седалищного нерва в область перерезки СМ крыс, а C.C. Kao в 1977 г. показал возможность развития аксонов хозяина сквозь прижившуюся часть седалищного нерва у собак. В 80-х гг. XX столетия исследования вначале P.M. Richardson с соавт. в 1980 г. [10], а затем A.J. Aguayo продемонстрировали миелинизацию аксонов с последующей их регенерацией после трансплантации периферического нерва зрительного тракта в мост мозга в случае благоприятного клеточного окружения [11]. Однако данных за восстановление утраченных функций ЦНС в этих экспериментальных работах получено не было.

В середине 90-х гг. XX столетия исследования шван-новских клеток, выделенных из периферических нервов в экспериментальных моделях повреждения СМ, демонстрировали многообещающие результаты. Способность продуцировать миелин и ряд нейротрофических факторов (BDNF, NGF, реснитчатый фактор] [12, 13] выявила возможность участия шванновских клеток в аксональной регенерации. Трансплантация шванновских клеток на модели неполного повреждения СМ у крыс приводила к регенерации аксонов в области повреждения и к ограниченному аксональному росту краниальнее и каудальнее нанесенной травмы [14]. Однако в исследовании, опубликованном двумя годами раньше, спраутинга аксонов вне зоны повреждения отмечено не было [15]. Есть мнение, что трансплантация шванновских клеток приводит к ремиелинизации аксонов СМ по периферическому типу [2]. Описано несколько трансплантаций шванновских клеток больным с ТБСМ. Так Z. Hui с соавт. в 2005 г. представили частичное восстановление моторных функций СМ и чувствительности по шкале ASIA после хирургической трансплантации фетальных шванновских клеток 48 пациентам с ПСМТ не менее чем через год после повреждения [16]. Данные были подтверждены нейрофизиологическими методами исследования (ЭМГ, вызванные потенциалы]. Никаких осложнений, связанных с трансплантацией клеток и проведением оперативного вмешательства отмечено не было. S. Ji-Hong с соавт. в 2005 г. также показали улучшение неврологических показателей по шкале ASIA после трансплантации шванновских клеток 37 пациентам [17].

Возможно, генетические модификации шванновских клеток с целью увеличения выделения нейротрофических факторов улучшат результаты лечения пациентов с ТБСМ [18, 19]. Во всяком случае, в некоторых сравнительных экспериментальных исследованиях была продемонстрирована более выраженная возможность скопления в пределах СМ, увеличения роста аксонов и их ремиелинизации при трансплантации генмодифицированных шванновских клеток [20]. Так же наблюдалось частичное восстановление паретичных конечностей у экспериментальных животных.

В экспериментах на крысах активация макрофагов путем контакта с периферическими нервами и последующей трансплантацией в СМ уменьшает повреждение ткани и способствует восстановлению функции СМ. Сейчас закончена I фаза (в Израиле и Бельгии] и продолжается II фаза (в Израиле и США] клинических испытаний активированных макрофагов, которые предварительно показывают эффективность проводимой терапии в течение двух недель после травмы [3].

Все же основные исследования клеточной терапии связаны с применением различных типов стволовых клеток.

Трансплантация эмбриональных стволовых клеток и фетальных тканей

Клиническое применение трансплантации стволовых клеток (СК] для лечения повреждения СМ началось в 90-х гг. XX столетия. Этому в первую очередь способствовало выделение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК] из бластоцисты мыши M.J. Evans и M.H. Kaufman [21 ], введение термина «эмбриональная стволовая клетка» G.R. Martin в 1981 г. [22], выявление способности клеток человеческой эмбриональной карциномы дифференцироваться в нейроноподобные и другие типы клеток [23-25]. В настоящее время свойства ЭСК достаточно хорошо изучены. Им свойственна бесконечная пролиферация симметричным делением, клоногенность (способность образования из одной первоначальной линии ЭСК целой линии генетически идентичных СК], плюрипотент-ность (возможность формирования любого из 200 клеточных типов] [26, 27]. При этом описаны случаи трансплантации как СК эмбриональных тканей, так и ЭСК (из бластоцисты].

Первую трансплантацию эмбриональной нервной ткани произвел G. Conte в 1907 г., а позднее R. May в 1957 г. [5]. Трансплантации были проведены в головной мозг и в переднюю камеру глаза млекопитающих. В этих экспериментальных исследованиях был отмечен рост трансплантированной эмбриональной ткани, ее функциональная активность и дифференциация клеточных элементов. Трансплантацию эмбриональной ткани на модели спинальной травмы представили A. Bjorklund и U. Stenevi в 1984 г. [28]. Была показана возможность использования эмбриональной ткани в качестве «моста» для регенерации центральных аксонов через дефект ткани СМ. Растущие аксоны регенерировали в эмбриональный трансплантат с формированием связей. Однако, несмотря на улучшение некоторых функций СМ, прорастания сквозь эмбриональные клетки отмечено не было, что, вероятно, связано с ростом аксонов нейрональных клеток трансплантата с формированием новых синаптических связей.

Применение трансплантации ЭСК на модели спинальной травмы показало, что они способны встраиваться в поврежденные участки СМ, дифференцироваться в правильном направлении и принимать участие в нормальном развитии клеток СМ [29-31]. В работах O. Brustle, G.E. Duncan и R. McKay была показана дифференцировка ЭСК в олигодендроциты с последующей миелинизацией аксонов у взрослых крыс [32]. В России А.С. Брюховецкий в 90-х гг. XX столетия продемонстрировал возможность аксонального роста с прорастанием через глиальный рубец при трансплантации ЭСК в область хирургического пересечения СМ у крыс [33]. При этом отмечалось некоторое восстановление утраченных функций СМ.

В настоящее время описано несколько клинических исследований по трансплантации фетальных тканей у больных с последствиями ПСМТ. Первая успешная трансплантация фетальных тканей у пациентов с ПСМТ и повреждениями ГМ была произведена А.С. Брюховецким и соавт. в 1993 г. в рамках закрытой программы Министерства обороны Российской Федерации. Несколько позднее этой же группой исследователей с целью трансплантации стали применять суспензию клеток эмбриона до 12 недель гестации, которые также показали эффективность восстановления функций СМ и ГМ [5]. С.С. Рабинович с соавт. в 2000 г. провели пересадки эмбриональной ткани у пациентов с последствиями ЧМТ и ПСМТ [34, 35]. В данных клинических исследованиях была показана не только клиническая эффективность трансплантации, но и иммунологическая безопасность метода [36].

В ряде исследований не удалось обнаружить прорастание аксонов сквозь трансплантат более чем на 1-2 мм в каудальную часть СМ после трансплантации фетальной ткани [37-39]. Напротив, трансплантация ЭСК на модели СМ у новорожденных щенков показала спраутинг аксонов более чем на 4 мм дистальнее от места повреждения [40].

Несмотря на обнадеживающие данные экспериментальных и клинических исследований трансплантация эмбриональных тканей и ЭСК может являться причиной неудовлетворительных результатов и различного рода осложнений. Наиболее важной проблемой трансплантации ЭСК является иммунологическое отторжение реципиентом [41]. Несмотря на то, что ЭСК изначально являются иммунотолерантными, по мере их «созревания» они приобретают иммуногенные свойства [42]. Независимо от подбора донора и реципиента по антигенам главного комплекса гистосовместимости и учитывая успехи иммуносупрессивной терапии, вероятность отторжения остается крайне большой. Кроме того, существует реальная угроза туморогенной опасности трансплантации ЭСК, что было показано в экспериментах на животных (формирование тератом после трансплантации ЭСК у крыс] [43, 44]. Невозможность воспроизведения многочисленных факторов (механическое натяжение, разнообразные электрические поля, комплексы структурных микроокружений для нормальной активации необходимых генов, нормальная экспрессия генов] для корректной дифференцировки представляет высокий риск образования опухолей после трансплантации ЭСК [42]. Нельзя обойти вниманием и этические проблемы использования фетальных тканей и ЭСК. Например, в США разрешено использовать только имеющиеся в наличии линии ЭСК [2].

Таким образом, несмотря на обнадеживающие данные об аксональном росте и восстановлении утраченных функций СМ как в экспериментальных моделях на животных, так и при клиническом применении, трансплантация эмбриональной ткани и ЭСК не могут быть рекомендованы к широкому клиническому применению из-за иммунологических, религиозных и этических проблем, возможности образования опухолей. В свою очередь, только ЭСК имеют полный потенциал для репарации ЦНС. Именно ЭСК могут размножаться и дифференцироваться в клетки новых тканей, мигрировать и интегрироваться в существующие ткани, активировать гены, стимулирующие репарацию, индуцировать дегенерирующие клетки к восстановлению.

Попытки решения проблемы иммунных реакций при использовании ЭСК в настоящее время связаны со способностью изменить характеристики ЭСК с помощью генноинженерных манипуляций, терапевтического клонирования, выращивания человеческих органов в организме животных и создания банка эмбрионов со специфическими иммунными характеристиками [42]. Однако при использовании генно-инженерных манипуляций и клонирования высок риск появления генетических мутаций, которые сложно определить до трансплантации, а данных о функциональности клеток при выращивании человеческих органов в организме животных на сегодняшний день не получено. Создание банка ЭСК или эмбрионов связано с серьезными этическими и религиозными проблемами.

Трансплантация нейрональных стволовых клеток

Следующим направлением в регенераторной клеточной терапии можно считать трансплантацию предшественников нейрональных клеток или нейрональных стволовых клеток (НСК], которые получают из нейроэпителия эмбриона [45]. Это клетки, которые получили нейрональную дифференци-ровку путем направленного культивирования СК. НСК наиболее часто используются в экспериментальной трансплантации для лечения моделей неврологических заболеваний (паркинсонизм, болезнь Кребба, болезнь Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, инсульт и др.], в том числе и при повреждении СМ [2]. Сегодня точно не известно, какие типы дифференцированных нейрональных клеток необходимы для замещения утраченных функций ЦНС. Поэтому нейрональные клетки-предшественники могут идеально подходить для этой цели, так как показана возможность их нейрональной дифференцировки, аксонального роста с предположительным морфологическим доказательством образования нового синапса и иммунологическим доказательством образования холинергических, серотонинергических, Г АМК-ергических, глицинергических и глутаматергических нейронов [32, 46, 47].

Первой демонстрацией успешного лечения и восстановления повреждения СМ были эксперименты J.W. McDonald с соавт. в 2000 г. [30]. На модели постконтузионной кисты СМ была выявлена дифференцировка ЭСК в нейрональные клетки-предшественники, которые впоследствии были успешно пересажены. Трансплантированные клетки выжили, мигрировали на большие расстояния и дифференцировались на 3 основных типа клеток нервной ткани: нейроны, астроциты и олигодендроциты. У экспериментальных животных было отмечено значительное восстановление функций СМ. Параллельно S. Liu с соавт. в 2000 г. была показана возможность значительной ремиелинизации с правильными анатомическими характеристиками после трансплантации нейрональных клеток предшественников в поврежденную взрослую нервную систему [29]. Более того, имплантация, выживание и миграция более чем на 1 см от места введения были продемонстрированы с помощью магниторезонансной томографии с меченными парамагнетическими агентами НСК и полимеразциклической реакции в реальном времени [30]. Y. Fujiwara с соавт. в 2004 г. после внутривенного введения НСК из фетального гиппокампа продемонстрировали их миграцию в область повреждения СМ, дифференцировку в нейроны, астроциты и олигодендроциты и восстановление утраченных неврологических функций у иммунокомпетент-ных крыс [48]. A. Iwanami с соавт. в 2006 г. также показал возможность уменьшения неврологического дефицита после трансплантации НСК мартышкам с экспериментальной травмой СМ и иммуногистохимическими доказательствами дифференцировки этих клеток в нейроны, астроциты и олигодендроциты[49]. Усиление регенераторного потенциала НСК связывают, в первую очередь, с направлением диф-ференцировки в нейроны и олигодендроциты путем различных генно-инженерных манипуляций [50, 51].

К сожалению описания клинического применения трансплантации НСК у пациентов с ТБСМ как в раннем, так и в отдаленных периодах заболевания не найдено. Поэтому изучение применения трансплантации НСК должно быть продолжено, в том числе и с позиций доказательной медицины.

НСК неспособны к неограниченному росту, так как подчиняются лимиту Хайфлика (40 делений in vitro] и, соответственно, теоретически имеют более низкий репаратив-ный потенциал. Трансплантация НСК также не исключает иммунологическое отторжение, этические и религиозные проблемы [2].

Таким образом, накоплен опыт экспериментального и клинического применения трансплантации НСК при повреждении СМ. Однако ее широкое применение сдерживается теми же проблемами, которые характерны для ЭСК. Попыткой обойти серьезные ограничения применения ЭСК и НСК явились исследования стволовых клеток выделенных из дифференцированных тканей (постнатальные или соматические СК] взрослого организма (костный мозг, головной мозг, печень и т.д.].

Трансплантация соматических стволовых клеток (ССК)

После обнаружения СК в различных органах, включая СМ, НСК стали получать из различных типов клеток (гемо-поэтические и мезенхимальные клетки костного мозга, стволовые клетки пуповинной крови и т.д.] [52]. Уникальной способностью ССК является пластичность, то есть способность дифференцироваться в клетки, характерные для других тканей (например, гемопоэтическая стволовая клетка при определенных условиях может превращаться в клетки с основными характеристиками нейронов] [53, 54]. В отличие от ЭСК соматические стволовые клетки (ССК] имеют ограниченный пролиферативный потенциал с симметричным делением при самовоспроизведении и асимметричным делением при трансформации в клетки-предшественники, мульти- или унипотентность, ограниченную способность роста в культуре. Однако, в отличие от дифференцировочного потенциала, «терапевтический потенциал» ССК неограничен. К тому же, до конца не ясно различие между дифференцировочным потенциалом ЭСК и ССК. Имеется мнение, что этот потенциал у различных СК одинаков [42].

В экспериментальных моделях на животных и в предварительных экспериментах на людях с заболеванием ЦНС показана эффективность трансплантации различного типа ССК (мезенхимальные клетки, обонятельные обкладочные клетки, гемопоэтические клетки], так как данные клетки могут дифференцироваться в нейрогенном направлении.

НСК из обкладочных обонятельных клеток (обкладочные клетки обонятельного анализатора, обкладочные обонятельные клетки нейронального эпителия, обонятельные оболочечные клетки, глиобонятельные клетки)

Клетки обонятельной выстилки - это особые глиальные клетки, схожие со шванновскими клетками и астроцитами. Они встречаются и в периферической нервной системе в ЦНС совместно с обонятельными аксонами [55]. Нейроны обонятельного эпителия уникальны тем, что в течение жизни они постоянно обновляются и направляют рост аксонов из периферической нервной системы в ЦНС [2]. Природа НСК, полученных из биоптатов обонятельной области слизистой оболочки носа, остается неясной. Это могут быть как клетки обонятельного нейронального эпителия, так и клетки базального слоя «обонятельного эпителия». Однако, невзирая на это, для них характерно образование нейросфер независимо от возраста доноров, экспрессия нестина и нейрональных маркеров глии и нейронов [56]. Получить обкладочные нейроэпителиальные клетки (ОНК] можно как из эмбрионов (фетальные ОНК] [57], так и непосредственно от человека или животного (аутогенные ОНК], которому будет проводиться трансплантация.

Впервые обкладочные нейроэпитальные клетки (ОНК] из обонятельной области слизистой оболочки носа взрослого человека были выделены F.J. Roisen с соавт в 2001 г. из биоптатов после септопластики и турбинэктомии [58]. В 2004 г. X. Zhang с соавт. также сумел получить НСК из обонятельной области слизистой оболочки носа [59]. Кроме того, L.A. Carter с соавт. и X. Chen с соавт. в 2004 г. показали возможность дифференцировки клеток базального слоя обонятельного эпителия в нейрональном направлении [60, 61]. В дальнейших работах было продемонстрировано, что ОНК обладают мультипотентностью, а их дифференциров-ка зависит от наличия в культуральной среде тканеспецифичных растворимых факторов (например, при добавлении в культуру гепатоцитов, клетки нейросфер экспрессировали альбумин и ферритин, кардиомиоцитов - а-актин и тропонин I и т.д.] [56]. Применение трансплантации ОНК в экспериментальном лечении ТБСМ показало высокую эффективность аксональной регенерации. ОНК способны дифференцироваться в нейроны и олигодендроциты, мигрировать в близлежащие ткани, способствовать аксональному росту на длинные расстояния и миелинизировать оголенные аксоны в культуре [2, 62]. G. Raisman с соавт. на модели одностороннего повреждения пирамидного тракта у крыс показали аксональный рост в дистальную культю СМ, дифференцировку в шванновские и фибробластоподобные клетки с формированием оболочки регенерирующих аксонов после пересадки ОНК с использованием трансплантата-проводника [63]. В данной работе было продемонстрировано формирование нормальных взаимосвязей с нейронами и последующим покрытием новых аксонов олигодендроцитами. Наблюдение за животными показало восстановление условного рефлекса после трансплантации ОНК. Наличие аксональной регенерации, миграции ОНК и выживания этих клеток, по крайней мере, спустя 6 месяцев после трансплантации также было обнаружено S. Tiansheng с соавт., S. Huiyong с соавт. и H .Y. Shen с соавт. в 2005 г. на модели экспериментального повреждения СМ у крыс [64-66]. Liu в 2001 г. и L.M. Ramer с соавт. в 2004 г. продемонстрировали возможность уменьшения неврологического дефицита на модели полного перерыва СМ у крыс [67]. Возможно, что механизм действия ОНК может быть связан с выделением нейротрофических факторов [68].

В настоящее время проводится I-II фаза нескольких клинических испытаний [69]. По данным F. Feron с соавт. (2005] трансплантация ОНК оперативным путем трем пациентам с ПСМТ на торакальном уровне не привела к развитию серьезных осложнений в периоперационном периоде [70]. Однако пока еще рано судить об онкологической безопасности, так как после трансплантации прошел всего 1 год. К тому же не представлена клиническая эффективность метода. Завершение I фазы слепого контролируемого клинического испытания планируется через 2 года.

В России в клинике «НейроВита» проведено 18 оперативных трансплантаций аутогенных ОНК в специальном био-деградируемом геле «Сферогель» (тканевая инженерия СМ] как чистой культуры, так и комбинации аутогенных ОНК с аутогенными гемопоэтическими стволовыми клетками (CD34+] (неопубликованные данные]. Непосредственно от клеточной трансплантации осложнений выявлено не было (образования опухолей, «плюс»-ткань в месте трансплантации и т.д.], то интра- и послеоперационные осложнения имели место (спинальный шок, массивная кровопотеря, ликворная гипертензия, ликворея и т.д.]. У 50% пациентов отмечалось частичное регрессирование неврологической симптоматики.

Таким образом, экспериментальные и клинические исследования свидетельствуют о возможной высокой эффективности трансплантации обкладочных обонятельных клеток нейронального эпителия у пациентов с ТБСМ в позднем периоде. Клинических данных трансплантации ОНК недостаточно, чтобы судить об их окончательной безопасности и эффективности.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (MMCK)

Эти клетки были впервые выделены А.Я. Фриденштей-ном в середине 70-х гг. XX века. Источником ММСК служат различные ткани организма, но наибольшая их популяция определяется в костном мозге. Альтернативой получения ММСК рассматривают жировую ткань, периферическую и пуповинную кровь [71]. Впервые в эмбриогенезе ММСК обнаруживаются в нервном гребне. В дальнейшем ММСК мигрируют с целью образования каркаса и управления развитием паренхимы будущих внутренних органов [72]. В постнатальном онтогенезе ММСК служат источником соединительной, хрящевой, костной, мышечной, жировой тканей и т.д., участвуют в поддержании пролиферации прогениторных клеток. Выяснена возможность дифференциации ММСК в различные клетки организма (адипоциты, миофибробласты, строму кроветворной ткани, остеоциты и хондроциты] [73, 74], в том числе и нейрональные клетки. При этом показано, что ММСК могут спонтанно экспрессировать нейрональные маркеры [75]. J. Kohyama с соавт. в 2001 г. обнаружили дифференцировку ММСК костного мозга в нейроны и глию, которые впоследствии формировали аксоны, экспрессировали нейронспецифические маркеры (MAP2, NF, Nestin, GFAP] и отвечали на стимулы как функционально зрелые нейроны [76]. J.R. Sanchez-Ramos с соавт. и L. Buzanska с соавт. в 2001 г. индуцировали дифференцировку ММСК пуповинной крови в нейрональные клетки под действием ретиноевой кислоты и некоторых факторов роста (EGF, BDNF] [77, 78]. J. Vanquero с соавт. в 2006 г. продемонстрировали эффективность трансплантации стромальных клеток костного мозга крысам с экспериментальной параплегией задних лап. Причем непосредственная трансплантация в область повреждения была более эффективной по сравнению с системным введением в хвостовую вену [79]. В исследовании C.V. Borlongan с соавт. в 2004 г. также была продемонстрирована невозможность миграции ММСК через гематоэнцефалический барьер. Однако ММСК стимулировали нейро- и ангиогенез [80]. L. Urdzikova с соавт. в 2006 г. при экспериментальном повреждении СМ у крыс путем сжатия с помощью раздувания баллона, трансплантировали меченные оксидом железа ММСК [81]. Было отмечено накопление меченых клеток в области повреждения при гистологическом исследовании и улучшение поведенческих функций по шкале Basso-Beattie-Bresnehan locomotor (BBB]. Восстановление функции СМ после трансплантации ММСК крысам с экспериментальной моделью травмы СМ отмечали M. Koda с соавт. в 2005 г. и D. Cizkova с соавт. в 2006 г. [82, 83].

С другой стороны, М.А. Александровой с соавт. в 2006 г. не удалось обнаружить нейрональное развитие ММСК, не содержащих НСК ни в условиях культивирования, ни после трансплантации в головной мозг (ГМ] крысам, подвергнутым гипоксии. Несмотря на существующее мнение о влиянии клеточного микроокружения на дифференцировку клеток, для ММСК этого отмечено не было. Также не было зафиксировано миграции трансплантированных культур ММСК по тканям ГМ. Трансплантация ММСК приводила к сильнейшему глиозу, инвазии макрофагов, а сами ММСК быстро резорбировались. Однако отмечалось прорастание отростков нейронов в область трансплантата, что указывает на стимуляцию аксонального роста после трансплантации [84]. Полученные данные подтверждаются многочисленными исследованиями, которые демонстрируют возможность выделения ММСК различных цитокинов, трофических и ростовых факторов, что, в свою очередь, приводит к аксональному росту и стимуляции роста сосудов [85, 86].

Описано клиническое наблюдение восстановления моторной функции нижних конечностей и чувствительности после трансплантации ММСК пуповинной крови в область повреждения СМ на уровне TX-TXII после ляминэктомии [87]. Данные о снижении неврологического дефицита были подтверждены нейрофизиологическими методами исследования. Однако, по мнению А.В. Берсенева, в этой работе не было проведено четкой дифференцировки принадлежности клеток к различным клеточным популяциям. Соответственно, нельзя исключить возможности действия других клеток, например, моноцитов и их предшественников.

Необходимо отметить, что после трансплантации ММСК существует угроза возникновения гетеротопических оссифи-катов [88]. Имеются данные об образовании диффузных каль-цификатов легких у собак и кальцификатов в миокарде у крыс после трансплантации костного мозга. Однако результаты экспериментальных исследований J. Gao с соавт. в 2001 г. и S.M. Devine с соавт. в 2003 г. по системной трансплантации ММСК крысам и обезьянам не показали образования гетеротопических оссификатов [89, 90]. Также не было отмечено образования оссификатов после внутривенной трансфузии аллогенных ММСК людям. Хотя отдаленные результаты данных исследований неизвестны.

Кроме того, имеются данные о спонтанной онкогенной трансформации ММСК человека в культуре без участия факторов роста при длительном культивировании и о преобразовании этих клеток в саркому Юинга [91 ]. С другой стороны, имеются данные о прямом противоопухолевом действии ММСК при саркоме Капоши из-за подавления протеинки-назы-Akt [92].

Еще одним свойством ММСК является их иммуномодулирующее действие [93]. Экспериментальные ксеногенные и аллогенные трансплантации на модели инфаркта миокарда у крыс, иммунокомпетентных состояний различных животных, а также при несовершенном остеогенезе и различных лейкозах у людей показали отсутствие и возможность подавления реакции трансплантата против хозяина после применения ММСК [94]. Такие иммунорегуляторные свойства ММСК выгодно отличают их от других видов СК [83]. В настоящее время разработаны методы получения и применения аутогенного клеточного материала.

Таким образом, применение трансплантации ММСК с целью лечения ТБСМ в позднем периоде может приводить к регрессу неврологической симптоматики. Однако применение трансплантации ММСК не может в настоящее время быть рекомендовано к широкому клиническому применению из-за возможности развития гетеротопических оссифика-тов и опухолей. Поэтому необходимы дополнительные доклинические исследования. Хотя в настоящее время в Южной Корее проводится I фаза клинических испытаний трансплантации ММСК.

Гемопоэтические стволовые клетки

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК] сегодня является наиболее изученной. Именно трансплантации ГСК открыли эру клинической клеточной трансплантологии, когда для лечения некоторых заболеваний крови были проведены пересадки костного мозга [95]. Первые трансплантации костного мозга были выполнены G. Mathe и Е. Thomas в 1965-1968 гг. для лечения больных с ятрогенной гемопоэтической недостаточностью. В России первая трансплантация костного мозга была осуществлена А.Е. Барановым в 1 974 г. Длительный опыт применения трансплантации ГСК в онкогематологии показал достаточную безопасность наряду с выраженной клинической эффективностью.

Наиболее достоверным методом измерения количества ГСК является анализ колоний in vitro (проба гемопоэтичес-ких предшественников на КОЭ] [95]. Однако для данного метода необходимы длительные сроки постановки пробы. Поэтому наиболее часто ГСК определяют по экспрессии определенных поверхностных антигенов. Для человеческих ГСК фенотипический набор экспрессируемых маркеров определяется как CD34+, CD59+, Thy1+, cD38-, C-kit-, lin-. При этом в основном подсчет и выделение ГСК основывается на определении CD34+ клеток. Отсортированные на прочном флюориметре клетки кроме истинных самоподдерживаю-щихся ГСК также содержат короткоживущие предшественники и небольшое количество нестволовых клеток [42].

В настоящее время ГСК получают из костного мозга (CD34+ экспрессируют 1-4% клеточного состава], периферической (CD34+ экспрессируют 0,1 % клеточного состава] и пуповинной/плацентарной крови [95]. Наряду с ММСК и ОНК стволовые клетки крови интересны с клинической точки зрения, так как при их трансплантации можно использовать аутогенную модель клеточной терапии. Наиболее привлекательным способом получения ГСК является их мобилизация в периферическую кровь с помощью гранулоци-тарного (Г-КСК] или гранулоцитарно-макрофагального (ГМ-КСК] колониестимулирующего фактора за счет блокирования клеточного фактора 1 в костном мозге [42]. При этом количество ГСК из периферической крови в два раза больше, чем из пунктата костного мозга. Кроме того, они лучше приживаются при аллогенных трансплантациях. В то же время использование аутогенного материала позволяет избежать наличия иммунологических осложнений.

Исследования свойств ГСК показали их высокий пролиферативный потенциал, способность к мультилинейной диф-ференцировке и трансдифференцировке in vivo и in vitro [26]. Открытие способности ГСК трансдифференцироваться в нейральные линии в сочетании с доступностью ГСК сместило фокус внимания на применение ГСК в качестве многообещающего подхода замещения клеток при поражении ЦНС [53, 82, 96]. Было проведено значительное число исследований, изучающих регенеративную способность ГСК при ишемическом повреждении ГМ путем мобилизации собственных ГСК (эндогенный подход], либо трансплантации ГСК (экзогенный подход] [97, 98]. A.E. Willing с соавт. в 2003 г. показали, что клетки костного мозга грызунов мигрируют в ГМ при трансплантации предварительно облученным реципиентам и дифференцируются на микроглию и астроциты [99]. При этом внутривенный путь введения оказался более эффективным, чем интрастриарный. O.E. Sigurjonsson с соавт. в 2003 г. показали, что большое количество взрослых ГСК человека, введенных в СМ эмбриона цыпленка дифференцируется в нейроны [100]. Автор приходит к выводу, что в костном мозге человека есть популяция ГСК, которая имеет нейрогенетический потенциал и в соответствующем микроокружении может дифференцироваться в нейроны. M. Chopp с соавт. в 2000 г. [101] и S. Koshizuka с соавт. в 2004 г. [102] продемонстрировали, что трансплантация ГСК из костного мозга в поврежденный СМ мышей улучшила функциональное восстановление задних конечностей. Мыши после трансплантации могли ходить, частично распределяя свой вес на задних лапах, тогда как в контрольной группе животных этого не отмечалось. Некоторые трансплантированные ГСК, выжившие в месте повреждения, дифференцировались в глиальные клетки и нейрональные предшественники.

Интересно отметить, что мобилизация ГСК предварительным введением Г-КСФ может оказывать нейропротективное воздействие при повреждениях ЦНС. Несколько преклини-ческих исследований отметило функциональное улучшение у крыс с очаговой церебральной ишемией после подкожного введения Г-КСФ за счет мобилизации ГСК из костного мозга и анти-апоптозного действия [81, 97, 103]. Однако данный факт нуждается в дальнейшем серьезном изучении.

Имеется клиническое наблюдение трансплантации аутогенных клеток костного мозга с подкожным введением Г-КСФ у 5 пациентов с ПСМТ в позднем периоде [104]. После проведенной трансплантации у всех пациентов наблюдалось улучшение сенсорной чувствительности и движения в течение 7 месяцев (у 4 пациентов с А до С по шкале ASIA, у одного пациента с А до B по шкале ASIA]. Выраженных осложнений у пациентов отмечено не было.

В России в клинике «НейроВита» имеется опыт субарах-ноидальной трансплантации аутогенных ГСК более чем у 75 пациентов с ТБСМ в позднем периоде с оценкой неврологического статуса с помощью специально разработанных шкал, международных шкал (ASIA, ISCSCI-92, FIM] и нейрофизиологических методов исследования (ЭНМГ, ССВП, транскраниальная магнитная стимуляция, ЭЭГ] [105]. Результаты исследований показывают эффективность применяемой методики более чем у 50% пациентов. При этом серьезных осложнений ни у одного пациента отмечено не было.

В то же время есть ряд научных работ, которые показывают возможность участия ГСК в развитии формирования опухолей, усилении их ангиогенеза, образовании метастатической ниши и прогрессировании опухолевого роста [106]. Однако длительный опыт клинического применения трансплантации ГСК в онкогематологии показывает их безопасность.

Ряд серьезных осложнений при трансплантации костного мозга и ГСК был отмечен в связи с токсичностью криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО] [107]. У ряда пациентов отмечалось развитие энцефалопатии, комы, судорог и дыхательной недостаточности. Снижение концентрации ДМСО до 5% и «отмывка» ГСК перед трансплантацией позволяет избежать развития осложнений и не влияет на качество жизнеспособности CD34+ клеток.

Таким образом, экспериментальные работы на модели повреждения головного и спинного мозга подготовили базу для возможности внедрения трансплантации ГСК у пациентов с ТБСМ в позднем периоде. Длительный опыт применения трансплантации ГСК в онкогематологии показывает не только безопасность данной методики, но и дает реальные преимущества перед трансплантацией других видов стволовых клеток. Только для ГСК разработаны и проверены в течение длительного времени методы забора, культивирования и длительного хранения, которые широко применяются в клинической практике. Разработанные методы использования аутогенного материала исключают возможность появления иммунологических осложнений в виде реакции «трансплантат против хозяина» и почти сводят на нет этические, религиозные и многие правовые вопросы клинической клеточной трансплантологии. В то же время клинический опыт применения трансплантации ГСК при ТБСМ почти отсутствует.

Заключение

Многочисленные экспериментальные работы по исследованию свойств различных стволовых клеток и трансплантации на моделях повреждения СМ показывают возможность их применения в клинической практике. Если применение эмбрионального материала сдерживается в основном этическими и религиозными проблемами, то трансплантация ССК может с успехом использоваться для лечения различных заболеваний, в том числе и у пациентов неврологического и нейрохирургического профилей. Безусловно, полностью экстраполировать данные экспериментальных работ в клиническую практику будет невозможно. Но даже частичное восстановление неврологического дефицита может существенно улучшить социальную адаптацию и качество жизни многих пациентов.

Искусственное сдерживание внедрения клеточных технологий, связанное с боязнью трансформации «взрослых» стволовых клеток в различного рода опухоли, в большей степени надуманно и без накопления клинического опыта никогда не будет преодолено. Тем более, что немногочисленные пилотные исследования показывают эффективность и безопасность трансплантации различных СК. Организация контролируемых рандомизированных исследований, а тем более - мультицентровых испытаний, к сожалению, сдерживается рядом морально-этических аспектов и иногда -отсутствием финансовых средств для их проведения.

В то же время, экспериментальные и клинические исследования не могут на сегодняшний день ответить на достаточно простые и актуальные вопросы, связанные с трансплантацией СК. Даже в проводимых на I-II стадиях разных рандомизированных исследований в области клеточных технологий при ТБСМ не получен ответ о необходи- мом количестве СК, клеточной структуре трансплантата и длительности терапии, необходимой для восстановления нарушенной функции СМ. Также это касается способов и путей введения СК. Экспериментально показано, что трансплантация СК с той или иной степенью эффективности может осуществляться внутривенным, субарахноидальным (интратекальным] введением, применением различных подходов тканевой инженерией СМ. Учитывая строение ге-матоэнцефалического барьера человека и его защитные функции, внутривенные трансплантации не скоро найдут клиническое применение у пациентов с ТБСМ. Показания и противопоказания к субарахноидальному введению и, особенно, к тканевой инженерии СМ в настоящий момент четко не определены. Наш небольшой опыт клинического применения трансплантации ОНК демонстрирует, что показаниями для оперативной тканевой инженерии с реконструкцией позвоночника и СМ может быть наличие у больного сдавления СМ; ликвородинамических нарушений и/или полный функциональный перерыв СМ при отсутствии эффекта от предыдущих субарахноидальных трансфузий СК в течение 1 года. Расширение показаний допустимо, но необходимо учитывать постоянно существующий риск оперативного вмешательства, так как большое количество пациентов неоднократно оперировано до применения клеточных технологий. Последующие оперативные вмешательства на позвоночнике и СМ обычно сопровождаются типичными осложнениями (кровопотеря, трудность пластики твердой мозговой оболочки с развитием ликвореи, формирования грубого рубцово-спаечного процесса и т.д.]. Абсолютные и относительные противопоказания к суба-рахноидальной трансфузии АГСК были представлены в предыдущей нашей публикации и также нуждаются в уточнении и обсуждении.

Остается неясным срок ПСМТ и возраст пациентов, у которых возможно применение клеточных технологий. Трансплантация ССК в острейший, острый и, возможно, в ранний период ТБСМ, вероятно, не приведет к достижению желаемых результатов из-за выраженности процессов воспаления, перекисного свободнорадикального окисления липидов и связанной с ними гибелью клеток. Поэтому трансплантацию СК более целесообразно проводить через 2-6 месяцев после ПСМТ. Уменьшение пула СК с возрастом ограничивает в настоящее время использование клеточных технологий у пациентов пожилого и старческого возраста. Однако, как было показано выше, это утверждение не относится к ММСК.

Сегодня многим исследователям становится ясно, что вряд ли экспериментальные исследования на животных смогут дать ответы на эти и многие другие вопросы. Только клинические исследования покажут окончательную безопасность и эффективность трансплантации СК. С другой стороны, необоснованное и необдуманное применение клеточных технологий может навредить как пациенту, так и еще не до конца сложившейся методике.

Таким образом, в настоящее время созданы необходимые патофизиологические и экспериментальные предпосылки для начала применения трансплантации СК у пациентов с ТБСМ. Однако для доказательства безопасности и эффективности трансплантации СК, выработки клинических аспектов трансплантации необходимо быть крайне осторожными, глубоко изучать каждый случай клеточной трансплантации и ее осложнений, подключить современные методы медицинской генетики и молекулярной биологии. Несомненно, будущее современной медицины во многом связано с развитием новых клеточных технологий, но только путь серьезных и взвешенных исследований и решений приведет к истине.

Подняться вверх сайта