Поиск Кабинет

Направленная регенерация костной ткани с использованием барьерной мембраны на основе альгината натрия и октакальциевого фосфата

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 70-77

 

Авторы

Гурин А.Н., Федотов А.Ю., Деев Р.В., Комлев В.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Барьерные мембраны необходимы для изоляции костного дефекта от прорастания фиброзной ткани. Значительные перспективы представляют мембраны на основе альгината натрия. В настоящем исследовании биорезорбируемая мембрана на основе альгината натрия сшивалась 10% раствором хлорида кальция/магния (30/70), имела пористость 80% и прочность на растяжение до 2 МПа. В качестве биоматериала использовали гранулы октакальциевого фосфата (ОКФ) размером 0,5–1,0 мм, с развитой поверхностной пористостью. Исследование проведено на 40 крысах линии Вистар. Модель повреждения – критический дефект теменной кости (10 мм). Сроки наблюдения – 1 и 3 мес. Животные были разделены на 4 группы: 1) костный дефект заживал под кровяным свертком; 2) костный дефект заполняли гранулами октакальциевого фосфата; 3) костный дефект заполняли гранулами октакальциевого фосфата и изолировали от мягких тканей альгинатной мембраной; 4) костный дефект изолировали альгинатной мембраной.

В контрольной группе эксперимента процессов восстановления кости не наблюдали. Во второй группе гранулы ОКФ были хаотично распределены в «мягких тканях», резорбция гранул была выражена слабо. В третьей группе альгинатная мембрана хорошо изолировала костный дефект, процессы остеорепарациии и резорбции гранул были выражены. В четвертой группе альгинатная мембрана постепенно подвергалась резорбции с появлением минерализованных участков, по-видимому, из-за осаждения солей кальция, который был использован для сшивки мембраны. Таким образом, показано, что альгинатная мембрана соответствует всем требованиям для барьерных мембран: будучи нейтральной к окружающим тканям, не вызывает побочных явлений, сохраняет свою структуру в течение длительного периода. Гранулы ОКФ под мембраной постепенно резорбируются с формированием минерализованной костной ткани.

Технологии направленной регенерации тканей с успехом используются в пародонтологии, имплантологии и челюстно-лицевой хирургии. В качестве барьеров для предотвращения прорастания в зону дефекта соединительной ткани широко применяются мембраны, чем создается ложе для формирования костной ткани. Достаточно давно сформулированы основные принципы применения биологических барьерных мембран[1, 2]: биосовместимость, интеграция с костной тканью, препятствие прорастанию соединительной ткани или эпителия, ограничение проникновения бактерий, формирование пространства для органотипических тканей при заполнении дефекта. При этом, мембраны не должны оказывать негативного воздействия на процессы гистотипической регенерации, а в идеальном варианте – оптимизировать их.

В качестве барьерных мембран применяют различные материалы, в том числе коллаген[3, 4], политетрафторэтилен (ПТФЭ) (Cytoplast, США)[5, 6], внеклеточный матрикс дермы (Alloderm, США)[7], декальцинированная компактная костная ткань (Genderm, Испания)[8, 9], полигидроксибутират[10], полиуретан[11], гиалуроновые кислоты (Hyalonect, США)[12], обогащенная тромбоцитами плазма[13], мембраны из полилактид-ко-ε-капролактона (PLCL)[14] и другие вещества в различных комбинациях[15].

Барьерные мембраны подразделяются на нерезорбируемые и биорезорбируемые. К нерезорбируемым мембранам относится ПТФЭ. Материалы на основе ПТФЭ характеризуются высокой устойчивостью в биологических системах, т.е. к разрушающему действию тканей организма-хозяина, микроорганизмов, и не вызывают иммунных реакций. Очевидный недостаток ПТФЭ-мембран – при обнажении мембраны (расхождении швов) происходит быстрый лизис подлежащей костной ткани[16]. Кроме того, ПТФЭ-мембраны оказывают подавляющее действие на синтез коллагена, гликозамингликанов – основных компонентов внеклеточного матрикса[17]. В настоящее время нерезорбируемые мембраны теряют свое значение и в клинической практике их применение ограничено специфическими показаниями.

Биорезорбируемые мембраны характеризуются быстрой интеграцией в ткани (в зависимости от свойств материала), также быстрой резорбцией в случае их обнажения; при их использовании показано интенсивное восстановление мягких тканей[18, 19]. Большинство резорбируемых мембран, используемых в медицинских целях, производятся на основе коллагена животного происхождения, полисахаридов[20, 21], полигликолида, полилактида и их сополимеров[22]. Мембраны из коллагена, без поперечных сшивок биодеградируют к 5–7 сут. Фрагменты мембран из сшитого коллагена в зоне дефекта могут быть обнаружены и через 2 недели после имплантации[23, 24]. Недостатки этого материала хорошо известны. В медицинской практике при применении коллагеновых мембран существует риск послеоперационного разрыва в результате их низкой прочности и потенциальной опасности инфицирования[25]. Более того применение в качестве «сшивающего агента» токсичных химических соединений, остатки которых остаются после полимеризации, отрицательно влияет на биосовместимость изделия, что приводит к образованию своеобразных ниш между мембраной и соединительной тканью и способствует миграции в них микроорганизмов и поддержанию воспаления[26].

Синтетические мембраны из полилактидов и их сополимеров могут отрицательно влиять на окружающие ткани, вызывая умеренную цитотоксическую реакцию в процессе биорезорбции[27].

Поиск новых материалов для получения мембран, удовлетворяющих современным запросам, продолжается. Одним из перспективных материалов является альгинат. Это безазотистый полисахарид, представляющий собой семейство неразветвленных бинарных сополимеров, состоящих из связанных (1–4) гликозидными связями остатков бетаD-маннуроновой (М) или ее С-5 эпимера L-гулуроновой кислоты (G), образуя длинные цепи[28]. Он биосовместим, не иммуногенен и гидрофилен[29]. В медицине широко используется в виде гидрогелей как матрикс для доставки лекарственных веществ и клеток к тканям[30]. Альгинат нашел широкое применение в фармацевтической, текстильной, пищевой промышленности, косметологии и стоматологии. Особым свойством альгината является то, что он не резорбируется естественным образом под действием ферментов и клетки не склонны к активной адгезии к альгинату[31, 32], по-видимому, за счет высокой гидрофильности и наличия отрицательного заряда цепей[30], что делает альгинат нейтральным по отношению к окружающим тканям. Это свойство было использовано рядом авторов для получения альгинатной мембраны для направленной костной регенерации[33–36]. Мембраны, полученные ex tempore, характеризовались слабой адгезией и прочностью, несмотря на это, под ними наблюдалась регенерация костной ткани. Методика получения таких мембран проста: в костный дефект вводился альгинатный гель и покапельно – CaCl2, в результате происходила полимеризация и дефект заполнялся.

Нами были разработаны пористые альгинатные мембраны с четкой структурной организацией и прочностью. Целью данной работы являлось изучение структурных изменений пористой мембраны из альгината натрия (АМ), оценка ее роли для направленной костной регенерации в костных дефектах черепа критического размера у крыс при совместном применении с керамическими гранулами октакальциевого фосфата (ОКФ).

Материал и методы

Получение альгинатных мембран

В качестве исходных компонентов использовали альгинат натрия (Acros, США), хлорид кальция (CaCl2, Sigma-Aldrich, США), хлорид магния (MgCl2, Sigma-Aldrich, США), карбонат кальция (CaCO3, Sigma-Aldrich, США), дигидрофосфат аммония (NH4H2PO4, Fisher BioReagents, США) и ацетат натрия (CH3COONa×3H2O, Fisher BioReagents, США). Мембрану на основе альгината (АМ) получали с использованием лиофильной сушки (ЛС-1000, Россия). 5 мл 2% водного раствора альгината натрия заливали в пластиковую форму размером 40×60 мм. Данные заготовки подвергали охлаждению при температуре -10°С до полного замораживания. Лиофильную сушку проводили при давлении в рабочей камере 6×10–5 атм. и температуре конденсирующей поверхности 55°С в течение 24 ч. Полученные мембраны сшивали 10% раствором хлорида кальция/ магния (30/70) на основе этилового спирта. Проводили пятикратную промывку материалов в дистиллированной воде. Полученные мембраны сушили под давлением 100 Н на 1 см2 в течение 2 сут. при комнатной температуре.

Получение керамических гранул октакальциевого фосфата

Гранулы ОКФ получали согласно ранее опубликованной технологии[37]. Способ изготовления заключается в химической трансформации керамики на основе карбоната кальция (СаСО3 (кальцит)) в дикальцийфосфат дигидрат (ДКФД), с последующим гидролизом ДКФД в ОКФ. Полученные материалы подвергали стерилизации гамма-облучением при дозе 20 кГр в течение 24 ч[38].

Физико-химические методы исследования материалов

Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов проводили с помощью дифрактометра Ultima 4 фирмы Rigaku (Япония) на монохроматизированом CuKα излучении. Идентификацию фаз выполняли с использованием базы рентгенометрических данных PDF-2. Изображения материалов получали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) фирмы Tescan Vega SBU II (Чехия) при ускоряющем напряжении 10–30 kV.

Механические свойства определяли на испытательной машине Instron Electo Puls E 3000 фирмы Instron (Великобритания) с камерой для проведения испытаний в биологических жидкостях при 37°С. Исследование мембраны на основе альгината натрия и октакальциевого фосфата in vivo При проведении эксперимента соблюдались принципы гуманного обращения с животными в соответствии с требованиями, предусмотренными приказом Минздрава СССР № 12000 от 02.04.80 «Правила проведения работ с экспериментальными животными».

В эксперименте использовали 40 крыс линии Вистар (в возрасте 14 нед. и весом 200–300 г). Всем животным формировался полнослойный дефект теменных костей диаметром 10 мм; дном дефекта служила твердая мозговая оболочка. Животные были разделены на четыре группы: одна контрольная и три экспериментальные. Животным первой группы (контроль) рану послойно ушивали, не внося перед этим в дефект каких-либо материалов. У животных второй группы дефект заполняли стандартной навеской гранул ОКФ. В третьей – гранулы ОКФ укрывались альгинатной мембраной (АМ). В дефект у крыс четвертой группы помещали только АМ. Для наркоза применен Zoletil® 50 (0,4 мл, внутрибрюшинно, Virbac S.A., Франция), для местного обезболивания – ультракаин.

Животных содержали в виварии на стандартном рационе, ежедневно проводили контрольные осмотры. Крыс выводили из эксперимента через один и три месяца путем передозировки Zoletil® 50 (Virbac S.A., Франция). Выпиленный фрагмент крыши черепа, включавший область ранее выполненного дефекта с регенератом фиксировали в 10% формалине на фосфатном буфере при рН = 7,4.

После фиксации образцы промывали в проточной воде несколько часов. Помещали в 20% раствор ЭДТА, декальцинировали в течение 10 сут. с ежедневной сменой раствора. Декальцинированные образцы промывали в проточной воде в течение суток. Проводили по спиртам возрастающей концентрации, заключали в парафин, изготавливали серийные срезы толщиной около 7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты изучали в световом микроскопе, совмещенном с системой полуавтоматического анализа изображений. Исследовали и анализировали тканевый и клеточный состав регенерата, измеряли размеры дефекта. Долю новообразованной костной ткани на срезах подсчитывали отдельно для краевых и центральных участков дефекта, разделив его диаметр на 4 равные части от краев костного дефекта (2 периферические и 2 центральные).

Результаты и обсуждение

Альгинатные мембраны (АМ)

Толщина полученных мембран составляла около 1,5 мм. АМ имели высокую пористость – до 80% и прочность при растяжении – до 2 МПа. На рис. 1 представлена пористая, ячеистая поверхность АМ. На поперечном срезе визуализированы ячейки материала и перегородки между ними.

Керамические гранулы ОКФ

Керамические гранулы ОКФ имеют сферическую форму и размер около 500±100 мкм. Их поверхность характеризуется пористой ячеистой структурой с плоскими игольчатыми кристаллами, которые, располагаясь в разных направлениях, формируют ячеисто-игольчатый рельеф. Рентгенофазовый анализ показал, что данный остеопластический материал является однофазным продуктом с характерным пиком для ОКФ при 4,8° 2Θ (рис. 2).

Результаты исследования in vivo

Все животные удовлетворительно перенесли оперативное вмешательство; значимых осложнений в послеоперационном периоде не было выявлено; послеоперационные раны заживали первичным натяжением. У животных контрольной группы (первая) через один и три месяца дефект был сохранен. Так, при морфометрическом исследовании расстояние между конусами роста костной ткани составляло более 9 и 7 мм, соответственно (табл. 1).

При этом, несмотря на наличие ретикулофиброзной костной ткани в краях костного дефекта, уже следует констатировать формирование замыкательных пластинок с медиальной стороны. С височной стороны регенерат закономерно несколько более выражен. Объем дефекта на первом сроке заполнен волокнистой соединительной тканью с прослойками организующейся гематомы. Хорошо визуализированы кровеносные сосуды ремоделирующейся «грануляционной ткани». На сроке 90 сут. отмечено формирование плотной волокнистой соединительной ткани с высокой степенью упорядоченности коллагеновых волокон, которые направлены параллельно твердой мозговой оболочке (рис. 3). Таким образом, существенного остеогистогенеза у животных данной группы не произошло, а дефект заполнен к концу наблюдения соединительной тканью.

Вторая группа. Через 30 сут. дефект содержал незначительное количество гранул ОКФ непосредственно под кожей и формирующейся соединительнотканной прослойкой. Следует отметить, что они расположены преимущественно вблизи краев костного дефекта, в то время как в центральных зонах дефекта их количество резко снижается вплоть до полного отсутствия. Гранулы ОКФ окружены клетками реактивно изменённой соединительной ткани, в некоторых местах регистрируются непосредственно примыкающие к гранулам гигантские многоядерные клетки инородных тел, однако их количество невелико. Выраженных признаков продолжающегося воспаления нет.

Через три месяца картина мало изменилась. Гранулы ОКФ также хаотично разобщены выраженными коллагеновыми перемычками. Их присутствие сказалось на процессе репаративного остеогенеза: средний диаметр дефекта на этом сроке составлял около 5 мм. Важно подчеркнуть, что и средний диаметр гранул, измеренный по расстоянию самых глубоко вдающихся расщелин, не изменился значимо по сравнению с размерами на сроке 30 сут. Таким образом, следует констатировать, что в данной группе, помимо механического смещения стандартной навески гранул ОКФ по подкожному пространству в костной ране, происходило преимущественное развитие соединительной ткани, которая инкапсулировала даже отдельные гранулы; в таком брадитрофном состоянии в данный регион не мигрировали клетки-предшественницы фагоцитов и не дифференцировались в симпласты, способные резорбировать фосфаты кальция.

Животным третьей группы в костный дефект помещали стандартную навеску гранул ОКФ и укрывали АМ. Состояние регенерата у этих животных через 30 сут. от начала эксперимента существенно отличалось от обнаруженного в предыдущих наблюдениях. Через 30 сут. в гистологическом препарате обнаружены как плотно лежащие в дефекте гранулы, так и укрывающая их альгинатная мембрана. АМ плотно прилегает к краям костного дефекта, между ней и гранулами новообразованных тканей нет, либо незначительная прослойка волокнистой соединительной ткани (рис. 5). Структура АМ на данном сроке крупноячеистая. Перегородки представлены собственно альгинатом, в который начали мигрировать фибробластоподобные клеточные элементы. В оптически пустых ячейках обнаружены признаки бедного белком экссудата, свободные эритроциты с признаками деструкции, очевидно попавшие в данную область во время операции. Также для этой зоны регенерата характерно наличие умеренной лимфоцитарной инфильтрации клетками диаметром 7–10 мкм. При этом АМ на всем протяжении сохраняет свою целостность.

Гранулы ОКФ равномерно распределены в костном дефекте. В основном они окружены формирующейся рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим числом веретеновидных фибробластоподобных клеток. Клеточные элементы равновероятно располагаются как вблизи, так и на удалении от гранул. Несмотря на это, в некоторых участках, преимущественно расположенных в центре дефекта, вокруг гранул детектируется новообразованная костная ткань, которая в ряде полей зрения несет признаки пластинчатого строения. Костная ткань в виде полумесяца охватывает одну или несколько гранул. В некоторых случаях гранула ОКФ может быть полностью замурована в кость. Внутренняя поверхность кости, обращенная к ОКФ своим контуром, повторяет изрезанный рельеф гранулы; между ними нет каких-либо тканевых прослоек, а также визуализированных клеточных элементов (рис. 5).

Через 90 сут. эксперимента АМ была сохранена, полностью перекрывала костный дефект; однако в ней обнаруживали признаки резорбции и расслоения. Следует отметить, что происходило постепенное замещение альгинатных компонентов на плотную волокнистую соединительную ткань. В результате к данному сроку наблюдения АМ представляла собой в значительной степени соединительнотканное ячеистое образование, препятствующее как миграции из области дефекта гранул ОКФ, так и врастанию тканей со стороны прилегающего апоневроза и дермы. В центре дефекта гранулы ОКФ объединены новообразованной вокруг гранул ОКФ костной тканью, в объеме которой превалировала пластинчатая ее разновидность. Важно отметить, что гранула ОКФ при этом оставалась «замурованной» в костном регенерате, предопределяя его ячеистое строение.

В целом, на данном сроке практически весь объем костного дефекта заполнен воссозданной костной тканью. При этом признаков патологических процессов – экссудативного или продуктивного воспаления, ангиоматоза, избыточного развития костной ткани – детектировать не удалось.

Четвертая группа: костный дефект содержал только АМ без ОКФ. Процесс репаративного гистогенеза в данном случае протекал интенсивнее, чем в костной ране черепа без какой либо пластики, но несколько уступал показателям, определенным для третьей группы (см. табл. 1).

Состояние АМ в динамике не отличалось от предыдущей группы (рис. 6).

Доля костной ткани в разных участках регенерата в группах различалась (табл. 2). Так, в наиболее показательной с точки зрения оценки остеоиндуктивных свойств материала центральных частях дефекта объемное количество костной ткани было зафиксировано через 90 сут. только у животных третьей группы (ОКФ+АМ). Краевой регенерат, непосредственно связанный с костными опилами и берущий от него начало, так же был наиболее выражен после сочетанного применения ОКФ и АМ. Использование только гранул ОКФ в данной модельной системе не приводило к значимым различиям в доле новообразованной костной ткани по сравнению с контролем и АМ.

Заключение

Таким образом, показано, что использование гранул ОКФ в предложенной форме (микрогранулы с развитой поверхностью) в модели ортотопической имплантации в область дефекта плоских костей черепа не приводит к выраженному воспалению. В сочетании с модулирующей микроокружение в раневой нише АМ приводит к более выраженному заполнению дефекта органотипической тканью, что позволяет предполагать наличие у материала остеоиндукционных потенций. Нельзя исключить, что, помимо предотвращения врастания соединительной ткани в дефект, АМ способствует более стабильному нахождению гранул в нем. Среди свойств, которые могут в дальнейшем ограничить практическое применение АМ, следует указать относительно медленную резорбцию, что, по-видимому, связано с высокой концентрацией «сшивающего агента» – хлорида кальция.

Подняться вверх сайта