Поиск Кабинет

Направленный рост и миграция стромальных клеток костного мозга в культуре in vitro

Гены & Клетки: Том I, №4, 2006 год, стр.: 52-55

 

Авторы

Деев Р.В., Цупкина Н.В., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На модели in vitro подтверждена способность культуры стромальных клеток костного мозга кролика реагировать направлением миграции и роста колонии в ответ на хемотаксический стимул. В качестве источника хемотаксического стимула использованы аутогенные по отношению к культуре клеток фрагменты жизнеспособной и девитализированной пластинчатой костной ткани. Установлено. что в условиях клеточной культуры стромальные клетки в большей степени отвечают на сигналы жизнеспособной кости, что. вероятно, обусловлено продукцией биологически активных веществ клетками костного фрагмента. Невыраженная реакция культуры на присутствие девитализированной костной ткани, вероятно, обусловлена изменением свойств костной ткани после потери жизнеспособности. в частности, изменениями белков внеклеточного матрикса.

Обсуждено возможное воздействие на миграцию клеток культуры клеток различных факторов.

Введение

В последнее время все большее внимание исследова телей привлекают возможности клеточной трансплантации для коррекции патологии скелетных тканей. Показано, что клетки с облигатной или факультативной остеогенной детер минацией (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), стромальные клетки костного мозга, остео генные клетки, остеобласты) при их трансплантации в орга низм реципиента участвуют в процессах остеогенеза. Такие сведения получены при свободных пересадках указанных клеток в область переломов и дефектов костей [1, 2]. При системном введении ядросодержащих клеток костного моз га, включающих фракцию стромальных клеток, они также демонстрируют тропность к костной ткани реципиента и про дуктивно участвуют как в репаративном (восстановительном) [3], так и в физиологическом [4, 5] костеобразовании. На использовании данного феномена основаны клинически приемлемые способы коррекции системных заболеваний костной ткани [6, 7].

Несмотря на большое количество полученных экспери ментальных и клинических данных, механизмы данного яв ления остаются недостаточно изученными.

Цель работы: в модельной системе in vitro зарегистриро вать признаки миграции или направленного роста стромаль ных клеток костного мозга в ответ на остеогенный стимул.

Материал и методы

Культуру стромальных клеток кролика получали из кост ного мозга, заключенного в гребнях подвздошных костей. Клетки высеивали в одноразовую пластиковую посуду (чаш ки Петри) из расчета 5 7x105 клеток на 1 сма площади дна. Среда имела следующий состав: DMEM (ISN, США) и F12 (ISN, США) в соотношении по объему 3:1 с добавлением 20% эмбриональной коровьей сыворотки (Биолот, РФ; ISN, США), гентамицина сульфата (50 мкг/мл). Смену среды произ водили каждые 3 суток. По достижении монослоя, культуру пассировали в одноразовой посуде, на дне которой были уло жены круглые покровные стекла диаметром 1,0 см. После того, как поверхность стекол полностью покрывалась клетками, их извлекали и монтировали в новых чашках Петри точно в центре. Культуральная среда имела прежний со став. В зависимости от опыта культивирование проводили в присутствии аутогенных по отношению к клеткам жизне способных и девитализированных костных фрагментов. Девитализацию проводили путем трехкратного быстрого замораживания оттаивания. Контроль девитализации осу ществляли при помощи помещения кусочков в питательную среду и с использованием сканирующей электронной мик роскопии (СЭМ). Ни в одном случае не было обнаружено роста in vitro и целых жизнеспособных клеток. Также СЭМ подвергали жизнеспособные кусочки костей после культи вирования.

В дальнейшем опыты повторили после нанесения на дно чашек коллагенового геля, получаемого из соединительной ткани сухожилий лабораторных животных. В качестве конт роля использовали изолированную культуру стромальных клеток на покровных стеклах.

Через 1 неделю культивирования культуру фиксирова ли 4% раствором параформальдегида, окрашивали по Ро мановскому Гимза (азур ll-эозином). Состояние культуры оценивали визуально.

Подготовку препаратов костных фрагментов для ска нирующей электронной микроскопии выполняли по тра диционной методике [8]. Фиксировали 2% глютаровым альдегидом. После обезвоживания образцы покрывали медью в аппарате низкотемпературного напыления JFC1100. Изучение проводили в сканирующем электронном микроско пе JEOL JSM - 35С при ускоряющим напряжении 15 kV.

Результаты

В контроле клетки, находившиеся на покровных стеклах в центре чашек Петри, за срок наблюдения равномерно проли ферировали и мигрировали на дно чашки по всему периметру (рис. 1). Причем, на чашках, у которых дно было обработано раствором коллагена, этот процесс был более выражен. Иногда наблюдались свободные отсевы в виде дискретных единичных колоний.

При культивировании стромальных клеток с фрагментами девитализированной кости достоверных данных в пользу вли яния на рост колонии клеток не получено. Характер роста куль туры был аналогичен контролю. Культура росла центробежно от покровного стекла, лишь незначительно распространяясь по дну культурального сосуда (см. рис. 1 А). Этот процесс был несколько более выражен в чашках, покрытых коллагено вым гелем.

При кокультивировании с фрагментами аутогенных жизнеспособных кусочков костной ткани получены иные данные. На чашках, не обработанных коллагеном, наблю дали миграцию клеток с покровных стекол на дно, преиму щественно в сторону локализации кусочка кости (см. рис. 1 В), Причем, в ряде случаев клетки формировали колонии, вытя нутые в сторону живой кости. В чашках, покрытых коллагеном, культура характеризовалась более выраженным ростом, большей площадью экспансии дна, причем, несмотря на то, что из за многочисленных дискретных колоний, являющих ся отсевами основной колонии и отсевами от сохранивших жизнеспособность клеток эксплантированного кусочка кос ти, преимущественное направление роста было сохранено -в сторону живой кости.

При культивировании в одной чашке и девитализиро ванного, и живого фрагмента кости клетки мигрировали преимущественно в сторону жизнеспособного кусочка (см. рис. 1 В, А).

Обсуждение

Полученные в простом модельном эксперименте дан ные дают наглядное представление о том, каким образом процессы миграции могут осуществляться in vivo. В организ ме подобные ситуации могут возникать в случаях физио логической регенерации костной ткани, когда клетки кам биального резерва естественным образом расходуются на ремоделирование кости и поддержание ее морфофункцио нального гомеостаза. При репаративной регенерации для процессов остеогенеза рекрутируются костномозговые ос теогенные клетки предшественники, входящие составной частью в строму костного мозга. Показано, что помимо ме стной миграции под воздействием паракринных факторов хемоаттракции, указанные клетки способны мигрировать посредством системного кровотока [9]. Искусственно такая ситуация воспроизводится при трансфузиях. Молекуляр ные механизмы хоуминга данных клеток требуют особого обсуждения.

В сохранивших свою жизнеспособность клетках фрагмен тов костной ткани - остеобластах, клетках периваскулярного микроокружения, заключенных в гаверсовых каналах идут активные цитофизиологические процессы. Ранее нами было показано, что эти клетки способны пролиферировать на по верхности эксплантированного костного фрагмента, миг рировать на подложку (рис. 2); синтезировать щелочную фосфатазу, свидетельствующую в данном случае об остео генной дифференцировке клеток (10]. Следует предположить, что помимо синтеза щелочной фосфатазы, клетки в данных условиях вырабатывают и ряд других биологически актив ных молекул.

Большое внимание исследователей в последнее время приковано к Stromal derived factor 1 (SDF 1). Оказалось, служащий аттрактантом для клеток различных типов, он спо собен воздействовать и на стромальные клетки в качестве ауто или паракринного регулятора. Возможно данный фактор является стадиеспецифичным, при нарастании ос теогенной дифференцировки клеток их способность проду цировать SDF 1 снижается (11 ], вместе с тем показано, что дифференцированные остеобласты также продуцируют SDF 1 [12]. В экспериментах in vitro с остеобластами чело века, стромальными клетками костного мозга человека, мыши и крысы установлено, что ряд цитокинов индуцируют выработку SDF 1, к ним относятся IL 1р, PDGFBB, VEGF, TNF а и паратиреоидный гормон; TGF р1 — уменьшает его выработку [13], что подтверждено идентификацией раство ренного SDF 1 в культуральной среде.

Взаимодействие SDF 1 с его рецептором CXCR4 при водит к перестройкам цитоскелета клеток, благодаря ко торым становится возможной их миграция под действием хемотаксиса в локусы ремоделирования кости [13, 14]. Именно этому взаимодействию сегодня придают ведущее значение в хемоаттракции стромальных клеток.

Одним из ключевых факторов регуляции механоцитов являются костные морфогенетические белки (bone morphogenetic protein, BMP). Они вызывают дифференци ровку ММСК в клетки остеогенной линии. Сохраненный при особых условиях костный матрикс содержит факторы рос та, в частности, BMP, который является хемоаттрактантом для остеогенных клеток предшественников, что показано в условиях in vitro путем микрокиносъемки в ответ на внесе ние в культуральную систему рекомбинантного BMP 7 [15]. Аналогичный эффект вызывают BMP 2, BMP 4 в концен трации 10 нг/мл [16, 17], при этом отмечено, что rhTGF р1 и rhbFGF не обладают таким свойством. Эти данные оста ются весьма противоречивыми, так, Makhijani N.S. с соавт. (2005) показали дозозависмый положительный хемотаксис остеогенных клеток в ответ на внесение в культуральную среду трех изоформ трансформирующего фактора роста: на TGF р1 или рЗ - в чистом виде, а в ответ на TGF р2 -только в присутствии ретиноевой кислоты [18].

Фактор роста фибробластов был использован для био логически активной модификации скаффолда, позволяю щей привлекать ММСК и оптимизировать их адгезию [19]; аналогичное применение находит и костный сиалопротеин [20].

Еще одним фактором, стимулирующим миграцию стро мальных клеток является тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor, PDGF) (21 23]. Данный ме ханизм, по мнению исследователей, может быть реализован при рекрутировании костномозговых предшественников остеобластов для ремоделирования костной ткани. Анало гичный эффект показан для сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), чья экспрессия весьма выражена при протекании энхондрально го остеогистогенеза. С наличием этого фактора связывают привлечение и дифференцировку предшественников осте областов из стромы костного мозга (24].

В ходе наших экспериментов установлено, что культура стромальных клеток костного мозга кролика обладает свой ством реагировать особенностями роста и миграции на присутствие в культуральной системе жизнеспособной, но поврежденной костной ткани. В случае кокультивирования с девитализированной костной тканью, в которой помимо устранения жизнеспособных клеток продуцентов биоло гически активных веществ, низкотемпературная обработ ка могла повлиять и на функциональную активность бел ков внеклеточного матрикса, культура стромальных клеток не демонстрировала изменение характера своего роста.

В присутствии жизнеспособной костной ткани клетки культуры активно мигрировали в сторону ее расположения. В случае, если дно чашки было покрыто коллагеном, клетки преимущественно не мигрировали на его поверхность, а активно пролиферировали, и колония, распространяясь центростремительно, занимала все большую площадь дна культурального сосуда. Коллаген, являясь основным белком внеклеточного матрикса соединительных тканей, представ ляет собой естественный субстрат для адгезии и пролифе рации стромальных клеток, что используется для обработки поверхностей гидрофобных носителей для клеток (скаффол дов) (25, 26].

Подняться вверх сайта