Поиск Кабинет

Нейральные маркеры, используемые при изучении дифференцировки стволовых клеток

Гены & Клетки: Том V, №3, 2010 год, стр.: 57-65

 

Авторы

Коржевский Д.Э., Петрова Е.С., Кирик О.В., Безнин Г.В., Сухорукова Е.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучение дифференцировки стволовых клеток позволяет обосновать целесообразность использования и подтвердить клиническую эффективность новых разработок в области клеточных технологий. В настоящее время для оценки дифференцировки стволовых клеток широко используются методы иммуноцитохимического выявления синтезируемых ими маркерных белков. В настоящем обзоре дана характеристика наиболее часто применяемых маркеров нейральной дифференцировки, используемых при исследовании гистобласти-ческих потенций стволовых (в том числе нейральных стволо-вых/прогениторных) клеток. К таким нейромаркерам относятся ядерный белок нервных клеток NeuN, р-тубулин III, ассоциированный с микротрубочками белок МАР2, белки нейрофи-ламентов, нейрон-специфическая енолаза, синаптофизин и связанная с полисиаловой кислотой молекула адгезии нервных клеток (PSA-NCAM). В работе проведена оценка специфичности этих маркеров, выявлены преимущества и недостатки использования методов их выявления. Подчеркивается, что обнаружение экспрессии некоторых белков не может служить однозначным свидетельством дифференцировки стволовых клеток именно в нейроны. Наиболее нейронспе-цифичными являются такие маркеры, как NeuN, белки ней-рофиламентов и синаптофизин.

Изучение дифференцировки стволовых клеток как in vitro, так и in vivo позволяет обосновать целесообразность использования и подтвердить клиническую эффективность новых разработок в области клеточных технологий. В настоящее время для оценки дифференцировки стволовых и прогениторных клеток (в том числе и нейральных) используют различные подходы, но основным из них является иммуноцитохимическое выявление маркерных белков, синтезируемых клетками, находящимися на различных стадиях дифференцировки. Число используемых маркерных белков постоянно увеличивается, причем для некоторых из них остается не вполне понятной их функциональная роль в клетке. Степень надежности новых маркеров нередко составляет предмет для научных дискуссий.

Обилие дифференцировочных маркеров, отсутствие устоявшихся представлений об их функциональной роли и противоречия в результатах, получаемых при использовании различных антител, создают определенные трудности для специалистов, разрабатывающих новые клеточные технологии, в выборе оптимального набора информативных методов для оценки дифференцировки стволовых клеток.

Цель настоящего обзора состоит в характеристике наиболее часто применяемых маркеров нейральной дифференцировки, используемых при исследовании гистобластических потенций нейральных стволовых/ прогениторных клеток (НСПК) и других стволовых клеток, антитела к которым производятся ведущими биотехнологическими компаниями, а также в оценке их преимуществ и недостатков.

Известно, что дифференцированные нейроны способны синтезировать много различных специфических белков, выявление которых может служить свидетельством о нейральной дифференцировке потомков НСПК. Однако большинство из этих маркеров присутствуют лишь в отдельных группах нервных клеток. Сравнительно немногие из них обнаруживаются в большинстве нейронов различной локализации. Длительный период изучения особенностей экспрессии различных маркеров нейральной дифференцировки позволил выделить группу наиболее важных из них, которые чаще других используются в научных исследованиях, посвященных индукции нейральной дифференцировки у потомков стволовых клеток. В эту группу входят: ядерный белок нервных клеток NeuN, р-тубулин III, ассоциированный с микротрубочками белок МАР2, белки нейрофила-ментов, нейрон-специфическая енолаза, синаптофи-зин и связанная с полисиаловой кислотой молекула адгезии нервных клеток (PSA-NCAM).

Ядерный белок нервных клеток NeuN

Белок NeuN локализуется в ядрах и перинуклеар-ной цитоплазме большинства нейронов ЦНС млекопитающих. Существование этого нейрального маркера было установлено в 1992 г., когда группе исследователей удалось получить моноклональные антитела (клон А60) к неизвестному ранее ядерному белку[1]. Этот маркер позволяет выявлять нейроны, но не обнаруживается в глиальных клетках. В других тканях, помимо нервной, его наличие не было установлено. Имеются данные об экспрессии NeuN в части клеток дифференцированных опухолей нейрального происхождения (нейроцитомы, ганглиоцитомы, медуллобластомы)[2, 3], что подтверждает его нейроспецифичность. Вследствие этого белок NeuN в течение последнего десятилетия широко используется как универсальный нейрон-специфический маркер при изучении дифференцировки НСПК и других стволовых клеток[4, 5].

NeuN считается растворимым белком и имеет молекулярную массу 46^48 кДа. Он обладает способностью связываться с ДНК in vitro[1]. Нуклеотидная последовательность, кодирующая этот белок, была неизвестна до недавнего времени. В 2009 г. было показано, что белок NeuN является продуктом гена Fox-3, относящегося к семейству генов Fox-1, выполняющих функцию регуляторов сплайсинга[6]. Однако имеющиеся сведения о белке NeuN не позволяют вполне судить о его функциях в нервной клетке.

Синтез белка NeuN начинается в постмитотичес-ких нейробластах на достаточно поздних стадиях дифференцировки[7]. Следует отметить, что этот белок обнаруживается не во всех нейронах. Известен ряд типов нервных клеток в центральной и периферической нервной системе, где NeuN не выявляется. Так, к нейронам, в норме не синтезирующим этот белок, относят клетки Кахаля — Ретциуса (неокортекс), ряд клеток мозжечка (клетки Пуркинье, корзинчатые и звездчатые клетки, клетки Гольджи, униполярные щетинко-вые нейроны и клетки Лугаро, нейроны зубчатого ядра)[1, 8]; нейроны нижних олив; митральные клетки обонятельных луковиц[1]; клетки внутреннего ядерного слоя сетчатки[1, 3]; гамма-мотонейроны в спинном мозге[9, 10] и клетки ганглиев симпатического ствола[3]. Имеются противоречивые данные об особенностях эксрессии NeuN в клетках черного вещества[11, 12]. Выявленные исключения позволяют уточнить типы и локализацию нейронов, для которых NeuN является адекватным дифференцировочным маркером.

В ряде исследований сообщается о различных патологических состояниях, при которых можно наблюдать нарушение выявляемое™ NeuN в клетках, а именно ослабление или исчезновение реакции на антитела к нему. Среди таких случаев отмечают ишемическое повреждение нейронов стриатума[13], болезнь Ген-тингтона, при которой наблюдают прекращение синтеза NeuN нейронами отдельных участков стриатума[14]. Кроме того, наблюдается исчезновение имму-ногистохимической реакции на антитела к NeuN при эксайтотоксическом повреждении нейронов, когда имеет место селективное поражение пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа при избыточной стимуляции NMDA-рецепторов[15].

Учитывая приведенные данные о нейронах, не экспрессирующих NeuN, можно заключить, что отсутствие этого маркера в дифференцирующихся in vitro клетках не обязательно свидетельствует о том, что они не являются нейронами. В то же время, присутствие NeuN является надежным показателем нейрональной дифференцировки.

Тубулин является главным структурным белком микротрубочек цитоскелета. Он представляет собой гетеродимер, состоящий из — и р субъединиц[16]. Как для —-, так и для р-тубулина характерно наличие нескольких изотипов, которые принято обозначать римтипов[17]. Предполагается, что различные изотипы тубулина обладают разными свойствами, поскольку они обнаруживаются в клетках различного происхождения бочек нервных клеток (нейротрубочек), поэтому его иногда называют нейротубулином[18].

реимущевозможность для использования его в качестве нейразличные моноклональные и поликлональные антитела, но наибольшее распространение получили антитела клонов TuJ-1[19] и TU-20[20], которые выявляют эпитопы антигена, устойчивые при формалиновой фиксации и даже при заливке объектов в парафин.

Прованных и дифференцирующихся нейронов, поскольку установлено, что по мере созревания и старения организма в нервных клетках экспрессия этого белка снижается[21]. Предполагается, что он является самым ранним из известных маркеров, позволяющих выявить клетки, вставшие на путь нейрональной дифференцировки[19]. Наиболее высокая концентрация в конце эмбриогенеза[21].

Несмотря на широкое использование бета-Т-Ш в качестве нейронального маркера при изучении развития нервной системы[22] и в исследованиях дифференцировки стволовых клеток[23], следует заметить, что специфичность этого маркера в настоящее время подется в клетках опухолей глиального происхождения (олигодендроглиомах и астроцитомах)[24, 25], и ряда экстракраниальных опухолей (молочной и поджелудочной желез[26]), а также в дендритных клетках лимфатических узлов[27], фибробластахи кератиноцитах[26]. мозге человека экспрессируется в астроцитах, наряду с астроцитарным маркером GFAP[28]. В связи с этим единственного нейронального маркера при оценке дифференцировки НСПК и других стволовых клеток in vitro не является доказательным.

МАР2

Белки, ассоциированные с микротрубочками (microtubule-associated proteins, MAPs), — это семейство структурных фибриллярных белков, которые обратимо связываются с микротрубочками, способствуя полимеризации тубулина, придают им устойчивость против деполимеризующих воздействий, а также необходимы для образования пучков микротрубочек. Данное семейство включает большое количество различных белков, из которых для изучения нервной системы наиболее часто используют белки МАР2 и tau[29,30].

МАР2 — стабильный фосфопротеин, устойчивый к нагреванию[31]. Он локализуется в перикарионе нейрона (ассоциированный с полирибосомами), дендритах[32] и в начальном сегменте аксона нервной клетки[33]. МАР2 обеспечивает морфологическую стабильность, рост, ветвление дендритов, а также необходим для их посттравматического восстановления[34]. Имеются данные о том, что МАР2 участвует в связывании микротрубочек друг с другом[35], с актиновыми филаментами[36], нейрофиламентами[37].

МАР2 имеет 4 изоформы, кодируемые одним единственным геном и образующиеся путем альтернативного сплайсинга[38]: 2 высокомолекулярные (280 кДа) — МАР2а, МАР2Ь и 2 низкомолекулярные (70 кДа) — МАР2с, MAP2d[39]. Различные изоформы МАР2 могут служить показателем зрелости нейрона. Например, в процессе нейрональной дифференцировки в ранний постнатальный период происходит смена эмбрионального (или ювенильного) МАР2с на МАР2а. MAP2d экспрессируется в зрелых нейронах, в то время как МАР2Ь экспрессируется на протяжении всего нейрогенеза и в зрелых нейронах[29, 38]. По мере старения организма экспрессия МАР2 снижается[34, 40]. Для выявления МАР2 большинство исследователей используют моноклональные антитела.

В настоящее время МАР2 широко используют как специфический нейрональный маркер при изучении развития нервной системы[41], в исследованиях, связанных с трансплантацией[42] и дифференцировкой стволовых клеток[43]. Однако специфичность этого маркера может быть подвергнута сомнению, поскольку имеются данные об экспрессии МАР2с в глиальных клетках — астроцитах[44] и олигодендроцитах[30, 45], а также в некоторых клетках других тканей[46, 47].

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости тщательного подбора антител к этому маркеру для исключения возможности перекрестной реакции с нежелательными изоформами МАР2.

Белки нейрофипаментов

Нейрофиламенты — нитевидные образования (толщиной 8^10 нм) в цитоплазме нейрона. Они относятся к промежуточным филаментам, которые занимают по толщине промежуточное положение между другими филаментами цитоскелета. Считается, что нейрофиламенты содержатся исключительно в нейронах. Их функция — поддержание формы клетки и обеспечение медленного аксонального транспорта. Нейрофиламенты состоят из трех белков, которые имеют N-концевой головной домен, С-концевой хвостовой домен и центральный стержневой домен. Белки, принимающие участие в формировании нейрофиламентов различаются по молекуляной массе. Это — низкомолекулярные белки нейрофиламентов (NF-L) с молеклярной массой 68^73 кДа, средние — (NF-M) — 140-160 кДа и высокомолекулярные (NF-H) — 195-200кДа[48, 49]. Соотношение данных белков является важным условием для реализации функции нейрофиламентов. Сборка белков в общую структуру осуществляется в перикарионе, после чего нейрофиламенты транспортируются в аксон и фосфорилируются. Уровень фосфорилирования белков нейрофиламентов отражает региональную специализацию цитоскелета в нейронах. В эмбриогенезе вначале начинают синтезироваться NF-L и NF-M, позже появляется NF-H[49].

Использование иммуногистохимических методов выявления белков нейрофиламентов позволяет изучать динамику дифференцировки нервных клеток в процессе онтогенеза. Для выявления фосфорилиро-ванных нейрофиламентов применяются особые антитела[50].

В исследованиях, посвященных нейротрансплантации эмбриональных закладок мозга, для изучения дифференцировки нейронов трансплантатов применяют антитела к NF-L[51]. Установлено, что в процессе дифференцировки нейронов в трансплантатах и интак-тном неокортексе происходит перераспределение этого белка в дифференцирующихся клетках. Сначала NF-L распределяется в околоядерной цитоплазме, затем в коротких отростках крупного диаметра, затем в длинных отростках меньшего и большего диаметра. Выявлена повышенная экспрессия белка NF-L клетками трансплантатов по сравнению с клетками интактного мозга. В настоящее время наряду с другими нейрональными маркерами моноклональные антитела к NF-L используются при исследованиях возможностей мезенхимальных стволовых клеток дифференцироваться в нейрональном направлении после стимуляции трофическими и ростовыми факторами в культуре[52] и при попытках трансплантировать их в поврежденный головной и спинной мозг крыс[53, 54].

Иммуногистохимическое выявление белков нейрофиламентов широко применяется для исследований и периферической нервной системы. Учитывая, что в норме во взрослом организме нейрофиламенты располагаются главным образом в аксонах нервных клеток, их выявление с помощью антител применяется при исследованиях иннервации различных органов[55] и нарушении иннервации при различных патологических процессах[56]. Показано, что высокомолекуляный компонент нейрофиламентов NF-H служит маркером нейронов, образующих А-волокна (популяции проприо-цептивных больших и тактильных средних нейронов). Использование моноклональных антител к NF-H позволило изучить регенерацию аксонов седалищного нерва крысы после повреждения и введения стимулятора регенерации нерва ксимедона[57].

В клетках опухолей нейрогенного происхождения иммуногистохимически, наряду с другими маркерами, выявляют и белки нейрофиламентов. Нейрофиламенты выявлены в клетках нейроэпителиом[58], ганглио-нейробластом, нейробластом и ганглионейром[59, 60]. В некоторых опухолях периферических нервов (в нейрофибромах, но не шванномах) экспрессируются белки нейрофиламетов[61].

Все изложенное выше демонстрирует высокую специфичность белков нейрофиламентов как нейрональных маркеров. Однако, при проведении исследований с их использованием, следует принять во внимание, что эти белки обнаруживаются помимо нейронов и в таких высокодифференцированных клетках, как клетки Сертоли и Лейдига[62].

Нейрон-специфическая енопаза

Нейрон-специфическая енолаза (НСЕ, NSE) принадлежит группе енолаз (2-фосфо-0-глицерат гидролаза (Е.С.4.2.1.11) молекулярный вес около 80 кДа), участвующих в предпоследнем этапе гликолиза. Енолаза катализирует переход 2-фосфо-0-глицериновой кислоты в фосфоенолпируват.

В геноме человека семейство енолаз представлено тремя локусами генов: EN01 — ненейрональная енолаза (a), EN02 — нейрон специфическая енолаза (у), и EN03 ^мышечная енолаза (р)[63]. Данные ферменты могут образовывать гомо- и гетеродимеры. NSE обычно присутствует в клетке в виде как гомо- (у—у), так и гетеродимера (a—у)[64].

NSE обнаруживается в клетках нейроэктодермального происхождения — нейронах центральной и периферической нервной системы[65, 66]. Это водорастворимый белок, составляющий 1—2% от общего количества всех растворимых белков в головном мозге[67]. При иммуногистохимическом выявлении NSE в головном мозге, положительную реакцию обнаруживают в перикарионах нейронов, аксонах и дендритах, но не обнаруживают в пресинаптических терминалях[66, 68]. NSE-иммунонегативными оказываются и клетки Пуркинье[69].

Считается, что накопление NSE в нейронах происходит при окончательной дифференцировке клеток[67], однако некоторые авторы полагают, что NSE — маркер нейральных стволовых клеток[70]. Зачастую NSE используют как один из маркеров для выявления нервных клеток при дифференцировке стволовых клеток in vitro[71 ] и при поддержании первичной культуры нервных клеток[72].

Иммуноцитохимическая реакция на NSE является хорошим индикатором активных нейронов в различных областях головного мозга, поскольку усиление метаболической активности клеток сопровождается увеличением количества NSE в них[73]. Реакция на NSE широко используется в морфологической диагностике опухолей нейрального происхождения[74, 75].

Несмотря на общепринятое мнение о специфичности NSE как нейронального маркера, имеются сообщения о присутствии этого фермента в глиальных клетках. Так обнаружено, что NSE экпрессируется при дифференцировке олигодендроцитов in vitro и in vivo. Максимальное количество изоформ a—у у—у энола-зы и соответствующей мРНК определяется в зрелых глиальных клетках[76, 77]. Положительную иммуно-цитохимическую реакцию на NSE могут давать и астро-циты[66, 69, 77, 78].

Таким образом, NSE не обладает необходимой специфичностью для применения в качестве доказательного маркера дифференцирующихся in vitro нейронов, поскольку не позволяет отличить их от астроцитов и олигодендроцитов.

Синаптофизин

Синаптофизин является главным интегральным белком мембран синаптических пузырьков нейронов нервной системы и органов чувств. Вместе с синапси-нами, синаптином, синаптотагмином и др. он входит в группу белков, которые участвуют в регуляции и осуществлении синаптической передачи.

Синаптофизин был открыт и впервые охарактеризован 1985 году[79, 80]. В настоящее время хорошо изучена его структура. Это гликопротеин с молекулярной массой 38 кД. Функция синаптофизина — обеспечение контакта синаптического пузырька с цитоплазматической мембраной и участие в процессе экзо- и эндоцитоза медиатора при синаптической передаче. Будучи белком мембраны синаптических везикул, он используется как специфический маркер синапсов.

В настоящее время синаптофизин входит в панель маркеров, применяемых для оценки нейральной дифференцировки стволовых клеток[81]. Иммуногисто-химическое выявление синаптофизина с помощью специфических моно- и поликлональных антител используется для оценки синаптогенеза, который является одним из процессов, характеризующих диффе-ренцировку нервных клеток в онтогенезе[82^84] и при культивировании in vitro[85]. С помощью имму-ногистохимической реакции на синаптофизин оценивают синаптическую плотность в нервной системе в различных модельных нейробиологических экспериментах[86—88]. Установлено, что синаптическая плотность в мозге изменяется при старении[89] и болезни Дауна[90]. С помощью выявления синаптофизин-положи-тельных нервных терминалей изучается иннервация внутренних органов млекопитающих[55].

Показано, что синаптофизин содержится в цитоплазме клеток опухолей нейрального происхождения[75, 91, 92], что подтверждает нейроспецифичность данного маркера.

Следует отметить, что синаптофизин экспрессируется не только в нервной ткани. В отличие от другого белка синаптических везикул — синапсина 1 — синаптофизин содержится в нейроэндокринных клетках. F. Navone et al.[93] показали высокую иммунореактивность к синаптофизину в хромаффинных клетках надпочечника, эндокринных клетках желудка, островках Лангерганса поджелудочной железы, в С-клет-ках щитовидной железы. Авторы подчеркивают, что эти клеточные элементы имеют сходное происхождение и развиваются в эмбриогенезе из нервного гребня. Имеются данные об успешном использовании антител к синаптофизину в морфологической диагностике опухолей нейроэндокринного происхождения[94—96].

Таким образом, синаптофизин может быть использован как специфический маркер нейронов и нейроэндокринных клеток. Некоторое сомнение в его надежности вносят данные о присутствии синаптофизина в клетках Купфера[97], которые, по современным представлениям, не относятся к нейроэндокринным клеткам. Тем не менее, этот факт не может влиять на трактовку результатов исследований, проводимых с использованием стволовых клеток in vivo.

PSA-NCAM

Молекулы клеточной адгезии (САМ) это мембранные белки, участвующие в связывании клетки с внеклеточным матриксом или другими клетками. Большинство молекул клеточной адгезии составляет 5 семейств: интегрины, селектины, кадгерины, молекулы клеточной адгезии, сходные по структуре с иммуноглобулинами, и молекулы клеточной адгезии, участвующие в процессе миграции лейкоцитов.

Нейрональная САМ (NCAM) — наиболее известный представитель суперсемейства иммуноглобулинов. Это трансмембранный гликопротеин, имеющий внеклеточную часть полипептидной последовательности в виде пяти доменов, сходных с доменами иммуноглобулинов.

Полисиаловая кислота (PSA) это линейный гомополимер, состоящий более чем из 200 остатков сиаловой кислоты, особым образом прикрепленный к пятому домену NCAM и служащий лигандом в формировании межклеточных связей[98]. PSA-NCAM является особой формой NCAM, которая располагается на клеточной поверхности и имеет молекулярную массу около 220 кДа[99].

В нервной ткани PSA-NCAM экспрессируется главным образом нейронами, где она локализуется на поверхности тел нейронов, дендритов и безмиелиновых аксонов[100]. На миелиновых аксонах PSA-NCAM не экспрессируется, однако, при рассеянном склерозе, когда происходит демиелинизация аксонов, наблюдается реэкспрессия PSA-NCAM[101].

Высокий уровень PSA-NCAM, называемой также эмбриональной NCAM (E-NCAM), обнаруживается повсюду в развивающемся мозге и значительно уменьшается в постнатальный период, замещаясь на изоформы, содержащие меньшее количество сиаловой кислоты — NCAM-180, -140 и -120 кДа[99]. Исключением являются области, для которых характерен нейрогенез во взрослом состоянии: обонятельная луковица[102], зубчатая извилина гиппокампа[103], субвентрикулярная зона[104].

На сегодняшний день PSA-NCAM признан важным регулятором межклеточных взаимодействий благодаря его значительной роли в многочисленных процессах, происходящих не только в развивающемся мозге, но и в зрелом. Эта молекула контролирует нейруляцию, участвует в процессе клеточной миграции[105], синапто-генезе и синаптической пластичности[106], регулирует рост и регенерацию аксонов[105, 107]. Более того, в экспериментах показано, что дефицит PSA-NCAM вызывает нарушения обучаемости и памяти[108]. PSA-NCAM часто применяется как нейрональный маркер в исследованиях дифференцировки НСПК и других стволовых клеток[109, 110], однако специфичность этого маркера для формирующихся нервных клеток не является абсолютной. Так показано, что PSA-NCAM может экспрессироваться астроцитами[111, 112].

PSA-NCAM экспрессируется в некоторых опухолях, таких как феохромоцитома, карцинома щитовидной железы, нейробластома, мелкоклеточный рак легких, аденома гипофиза[113]. Эти данные свидетельствуют против высокой нейроспецифичности PSA-NCAM.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что, несмотря на широкое использование ряда белков как специфических нейромаркеров, часть из них таковыми могут считаться лишь до известной степени. Обнаружение их экспрессии не может служить однозначным свидетельством дифференцировки НСПК именно в нейроны. Наряду с этим, такие маркеры как NeuN, белки нейрофиламентов, синаптофизин обладают более высокой нейронспецифичностью. Именно эти маркеры желательно использовать для доказательства нейральной дифференцировки стволовых клеток.

Подняться вверх сайта