Поиск Кабинет

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани и фибробласты – выбор клеточной составляющей для биологических трансплантатов

Гены & Клетки: Том VII, №4, 2012 год, стр.: 55-61

 

Авторы

Богдан В.Г., Зафранская М.М., Гаин Ю.М.,  Демидчик Ю.Е.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

С целью осуществления выбора клеточной составляющей сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии проведена оценка пролиферативного потенциала, морфологических и фенотипических характеристик культур клеток мезенхимального происхождения. Установлено, что первичная культура мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) по своему пролиферативному потенциалу превосходит культуры фибробластов кожи и апоневроза. Культуры МСК ЖТ, фибробластов кожи, апоневроза и линии постнатальных фибробластов Foreskin характеризовались едиными морфологическими особенностями, обладали высокой жизнеспособностью и устойчивостью к средовым факторам. Первичная культура МСК ЖТ характеризовалась гетерогенной структурой с наличием клеток с гемопоэтическими маркерами CD34, CD31, CD45. Начиная с 1 пассажа, культуры клеток ЖТ приобретали характерный для ММСК клеточный фенотип CD90+/CD105++/CD44+/CD119+/CD34-/CD45-/CD31-, который сохранялся вплоть до 3 пассажа. Стабильно высокий уровень экспрессии маркера ССR7, не меняющийся при пассировании, возможно является одним из признаков, специфичных для фенотипа ММСК ЖТ. Высокий пролиферативный потенциал ММСК, выраженная миграционная способность, морфологическое и фенотипическое единство с культурами фибробластов, отработанный протокол выделения из жировой ткани свидетельствует о преимуществе использования ММСК ЖТ в качестве клеточной составляющей для создания биологических трансплантатов.

Прогресс и глубокие исследования в области клеточных и молекулярных технологий в начале XXI в. не только в целом обогатили фундаментальную науку и медицину новыми знаниями и позволили достоверно обосновать понимание существующих закономерностей и ранее предложенных гипотез, но в то же время расширили перечень инновационных и актуальных областей для исследований.

Перспектива применения клеточных технологий в реконструктивно-восстановительной хирургии основывается на возможности получения культур ауто- или аллогенных клеток с заданными свойствами [1–5]. Наиболее востребованными для этих целей признаются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) [6–8]. В современных условиях среди всех популяций постнатальных стволовых и прогениторных клеток значительное внимание уделено ММСК жировой ткани (ЖТ), к преимуществам использования которой можно отнести простоту и малоинвазивность способа эксплантации их тканевого источника, большой «выход» клеток при выделении [8–12].

Перспективными в настоящее время являются исследования по разработке многокомпонентых тканеинженерных конструкций для хирургического лечения пациентов с обширными дефектам мягких тканей и, в частности, с послеоперационными вентральными грыжами [2, 3, 13–15].

Одним из ключевых вопросов в решении этой задачи с применением тканеинженерных подходов является обоснованный выбор клеточной составляющей биологического трансплантата.

В современных литературных источниках достаточно много внимания уделено изучению морфологии и фенотипа ММСК, в том числе выделенных из ЖТ. Именно эти характеристики и определены Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии как специфичные для ММСК: а) адгезия к культуральному пластику и фибробластоподобная морфология; б) специфический иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR); в) способность дифференцироваться в трех ортодоксальных направлениях – остеогенном, адипогенном и хондрогенном [16].

Вместе с тем, отсутствие уникального маркера для ММСК побуждает к более детальному изучению фенотипа клеточных культур с определением более обширного спектра антигенов [17]. Также в доступной нам литературе отсутствуют систематизированные данные о сравнительных исследованиях пролиферативной активности, морфологических и фенотипических особенностей культур ММСК ЖТ и фибробластов, полученных из различных источников с комплексным анализом возможности применения изучаемых клеток в лечении пациентов с обширными послеоперационными дефектами.

Таким образом, исследование направлено на осуществление выбора клеточной составляющей сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии на основании оценки пролиферативного потенциала, морфологических и фенотипических характеристик культур клеток мезенхимального происхождения.

Материал и методы

Проведение научного исследования было одобрено этическим комитетом УЗ «4-я городская клиническая больница им. Н.Е. Савченко г. Минска», с подписанием пациентами информированного согласия на предоставление биологического материала, а также использование полученной в результате исследований информации для научных отчетов, статей, докладов, диссертационных работ. В исследование были включены 5 пациентов с послеоперационными вентральными грыжами больших размеров в качестве доноров жировой ткани и фрагментов апоневроза и кожи передней брюшной стенки, использованных для выделения ММСК и фибробластов.

Получение биологического материала

Эксплантацию биологического материала у пациента с послеоперационной вентральной грыжей больших размеров выполняли инцизионным способом. Полученные фрагменты подкожной жировой клетчатки в объеме до 5 см3 участок кожи и апоневроза площадью до 2 см2, помещали в герметичный контейнер со стерильным раствором и транспортировали в течение ближайших 2 ч в лабораторию для выделения и культивирования ММСК ЖТ и фибробластов. Все пациенты подписывали информированное согласие.

Выделение и культивирование ММСК ЖТ

Для выделения ММСК гомогенизированную ЖТ промывали стерильным раствором Хенкса и инкубировали в течение 45 мин с 0,075% раствором коллагеназы I типа (Sigma) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при 37ºС. Нейтрализацию фермента проводили равным объемом ФСБ, содержащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, США) (НИИ ЭиМ, РБ). Полученные в результате обработки коллагеназой клетки дважды отмывали центрифугированием, клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде DMEМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Sigma, США) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и высевали в концентрации 5×104 кл/см2 в культуральные чашки диаметром 60 мм [12].

Cмену среды производили каждые четвертые сутки. По достижении культурами ≈75% конфлюэнтности монослоя клетки снимали с поверхности культурального пластика с помощью 0,25% раствора трипсина/ЭДТА, затем трипсин ингибировали добавлением ФСБ, содержащего 10% ЭТС; после двукратного отмывания центрифугированием клетки засевали в культуральные чашки в концентрации 1×104 кл/см2.

Выделение и культивирование фибробластов, полученных из различных источников

Для выделения фибробластов человека использовали эксплантированные фрагменты кожи и апоневроза передней брюшной стенки (n = 5). Для расслоения кожи по базальной мембране и отделения дермы от эпидермиса кусочки кожи размером 1 см2 инкубировали в 0,25% диспазе (Sigma, США) в течение 24 ч при 4°С. Дерму или фрагмент апоневроза передней брюшной стенки промывали стерильным раствором Хенкса, нарезали на участки размером 0,5 см2 и инкубировали в течение 2 ч с 0,2% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в ФСБ при 37°С. Нейтрализацию фермента проводили равным объемом ФСБ, содержащего 10% ЭТС. Полученные в результате обработки коллагеназой клетки дважды отмывали цетрифугированием, клеточный осадок ресуспендировали в культуральной среде IMDM (Sigma, США) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и высевали в концентрации 5×104 кл/см2 в культуральные чашки диаметром 60 мм [12]. Смену среды производили каждые четвертые сутки.

Также в исследовании использовалась культура постнатальных фибробластов человека линии Foreskin (Human Foreskin Fibroblasts – HFF) [коллекция АТСС CRL 2429, ИНЦ РАН].

Микроскопия и мониторинг клеточных культур

Культуры исследовали на универсальных инвертированных микроскопах Micros (Австрия) и Carl Zeiss Axiovert 200 (Германия) с применением методов светлого поля, бокового освещения, фазового и Varel-контрастов, эпифлуоресценции (окраска акридиновым оранжевым и Хекстом 33342/пропидий йодидом).

Оценка жизнеспособности клеток

Для оценки жизнеспособности культуры ММСК на разных этапах культивирования применялся метод витальной окраски клеток флуоресцентным красителем Хекстом-33342 (Sigma, Германия) в рабочей концентрации 10-5 М.

Иммунофенотипирование клеточных культур

Для изучения экспрессии поверхностных и внутриклеточных маркеров культурами клеток использовали мышиные моноклональные антитела (МАТ) к антигенам CD90-FITC, CD105-PE, CD44-FITC, CD34APC, CD31-FITC/PE, CD45-PC7, CD119-PE, HLA-DRPE, HLA-АВС-PE (Beckman Coulter, США), CCR7-PE (R&D Systems, Канада). Для внутриклеточного окрашивания клетки предварительно фиксировали и пермеабилизировали с использованием набора IntraPrepТМ Permeabilization Reagent (R&D Systems, Канада). ММСК в концентрации 1×105/200 мкл переносили в пробирки для проточной цитометрии, инкубировали с моноклональными антителами в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. После окончания инкубации, клетки осаждали центрифугированием. Измерения проводили с использованием проточного цитометра FC 500 (Beckman Coulter, США).

Статистическая обработка полученных результатов

Статистическая обработка данных осуществлена с применением прикладного программного пакета «STATISTICA 6,0» (StatSoft, USA). Результаты представлены в формате Ме (25-й–75-й процентили). Для сравнения динамики изменения показателя в исследуемых группах использовали критерий Вилкоксона для парных сравнений. При сравнении показателей в независимых группах применяли U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05 [18].

Результаты и обсуждение

Проведен сравнительный анализ пролиферативного потенциала первичных культур ММСК ЖТ, фибробластов кожи и апоневроза пациентов с послеоперационными вентральными грыжами. Результаты представлены в табл. 1.

Полученные клеточные культуры отличались различной посевной концентрацией, скоростью роста, количеством клеток в первичной культуре.

Достоверное увеличение количества клеток первичной культуры более, чем в 2 раза выявлено только для ММСК ЖТ (с 1×106 (0,6×106–1,4×106) до 2,1×106 (2×106–2,2×106, соответственно).

Для стандартизации полученных результатов производился пересчет увеличения клеточности культур из расчета на 1×106 посеянных клеток. Показано, что МСК ЖТ характеризовались наибольшей скоростью пролиферации с количеством клеток в первичной культуре 2,1×106 (2×106–2,2×106) после 2-недельного культивирования, в то время как фибробласты кожи отличались наименьшим показателем (p < 0,05).

Таким образом, при аналогичных сроках культивирования использование жировой ткани позволяет получить наибольший объем клеточного материала по сравнению с кожей и апоневрозом.

Сравнение на светооптическом уровне морфологической картины первичных культур клеток, выделенных из различных источников, не выявило существенных отличий. Культуры ММСК ЖТ, фибробластов кожи и апоневроза характеризовались сходным гомогенным клеточным составом, включающим веретеновидные, фибробластоподобные клетки с четко выраженным ядром, ядрышками и цитоплазматической перинуклеарной зернистостью (рис. 1).

Дальнейшее культивирование ММСК ЖТ позволило установить ряд особенностей. Благодаря высокому пролиферативному потенциалу, в течение 3–5 сут. культивирования образовывалось большое количество варьирующих по размеру колоний клеток с многочисленными межклеточными контактами (рис. 2А). К 14–20 сут. культивирования равномерный конфлюэнтный монослой «вихреобразно» растущих клеток покрывал 85-95% культурального пластика (рис. 2Б).

С целью изучения возможных изменений морфологии клеток конфлюэнтные культуры ММСК ЖТ подвергались дальнейшему пассированию. В ходе мониторинга экспансии культур при пассировании был отмечен неравномерный рост клеток с образованием в субконфлюэнтной культуре зон гиперконфлюэнтности и участков с хаотично расположенными распластанными клетками (рис. 2В). Контактное торможение пролиферации в конфлюэнтных участках и низкий пролиферативный потенциал распластанных клеток приводили к увеличению сроков экспансии культуры (рис. 2 Г, Д).

На заключительных этапах культивирования проводилась оценка жизнеспособности культур с помощью методов витальной окраски клеток Хекстом 33342 (рис. 3). Жизнеспособность клеток составляла 96–98%.

В качестве положительного контроля использовалась культура постнатальных фибробластов человека 2 пассажа линии Foreskin (коллекция АТСС CRL 2429, ИНЦ РАН). Клетки характеризовались фибробластоподобной морфологией, с более мелкой и значительно выраженной цитоплазматической зернистостью по сравнению с ММСК (рис. 4).

Исследование культур фибробластов, выделенных из различных источников, не выявило существенных отличий их фенотипа от клеточного фенотипа ММСК ЖТ (табл. 2). Вместе с тем, проведенная оценка экспрессии поверхностных маркеров ММСК первичными культурами адгезивных клеток, выделенных из ЖТ, кожи, апоневроза передней брюшной стенки, а также фибробластов линии Foreskin, позволила выявить отдельные фенотипические особенности культуры ММСК ЖТ.

Нами подтверждена гетерогенная структура первичной культуры ММСК ЖТ с наличием клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры CD34, CD31, CD45, с достоверным увеличением CD34 относительно других клеточных линий. Также, культуры ММСК ЖТ, в отличие от дифференцированных фибробластов, экспрессировали хемокиновый рецептор ССR7 (р < 0,05), характеризующий миграционную способность клеток.

В таблице 3 представлены основные фенотипические маркеры первичных культур и культур 1–3 пассажей ММСК ЖТ человека. Показано, что в первичных культурах адгезивных клеток, выделенных из ЖТ, наряду с экспрессией типичных для культур мезенхимального происхождения маркеров (CD90, CD105, CD44), часть клеток имели на своей поверхности маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток CD34, CD31, CD45, экспрессия которых достоверно снижалась по мере пассирования, с сохранением стабильно высокого уровня ССR7. Таким образом, начиная с 1 пассажа, культуры клеток ЖТ приобретали характерный для ММСК клеточный фенотип CD90+/CD105+/CD44+/CD119+/CD34-/CD45-/CD31-. Данные фенотипические особенности сохранялись вплоть до 3 пассажа.

Было установлено, что количество фибробластов, позитивных по ССR7 рецептору, в среднем, составило 9,5%, тогда как в случае ММСК уровень экспрессии хемокинового рецептора достигал 89,4% % (р < 0,05) (табл. 2–3).

В целом, высокий уровень ССR7 можно трактовать как выраженную миграционную способность ММСК ЖТ, по сравнению со зрелыми клетками фибропластического дифферона.

Выводы

1. В первичной культуре ММСК ЖТ выявлена достоверная положительная динамика роста численности клеток и наибольшее их количество (из расчета на 1×106 посеянных клеток), по сравнению с первичными культурами фибробластов кожи и апоневроза.

2. Культуры ММСК ЖТ, фибробластов кожи, апоневроза и линии постнатальных фибробластов Foreskin характеризуются едиными морфологическими особенностями, обладают высокой жизнеспособностью и устойчивостью к средовым факторам.

3. Подтверждена гетерогенность популяции первичной культуры стромальных клеток ЖТ с наличием клеток, экспрессирующих CD34, CD31, CD45, с достоверным преобладанием по маркеру CD34 относительно других клеточных линий.

4. Начиная с 1 пассажа культуры клеток ЖТ «очищались», приобретали характерный для ММСК клеточный фенотип CD90+/CD105+/CD44+/CD119+/CD34-/CD45-/CD31-, который сохранялся вплоть до 3-го пассажа клеточных культур.

5. Высокий уровень экспрессии ССR7 в культурах ММСК ЖТ, по сравнению со зрелыми клетками фибропластического дифферона, возможно, является одним из специфических признаков, который может быть использован как дополнительный маркер ММСК ЖТ.

6. Описанный высокий пролиферативный потенциал ММСК, выраженная миграционная способность, морфологическое и фенотипическое единство с культурами фибробластов и универсальная методика выделения из жировой ткани свидетельствует о преимуществе использования ММСК ЖТ в качестве клеточной составляющей для создания сложных многокомпонентных биологических трансплантатов для реконструктивно-восстановительной хирургии.

Подняться вверх сайта