Поиск Кабинет

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки кроветворных и лимфоидных органов: действие пролином богатого полипепдида in vivo и in vitro

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 49-55

 

Авторы

Чайлахян Р.К., Галоян А.А., Герасимов Ю.В., Степанова Е.В., Соболев П.А., Чайлахян М.Р., Личиницер М.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Пролином богатый полипептид (ПБП) был впервые выделен акад. А.А. Галояном из нейросекреторных гранул N. Supraopticus и N. Paraventrticularis бычьего гипофиза. Добавление ПБП в культуральную среду (независимо от концентрации ПБП) на 4-е сут. культивирования приводит к стимуляции пролиферации ММСК в 1,5 раза, которая увеличивается до 2,5 раз, если культивирование продлить до 8 сут. Наоборот, в культурах стромальных клеток гигантоклеточной опухоли (ГКО) пролиферация ингибировалась в 1,5—2 раза при тех же концентрации ПБП и периоде культивирования. Различные способы и дозы введения ПБП были использованы в наших исследованиях. Наибольшее увеличение (в 4—9 раз) концентрации ММСК в костном мозге крыс отмечалось после в/м введения 5 мкг полипептида. При в/в введении наиболее значительное увеличение в 2,8 и 4 раза на 7-е и 14-е сут. соответственно наблюдалось при дозе 10 мкг. Реакция стромальной ткани селезенки при любых способах введения препарата отвечала умеренным (до 1,5 раз) возрастанием концентрации.

В организме все процессы жизнедеятельности муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток[ММСК][1], как и многих других клеточных популяций, контролируются различными ростовыми факторами, которые могут как активизировать пролиферацию, так и вовлекать покоящиеся клетки в пролиферацию и дифференцировку. К ростовым факторам, действие которых на пролиферацию и эффективность колониеобразования ММСК in vitro активно исследуются, относятся EGF, bFGF и PDGF и др.[2—6]. Клональная природа колоний фибробластов, формируемых ММСК в культуре ткани[7—10], позволяет изучать изменение их численности по увеличению или уменьшению эффективности колониеобразования[ЭКОф], т.е. отношению числа образованных колоний к числу эк-сплантированных клеток.

В настоящей работе в опытах in vitro и in vivo изучали действие пролином богатого полипептида[ПБП], впервые выделенного А.А. Галояном и его сотрудниками[11] из нейросекреторных гранул N. Supraopticus и N. Paravenricularis бычьего гипофиза, на пролиферативную активность и эффективность колониеобразования ММСК костного мозга. Ранее была показана регулирующая роль ПБП на миело- и гранулоцито-поэз у мышей[12], продемонстрированы его иммуностимулирующие, антинейродегенеративные и др. свойства. Данные последних исследований[13] выявили увеличение в 2—3 раза CFC[colony forming cell] колоний в метилцеллюлезных культурах костного мозга крыс, выделенного на 4-е сут. после введения 10 мкг ПБП. Добавление ПБП в культуры костного мозга контрольных животных и крыс, получивших ПБП, не приводило к дополнительному увеличению колоний. Эти результаты показали, что ПБП стимулирует образование CFC колоний in vivo, но не стимулирует их образование in vitro.

Различные способы и дозы введения ПБП крысам в нашей работе показали, что наибольшее увеличение (в 4—9 раз) концентрации ММСК в костном мозге крыс наблюдалось после в/м введения 5 мкг полипептида. При в/в введении наиболее значительное увеличение в 2,8 и 4 раза на 7-е и 14-е сут. соответственно наблюдалось при дозе 10 мкг. Реакция стромальной ткани селезенки при любых способах введения препарата отвечала умеренным (до 1,5 раз) возрастанием их концентрации.

Проведенные исследования выявили разнонаправленное действие ПБП на пролиферативную активность костномозговых стромальных клеток, полученных от здорового человека, и стромальных клеток, выделенных из гигантоклеточной опухоли (ГКО) человека. Добавление 1, 5 и 10 мкг ПБП на флакон (25 см2), содержащий в 5 мл полной среды 3x104 клеток, независимо от концентрации ПБП, на 4-е сут. культивирования приводило к стимуляции пролиферации в среднем в 1,5 раза, которое усиливалось до 2,5 раз при увеличении срока культивирования до 8 сут. В культурах же стромальных клеток гигантоклеточной опухоли при тех же концентрациях ПБП и сроках культивирования происходило подавление пролиферативной активности в 1,5—2 раза.

Материалы и методы

В работе использованы морские свинки и крысы «Wistar», самцы, массой 100—120 г, полученные из питомника РАМН «Крюково».

Получение штаммов ММСК костного мозга человека. Трепанат костного мозга человека получали из клиники челюстно-лицевой хирургии при проведении операций по трансплантации аутологичного фрагмента гребня тазовой кости. Трепанат переносили во флакон со свежей питательной средой и последовательным пропусканием через шприц с уменьшающимся диаметром игл готовили одноклеточную суспензию, фильтровали через 4-слойный капроновый фильтр и подсчитывали общее число клеток. Клетки эксплан-тировали в пластиковые флаконы (Nunc 80 см2), содержащие 80% питательной среды Mesencult (Stem cell согр.), 20% сыворотки эмбрионов коров (Ну clone) и антибиотики (100 ед. пенициллина и 100 мг стреп-клеток на см2 площади дна флакона. Культивирование проводили при температуре 37°С в атмосфере 5%С02. На 12—14-е сут., когда во флаконах формировались дискретные колонии стромальных фибро-бластов, проводили 1-й пассаж[14]. Культуральную среду сливали, флаконы дважды промывали физиологическим раствором и заливали 4—5 мл 0,25% раствором трипсина (Sigma). Обработку культур трипсином проводили в течение 3—5 мин, затем трипсин сливали, а флаконы инкубировали в термостате при 37°С в течение 15—20 мин. По истечении этого времени, во флаконы добавляли 5—7 мл свежей питательной среды и встряхивали их. Неоткрепившиеся клетки снимали средой с помощью пастеровской пипетки. После подсчета числа снятых клеток их переносили в новые флаконы большей площади с полнойдостижении клетками конфлюэнтного слоя производили следующий пассаж.

Для получения штаммов ММСК костного мозга крыс животных усыпляли эфиром. В условиях асептики выделяли бедренные кости, обрезали эпифизы костей и шприцом вымывали костный мозг в питательную среду. Дальнейшие действия были аналогичны действиям при получении штаммов ММСК из костного мозга человека.

Стромальные клетки гигантоклеточной опухоли человека выделяли путем трипсинизации[15] измельченных (1—1,5 мм3) фрагментов опухоли. Их промывали в 2-х порциях свежей среды, переносили во флакон с 3—4 мл 0,25% раствора трипсина и помещали на магнитную мешалку на 20 мин при комнатной температуре. По истечении этого времени сохранившимся фрагментам опухоли давали осесть, раствор трипсина с вымытыми клетками переносили во флакон с 1 мл сыворотки эмбрионов коров (СЗК), а во флакон с фрагментами добавляли новую порцию трипсина. Процедуру повторяли 3 раза, подсчипластиковые флаконы (80 см 2) с 15 мл полной питательной среды. Образовавшиеся на 12—14-е сут. колонии стромальных фибробластов пересевали по описанному выше методу.

Изучение действия ПБП на пролиферативную активность проводили на клетках 2-3 пассажа костномозговых ММСК человека и морской свинки. В 12 культуральных флаконов площадью 25 см2, содержащих 5 мл полной питательной среды, засевали по xчение 8 сут. Все флаконы были разделены на 4 группы по 3 флакона в каждой. Во флаконы 1-й группы добавляли по 1 мкг ПБП на флакон, 2-й группы — 5 мкг, 3-й группы — 10 мкг, 4-я группа служила контролем. Культивирование проводили при 37°С в атмосфере 5% С02. На 4-й или 8-й день, когда рост клеток достигал близкого к конфлюентному, культивирование прекращали, клетки снимали с пластика и производили подсчет числа выросших клеток в каждой группе флаконов.

Для изучения действия ПБП на содержание ММСК в кроветворных и лимфоидных органах полипептид вводили крысам в 0,5 мл физиологического раствора в/м, в/в или в/брюшинно. Животные были разделены на 4 группы по 3 крысы в каждой. 1-й группе вводили 1 мкг ПБП, 2-й — 5 мкг, 3-й — 10 мкг, 4-й — контрольной — 0,5 мл физиологического раствора. На 7-е или 14-е сут.после введения препарата животных усыпляли эфиром, выделяли б/берцовые кости. Костномозговые суспензии готовили отдельно для каждой группы животных. После подсчета общего чис-взвеси каждой группы эксплантировали в 4 флакона (25 см2) с 5 мл полной питательной среды. Флаконы помещали в С02 инкубатор при 37°С. На 10—12 день культивирование прекращали, питательную среду сливали, культуры дважды промывали физиологическим раствором, фиксировали 70° этанолом в течение 30—40 мин, окрашивали по Гимзе и под бинокулярной лупой подсчитывали число выросших колоний, содержащих не менее 50 клеток.

Результаты

ММСК нормального донора, 1 мкг ПБП и культивировании в течении 4-х сут. число выросших клеток в опытных флаконах, по сравнению с контрольными культурами, увеличивалось от 1,25 до 1,46 раз (в среднем в 1,3 раза). Во флаконах, содержащих 5 мкг пептида, увеличение составило 1,4—1,5 раз (в среднем в 1,43 раза), а при добавлении 10 мкг — от 1.4 до 1,7 раз (в среднем 1,52 раза). Из приведенных данных видно, что увеличение концентрации ПБП в питательной среде от 0,2 до 2,0 мкг/мл практически не отражалось на повышении пролиферативной активности клеток, которая в среднем составляла 1.5 раза. Заслуживало внимания изучение действия ПБП на пролиферативную активность клеток при более продолжительном времени культивирования. Чтобы избежать контактного торможения клеток при формировании плотного монослоя, количество эксп-лантируемых на флакон клеток уменьшили в 3 раза[1x104) при тех же концентрациях ПБП. Продолжительность культивирования составляла 8 дней. Средние значения увеличения численности клеток во флаконах с ПБП в 2 раза превышали эти значения при культивировании в течение 8 сут. и составляли во флаконах с 1 мкг — 2,6; 5 мкг — 2,75 и 10 мкг ^2,9 раз соответственно. Зависимость увеличения пролиферативной активности клеток от концентрации ПБП оставалась неизменной (рис. 1).

Учитывая повышение пролиферативной активности ММСК с увеличением времени культивирования, т.е. увеличением времени воздействия препарата на клетки, при исследовании действия ПБП на стромаль-ные клетки гигантоклеточной опухоли (ГКО) человека во флаконы эксплантировали 1x104 и 3,3x103 клеток. Продолжительность культивирования составляла 8 и 12 сут. соответственно. Исследуемые концентрации ПБП оставались прежними — 0,2; 1 и 2 мкг/мл. В опытных флаконах численность выросших клеток, по сравнению с контрольными флаконами, уменьшилась в 1,1—1,4 раза (см. рис. 1). Подобнаяклеток и культивировании в течение 12 сут. В данной серии экспериментов из-за низкой плотности эксплан-x

нослоя происходил рост множества мелких колоний стромальных клеток, т.е. происходило реклонирование. Число колоний, выросших в контрольных флаконах, превосходило число колоний в опытных группах в 1,75—1,49 раз (рис. 2). Таким образом, нам удалось выявить диаметрально противоположные эффекты действия ПБП: стимуляцию (до 2,4 раз) пролиферативной активности ММСК, выделенных из костного мозга человека, и ингибирование (более чем в 1,5 раза) пролиферации стромальных клеток, выделенных из гигантоклеточной опухоли человека.

Исследования по влиянию ПБП на ММСК in vivo проведены на крысах «Wistar», которым вводили препарат в дозе 1, 5 и 10 мкг/ животное в 0,5 мл физиологического раствора в/м в/в или в/брюшинно.

Как было отмечено выше, клональная природа колоний ММСК, образующихся в культуре ткани на 10—12-е сут. после эксплантации взвеси клеток кроветворной или лимфоидной тканей, позволяет определить изменение их численности в норме или различных воздействиях на организм. Действие ПБП на изменение численности ММСК в костном мозге и селезенке определяли по числу выросших in vitro колоний-клонов при одинаковом числе эксплантиро-ванных на флакон клеток от опытных и контрольных животных. В этой серии опытов эксплантацию взвеси клеток производили на 7-е и 14-е сут. после введения препарата независимо от способа введения. Контрольным животным вводили 0,5 мл физиологического раствора. В первом эксперименте крысам вводили в/м 5 мкг полипептида. Результаты показали, что в культурах костного мозга крыс, эксплантиро-ванных на 7-е сут. после введения ПБП, число выросших колоний в 4 раза превосходило число колоний, выросших в контрольных флаконах, а в культурах, полученных на 14 день эксплантации, превышение над контрольными значениями достигало 9 раз (рис. 2). Введение крысам 1 и 5 мкг ПБП показало, что в культурах, полученных на 7-е сут. эксплантации клеток, при обеих дозах введения численность ММСК в костном мозге возрастала более чем в 4 раза. В культурах, начатых на 14-е сут. после введения препарата, действие 1 мкг ПБП стало менее выраженным. Число выросших колоний в них превышало контрольные значения лишь в 1,75 раза, а при дозе 5 мкг превышение увеличилось до 5,2 раз. При дальнейшем изучении действия ПБП на численность ММСК в костном мозге и селезенке были испытаны дозы 1, 5 и 10 мкг/животное и различные способы введения препарата — в/венный и в/брюшинный. При проведении этой серии экспериментов в качестве дополнительного контроля была использована доза в 5 мкг препарата, стабильно приводившая к увеличению (в 4—9 раз) численности ММСК в костном мозге при в/мышечном введении (рис. 4).

При эксплантации костного мозга через 7 сут. после в/в введения 1, 5 и 10 мкг ПБП число выросших в культурах колоний увеличивалось по сравнению с контролем в 1,2; 1,8 и 2,8 раза соответственно. Доза в 5 мкг при в/м введении, используемая в качестве контроля, в культурах этого же срока приводила к увеличению числа колоний в 4,2 раза. На 14-е сут. прирост численности ММСК при в/м введении увеличивался до 4,6 раз. В тех же пределах, по сравнению с культурами 7-х сут., оставалось увеличение численности при в/в введении 1 и 5 мкг — 1,3 и 1,4 раза, а доза в 10 мкг приводила к увеличению в 4,7 раза (рис. 5).

В сравнительных экспериментах по изучению влияния ПБП на численность ММСК в кроветворных (костный мозг) и лимфоидных (селезенка) органах 5 мкг полипептида вводили крысам в/м и в/бр. На 7-е сут. после в/м введения прирост численности колоний в культурах клеток селезенки составлял 1,3 раза, а при в/бр — 1,2 раза, по сравнению с соответствующим контролем. Ответная реакция костного мозга при в/м введении была ожидаемой — увеличение составило 5,1 раза, в то же время численность ММСК при в/бр введении возросла лишь в 1,7 раза. К 14-м сут. действие препарата на стромальную ткань селезенки практически не изменилось. Увеличение составило при в/м введении 1,4 раза, а при в/бр — 1,2 раза. В костном мозге к этому сроку численность ММСК при в/м введении увеличилась в 4,5 раза, а при в/бр в 1,7 раза.

Обсуждение

Методы клеточных технологий находят все более широкое применение в регенеративной медицине, реконструктивных операциях на костной и хрящевой тканях и т.д. В клинике онкогематологии широкое распространение получил метод мобилизации в кровоток гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) путем введения больному ростового фактора G-CSF, последующим селективным отбором ГСК и их обратной трансплантацией после проведения курса химио-или лучевой терапии. Аутологичные ММСК, после ГСК, являются наиболее перспективными для использования в медицинской практике. В отличие от эмбриональных стволовых клеток, они не подвержены опухолевой трансформации, получение их не связано с моральными и правовыми ограничениями.

Полученные данные показали, что наибольшее увеличение содержания ММСК в костном мозге наблюдалось при в/м введении препарата. При в/в введении увеличение содержания было не столь значительным, лишь доза в 10 мкг к 14-м сут. приводила к повышению содержания ММСК в костном мозге до значений, сравнимых с в/м введением. Реакция стромальной ткани селезенки, независимо от способа введения полипептида, в исследуемые сроки 7 и 14 сут. была не очень выраженной. Число клеток, формирующих колонии фибробластов, увеличилось в 1,2—1,4 раза. Приблизительно таким же был ответ ММСК костного мозга на в/брюшинное введение ПБП.

Известно, что ММСК в организме находятся вне пролиферативного пула[16]. Однако некоторые физические воздействия на организм, такие как облучение, травма и др., выводят их из состояния покоя. Показано, что кюретаж костномозговой полости большеберцовой кости морской свинки приводит к увеличению концентрации ММСК в контрлатеральной большеберцовой кости в 2^3 раза сразу же после окончания кюретажа и держится на этом уровне вплоть до 20-х сут. — конечного срока наблюдения. Двукратное увеличение концентрации ММСК в селезенке отмечается лишь к 20-м сут. после кюретажа. До этого срока концентрация стромальных клеток оставалась близкой к контрольным значениям. Реакция стромальной ткани селезенки при кюретаже схожа с таковой при введении ПБП. Превышение над контрольными значениями вплоть до 14-х сут. составляло 1,2—1,3 раза, т.е. имеет место несколько отсроченное развитие системного ответа стромальной ткани организма. Внутривенное введение интактным морским свинкам 1 мл сыворотки от кюретированных животных через день приводило к увеличению концентрации ММСК в костном мозге в 2^2,5 раза по сравнению с животными, которым вводили такое же количество аллогенной сыворотки[17]. Это свидетельствует о том, что в организме в ответ на травму костного мозга (кюретаж) сразу же начинают вырабатываться гуморальные факторы или факторы, под влиянием которых возрастает содержание ММСК в кроветворных и лимфоидных органах.

Длительное (1—2 мес.) поддержание клеток in vitro в процессе наращивания клеточной массы требует присутствия в среде ростстимулирующих веществ, в качестве которых используется сыворотка эмбрионов коров (СЗК). Имеющиеся сегодня на рынке бессы-вороточные среды не удовлетворяют предъявляемым требованиям. Различная эффективность действия отдельных лотов СЗК, возможность заражения культур вирусами коровьего бешенства стимулируют поиск компонентов, способных заменить СЗК в процессе культивирования и, что еще важнее, сократить время культивирования. Этого можно достичь, увеличив концентрацию ММСК в костном мозге больного до получения трепаната и усилив пролиферативную активность клеток в культуре. Над проблемой действия различных ростовых факторов на пролиферацию и повышения колониеобразования ММСК при добавлении их в культуры работают многие коллективы исследователей[18—21]. Полученные ими данные не позволяют составить четкой картины действия на ММСК даже одних и тех же факторов роста[22]. Это связано с различными способами выделения клеток, использованием разных питательных сред, процентного содержания в среде эмбриональной сыворотки и т.д. В литературе отсутствуют данные о каких-либо ростовых факторах или иных веществах, способных увеличивать содержание ММСК в костном мозге при его введении в организм. ПБП на сегодняшний день является единственными препаратом, в/м введение которого более чем в 5 раз повышает содержание ММСК в костном мозге и в 2 раза усиливает пролиферативную активность клеток при добавлении в культуру. В этой связи своевременность и актуальность полученных данных определяется, в первую очередь, возможным сокращением времени наращивания клеточной массы для клинического использования. Известно, что уже на относительно невысоких пассажах (8—10 пассаж), возможно увеличение числа хромосомных аберраций превышающих фоновый уровень[23]. Это делает невозможным их использование в клинике. Изучение действия данного полипептида необходимо продолжить с целью выработки точной схемы его введения как в организм, так и в культуру ткани, вызывающую наивысшую мобилизацию ММСК в костном мозге и пролиферацию клеток in vitro. Исключительно важными и заслуживающими дальнейшего изучения являются механизмы, лежащие в основе противоположного действия ПБП на стромальные клетки нормального костного мозга человека и стромальные клетки ГКО.

Подняться вверх сайта