Поиск Кабинет

Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные двухкассетными плазмидами (vegf + нейротрофический фактор) для терапии бокового амиотрофического склероза

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 92-97

 

Авторы

Кудряшова Н.В.,  Гусева Д.С., Салафутдинов И.И.,  Баширов Ф.В., Киясов А.П.,  Ризванов А.А.,  Исламов Р.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для увеличения жизнестойкости нервных клеток при нейродегенеративных заболеваниях после травматических и ишемических повреждений многолетние исследования in vitro и in vivo выявили наиболее значимые нейротрофические и нейропротекторные факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов. К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Одним из перспективных способов доставки поддерживающих выживание нейронов факторов считается трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих рекомбинантные терапевтические гены. В статье приводится технология создания клеточных носителей терапевтических генов на основе мононуклеарной фракции пуповинной крови человека и двухкассетных плазмид, одновременно экспрессирующих два терапевтических гена. Эффективность экспрессии трансгенов изучена in vitro методом ПЦР-РВ. Анализ выживания, миграции и фенотипа генетически модифицированных клеток исследовали через 2 нед. после трансплантации трансгенным мышам с фенотипом бокового амиотрофического склероза.

Целесообразность генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови для клеточной терапии в регенеративной медицине обусловлена: повышением жизнеспособности трансплантированных клеток в тканях реципиента; адресной доставкой специфических ростовых и трофических факторов в область дегенерации; направленной дифференцировкой прогениторных и стволовых клеток пуповинной крови. Ранее на основе плазмидного вектора pcDNA3.1 нами были получены генетические конструкции, экспрессирующие нейрональную молекулу адгезии L1 (pcDNA-hL1CAM), сосудистый эндотелиальный фактор роста (pcDNA-VEGF121, pcDNA-VEGF165, pcDNA-VEGF189), фактора роста фибробластов (pcDNA-FGF2), глиальный нейротрофический фактор (pcDNA-GDNF). Согласно нашей гипотезе, адресную доставку терапевтического гена в нервную ткань можно эффективнее осуществлять с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови, одновременно экспрессирующих терапевтический ген и ген молекулы адгезии нервных клеток. Нами впервые была создана генетическая конструкция, кодирующая VEGF и L1CAM. Экспрессия гена молекулы адгезии нейронов в генетически модифицированных клетках может не только повысить их способность к адресной миграции, но и выживаемость в нервной ткани реципиента, а следовательно, увеличится продолжительность действия терапевтического гена на нервные клетки [1, 2]. Одновременно нами решалась задача о возможности доставки в область регенерации нервной ткани сразу двух терапевтических генов. С этой целью нами была создана двухкассетная плазмида, кодирующая VEGF и FGF2 [3]. В настоящем исследовании нами разработана новая двухкассетная плазмидная конструкция, одновременно экспрессирующая VEGF и глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Эффективность трансфекции мононуклеарных клеток пуповинной крови оценивали in vitro. Возможность применения полученных генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови для стимулирования нейрорегенерации исследовали на трансгенных G93A мышах с фенотипом бокового амиотрофического склероза.

Материал и методы

Создание двухкассетных плазмидных конструкций. Создание генетических конструкций pBud-VEGF-FGF2, pBud-EGFP и pBud-VEGF-L1CAM, экспрессирующих vegf, fgf2, egfp и l1cam, было описано ранее [4, 5]. Аналогично описанной стратегии была создана конструкция pBud-VEGF-GDNF. Исходя из нуклеотидных последовательностей, представленных в базе данных GeneBank, разработаны специфические праймеры для ПЦРамплификации полной открытой рамки считывания гена gdnf (5’-ggtaccaccatgaagttatgggatgtcgtg-3’, 5’-ggtaccaccatgaagttatgggatgtcgtg-3’). 5’- и 3’праймеры содержали адаптерные участки с уникальными сайтами рестрикции KpnI и XhoI, применяемые для клонирования гена в экспрессионный плазмидный вектор pcDNA 3.1(+) (Invitrogen, США). Матрицей для ПЦР-амплификации гена послужила плазмида pLVPT-GDNF-tTR-KRAB [6]. Ко-экспрессирующие векторы собраны на основе pBudCE4.1 (Invitrogen, США) субклонированием гена gdnf под контролем промотора CMV по сайтам рестрикции HindIII и XbaI и изоформы vegf165 под контролем промотора EF-1α по сайтам рестрикции KpnI и XhoI. Конечное подтверждение получения экспрессионной плазмиды pBud-VEGF-GDNF осуществляли с помощью ДНК-секвенирования с применением стандартных вектор-специфических праймеров.

Получение генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови. Выделение клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека производили из свежих образцов крови при помощи седиментации в градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077 г/мл). Затем клетки отмывали фосфатносолевым буфером, эритроциты лизировали в гипотоническом растворе и оставшиеся мононуклеарные клетки использовали для трансфекции [7].

Трансфекцию клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека проводили с помощью электропорации в 4 мм электропорационных кюветах на приборе Gene Pulser Xcell Electroporation System (BioRad, США). После воздействия электрического импульса клетки переносили в культуральный флакон и добавляли среду Игла, модифицированную по методу Дульбекко (Sigma, США), содержащую 10% сыворотки крови плодов коров (Sigma, США), 2 мM L-глутамина и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma, США) [8].

Количественная оценка экспрессии мРНК генов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Общую РНК из клеточных осадков выделяли с помощью набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез кДНК осуществляли с помощью набора Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen, США). Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов β-actin, fgf2 и vegf проводили на приборе iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Каждая реакция включала в себя универсальный мастер микс для ПЦР, специфичные прямой и обратный праймеры, флуоресцентную пробу TagMan (Синтол, Россия) и целевую кДНК. Последовательности праймеров и проб представлены в табл. 1. Серийное разведение кДНК, синтезированной из мРНК трансфицированных клеток, использовали для построения стандартной кривой и определения уровня экспрессии гена. Количество РНК было нормализовано по β-актину [9].

Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Ксенотрансплантация генетически модифицированных клеток трансгенным G93A мышам. Доклинические испытания полученных генно-клеточных конструкций были проведены на трансгенных мышах B6SJL-Tg(SOD1-G93A)dl1Gur/J, приобретённых из питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и академика Ю.А. Овчинникова РАН (филиал ИБХ РАН). Данная линия мышей характеризуется присутствием в геноме аллелей мутантного гена человека – Cu/Zn-супероксиддисмутазы sod1 (Gly93→Ala; глицин замещён на аланин в позиции 93), в результате чего у мышей развивается заболевание, напоминающее боковой амиотрофический склероз человека. В виварии Казанского государственного медицинского университета половозрелые самцы и самки в возрасте 24–28 нед. были разделены на две группы по 3–4 мыши для трансплантации генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных: 1) плазмидными векторами pBud-EGFP; 2) pBud-VEGF-GDNF. Трансплантацию выполняли путём инъекции 1×106 генетически модифицированных клеток в ретроорбитальное пространство экспериментальных животных. Через 2 нед. после трансплантации мышей наркотизировали, через большой круг кровообращения транскардиально вводили сначала холодный фосфатно-солевой буфер (ФС) (рН = 7,4), затем – холодный 4% раствор параформальдегида (рН = 7,4). Спинной мозг извлекали из позвоночного столба, постфиксировали в растворе параформальдегида, после чего, в целях криопротекции, фиксированную ткань насыщали 30% раствором сахарозы.

Иммунофлуоресцентный метод. Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания готовили криостатные серийные продольные срезы спинного мозга толщиной 20 мкм. С целью оптимизации связывания антител (АТ) с антигенами (АГ) срезы обрабатывали 0,01 M раствором цитрата натрия (pH 9,0) при 70°C на водяной бане в течение 30 мин [10]. После охлаждения срезов до комнатной температуры и промывки в ФС буфере блокировали неспецифические места связывания в ФС буфере, содержащем 0,2% Тритон X-100, 0,02% азид натрия и 5% сыворотку осла, в течение 1 ч при комнатной температуре. Для идентификации АГ срезы инкубировали с первичными АТ (табл. 2) в течение 3 сут. при 4°C, промывали в ФС буфере и затем инкубировали со вторичными АТ осла, конъюгированными с флуоресцентными красителями Alexa 594 или Dy Light 649 (разведение 1:200), в течение 2 ч при комнатной температуре. Для визуализации клеточных ядер срезы дополнительно окрашивали в течение 20 мин. при комнатной температуре раствором бис-бензимида (краситель Hoechst 33258, 5 мкг/мл в ФС буфере, Sigma, США). Окрашенные срезы заключали в среду, поддерживающую флуоресценцию, и исследовали при помощи лазерного сканирующего микроскопа (Zeiss Axiovert 200M, Германия).

Результаты

Экспрессия vegf, и fgf2 в трансфицированных мононуклеарных клетках пуповинной крови человека. Мононуклеарные клетки выделяли из свежей пуповинной крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла. Полученные клетки трансфицировали плазмидными векторами pBud-EGFP, pBud-VEGF-GDNF, pBud-VEGF-FGF2 и pBud-VEGF-L1САМ с помощью электропорации. Уровень мРНК генов vegf и fgf2 в мононуклеарных клетках пуповинной крови человека определяли через 24 ч после трансфекции (рис. 1). Результаты проведенного анализа показали, что уровень мРНК исследуемых генов в трансфицированных клетках существенно превысил уровень соответствующих мРНК в трансфицированных egfp клетках, что свидетельствует об эффективной экспрессии рекомбинантных генов в мононуклеарных клетках in vitro.

Иммунофенотипирование генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека в спинном мозге трансгенных G93A мышей. Для идентификации и иммунофенотипирования мононуклеарных клеток, трансдуцированных плазмидой pBud-VEGF-GDNF, было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание продольных срезов спинного мозга мышей с помощью АТ против ядерного АГ человека (HNA) и АТ против одного из клеточных маркёров (эндотелиальных клеток – CD34, астроцитов – S100, олигодендроцитов – OSP и микроглии – Iba1).

Через 2 нед. после трансплантации генетически модифицированных клеток в спинном мозге подопытных мышей были обнаружены HNA-позитивные клетки. Генетически модифицированные клетки, экспрессирующие EGFP, при двойном иммунофлуоресцентном окрашивании реагировали с АТ к HNA и маркёру микроглии Iba1 (HNA+/Iba1+-клетки), или маркёру эндотелиальных клеток CD34 (HNA+/ CD34+-клетки) (рис. 2). HNA+/Iba1+-клетки по своим морфологическим признакам напоминали клетки микроглии. Они имели небольшое «тело» овальной формы с многочисленными короткими отростками (рис. 3). Иммунофенотипирование генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих GDNF и VEGF, с применением маркёров нервных клеток (нейрональная форма β-III тубулина), эндотелиальных клеток (CD34), астроцитов (S100), олигодендроцитов (OSP) и микроглии (Iba1) не обнаружило признаков принадлежности клеток ни к одному из клеточных типов ЦНС (рис. 4).

Обсуждение

Многолетние исследования in vitro и in vivo выявили наиболее значимые нейротрофические и нейропротекторные факторы, которые могут быть применены в качестве лекарственных препаратов для стимулирования нейрорегенерации. К ним относятся мозговой нейротрофический фактор (BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) [11,12]. При этом установлено, что комбинации нескольких нейротрофических факторов могут иметь более выраженный эффект на выживание нервных клеток. Одним из перспективных способов доставки поддерживающих выживание нейронов факторов считается трансплантация генетически модифицированных клеток, сверхэкспрессирующих клонированные терапевтические гены. Однако в настоящее время проводимые доклинические и клинические испытания клеточных носителей терапевтических генов не выявили наиболее эффективную генно-клеточную конструкцию для стимулирования нейрорегенерации.

В наших экспериментах в качестве клеточного носителя были выбраны мононуклеарные клетки пуповинной крови человека. Важно заметить, что мононуклеарные клетки пуповинной крови способны проникать через гематоэнцефалический барьер, а сигнальные молекулы, секретируемые погибающими нервными клеткми, могут усиливать хоуминг мононуклеаров в ЦНС. Полученные нами результаты по трансплантации генетически модифицированных монононуклеарных клеток крови пуповины мышам G93A свидетельствуют, что трансплантированные клетки могут служить не только источником рекомбинантных ростовых и трофических факторов, но и дифференцироваться в паренхиматозные клетки ЦНС. Так, EGFP-трансфицированные клетки, экспрессирующие репортёрный ген, могут дифференцироваться в клетки микроглии (Iba1-позитивные) или эндотелиальные клетки (CD34-позитивные). Другими словами, мононуклеарные клетки крови пуповины реализуют свой эндогенный потенциал, т.е. моноциты дифференцируются в макрофаги, а прогениторные эндотелиальные клетки в эндотелий. Интересно, что после трансфекции плазмидным вектором pBud-VEGF-FGF2 мононуклеарные клетки крови пуповины дифференцируются в S-100-позитивные клетки. При этом не стоит рассчитывать на замещение утраченных нейронов новыми клетками. Все выявленные HNA+-клетки не реагировали с АТ против маркёра нервных клеток нейрональной формы β-III тубулина (HNA+β-III тубулин-клетки) [3].

Таким образом, генетически модифицированные мононуклеарные клетки пуповинной крови могут быть не только клеточным носителем рекомбинантного гена, но дифференцироваться в разные клеточные типы ЦНС. В своих исследованиях мы впервые получили результаты о возможности генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови дифференцироваться в эндотелиальные клетки, клетки макро и микроглии в спинном мозге мышей с фенотипом бокового амиотрофического склероза. При этом направленность дифференцировки может быть обусловлена терапевтическим геном или задана специальными факторами дифференцировки.

Подняться вверх сайта