Поиск Кабинет

Модели для изучения биологических свойств гемопоэтических стволовых клеток человека

Гены & Клетки: Том IX, №1, 2014 год, стр.: 15-22

 

Авторы

Устюгов А.Ю., Румянцев С.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В статье рассматриваются различные экспериментальные модели in vivo, внесшие вклад в понимание гемопоэза и приживления гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от источника их получения. Описаны относительные достоинства и недостатки каждой из приведенных моделей, общей особенностью которых является то, что наивысший уровень приживления отмечается при использовании клеток пуповинной крови, несколько меньший — в случае костномозговых клеток и, наконец, самый низкий — при использовании мобилизованных клеток периферической крови. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый за годы исследований, причина относительно низкого уровня человеческих клеток, генерируемых в этих моделях, до сих пор не ясна. Но, возможно, эта проблема будет решена с использованием достижений генной инженерии.

В последние 20 лет важную роль в понимании гемопоэза человека внесли доклинические исследования с использованием различных моделей in vivo [1—6]. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются ключевыми участниками гемопоэза. Небольшая популяция ГСК способна дать начало потомству клеток с высокой пролиферативной активностью, которые в свою очередь могут дифференцироваться в миллионы зрелых лимфогемопоэтических клеток, что было доказано в экспериментальных и клинических исследованиях по трансплантации костного мозга [7—11].

Первоначально эти свойства ГСК были показаны в экспериментах по трасплантации на мышах, где с целью демонстрации восстановления популяций лимфоидной и миелоидной линий у реципиента использовали генетические маркеры, которые отсутствовали у животного-донора [12—17]. Возможность применения меченных ретровирусом ГСК позволила провести более детальный анализ их приживления и пролиферации после трансплантации. В результате этих исследований появилось представление о возможном поведении донорских ГСК у реципиента [18, 19].

По аналогии с мышиными проводилось изучение ГСК человека, где для селективного выявления использовали костный мозг с различными генетическими метками [20] или аутогенные клетки, транс-дуцированные ретровирусными векторами. Однако данные исследования были ретроспективными из-за

ограниченного числа информативных клинических данных и низкого уровня ретровирусной трансдукции [21—23]. Помимо in vivo моделей, развитие исследований in vitro с использованием примитивных ГСК человека облегчило изучение гемопоэза. Модели, в которых применялось длительное культивирование костномозговых культур, продемонстрировали способность примитивных ГСК дифференцироваться в клетки различных миелоидных и лимфоидных линий [24—26]. В одной из работ была описана способность LT-CIC клеток (LT-CIC — стволовые клетки, обеспечивающие кроветворение в длительной культуре костного мозга) поддерживать популяцию гемопоэтических клеток-предшественниц в культуре до 100 сут. [26]. В экспериментах S.J. Szilvassy et al. (1990) продемонстрирована прямо пропорциональная зависимость между количеством LT-CIC и способностью ГСК к самообновлению в ходе серийных трансплантаций [27, 28]. Корреляция между клинической трансплантацией и in vitro моделями исследования ГСК человека значительно расширила возможности изучения гемопоэза.

Также известно, что трансплантированные клетки или органы от одного вида другому (ксенотрансплан-таты) могут поддерживаться в макроорганизме, если они вводятся до того, как у животного появляется компетентная иммунная система [29—31]. Трансплантированный орган или клетки служат для «обучения» развивающейся иммунной системы, создавая толерантность к гетерологичным клеткам.

Имеется ряд методов индукции толерантности в развивающейся мыши, овце и свинье, которые эффективны в области изучения органной трансплантации [1-3].

Линии человеческих клеток, опухоли и органы, трансплантированные иммунодефицитным мышам, функционируют долгое время благодаря обеспечению соответствующего микроокружения, в котором трансплантированные клетки или ткани могут приживаться или претерпевать экспансию долгое время без отторжения организмом животного-хозяина. Описано множество линий мышей с естественно развивающимися мутациями или с направленными повреждениями генов, которые важны для нормальной иммунной функции [32, 33]. Для трансплантируемых ГСК человека в ходе доклинических исследований наиболее часто используются модели, представляющие собой естественно развивающиеся рецессивные мутации тяжелого комбинированного иммунодефицита (scid), beige (bg), nude (nu) и Х-сцепленного иммунодефицита (xid), которые оказались наиболее полезными в исследованиях.

Таким образом, мы видим, как разнообразные экспериментальные модели по изучению биологических свойств клеток и их взаимодействию друг с другом способны дополнять друг друга и служить развитию науки в целом. В данной статье мы постараемся кратко описать различные экспериментальные модели, внесшие вклад в понимание ге-мопоэза.

Модель ксенотрансплантации плодам овцы

Гестационный период у овцы составляет приблизительно 160 сут. В интервале между 50 и 60 днями гестации система кроветворения плода овцы быстро развивается. Это развитие предшествует началу функционирования иммунной системы между 67 и 77 днями гестации. Группа E.D. Zanjani (1996, 1997) показала, что трансплантация ГСК человека в период между 50 и 60 днями гестации может облегчить приживление и существование человеческих клеток в плоде овцы до того, как иммунная система станет активной и не сможет индуцировать толерантность к человеческим антигенам [1-3]. Таким образом, понимание комбинации увеличения приживления и толерантности позволило бы обеспечить пролонгированную выживаемость трансплантата.

Первое описание длительного приживления ГСК человека у плода овцы было опубликовано A.W. Flake et al. в 1986 г. [34]. Фетальные клетки печени человека были выбраны для первых экспериментов, так как печень плода не содержит никаких Т-лимфоцитов, которые могут приводить к развитию реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Клетки трансплантировали 65-дневным плодам овцы. В большой серии рожденных животных, изученной за 10 лет, приблизительно у 70% обнаруживались ГСК человека в периферической крови и костном мозге [35-38]. Количество человеческих клеток в среднем составляло около 5% и было представлено всеми линиями гемопоэза, включая Т-клетки. Человеческие клетки идентифицировались до 4-летнего возраста животного [35-38]. Для оценки самообновления костномозговых клеток от первичных животных ГСК трансплантировали вторичным доим-мунным плодам. Приблизительно у одной трети реципиентов были обнаружены человеческие клетки, что демонстрирует самообновление исходных прижившихся клеток [37, 38]. Более того, доля человеческих клеток в химерных овцах могла быть увеличена путем инъекции рекомбинантных человеческих цитокинов. Так, инъекция комбинации интерлейкина-3 (IL-3) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) человека или человеческого фактора стволовых клеток (SCF) увеличивала количество выявленных человеческих клеток в периферической крови или костном мозге овцы в пять и в два раза, соответственно [39, 40].

Фетальные клетки печени человека не используются как источник ГСК для клинической трансплантации. По этой причине E.D. Zanjani et al. (1990, 1993, 1995) определяли, могут ли клетки костного мозга взрослого человека или пуповинной крови, которые широко применяются в качестве источника ГСК в клинике, приживляться у плода овцы [41-43]. Приблизительно у 50% овец, которым трансплантировали человеческий костный мозг или клетки пуповинной крови, трансплантат прижился, обеспечив долю человеческих клеток такую же (костный мозг) или большую (пуповинная кровь), как и у реципиентов клеток фетальной печени человека [41-43]. К сожалению, у более 80% этих реципиентов развились признаки РТПХ, которые осложняли прослеживание долгосрочных результатов [41-44]. Трансплантация костного мозга или пуповинной крови с деплецией Т-клеток предотвращала РТПХ, но была ассоциирована с более низкими уровнем приживления и долей выживших животных [43, 44]. Также было показано, что совместная инъекция человеческих стромальных клеток костномозгового происхождения с человеческими CD34+-клетками костного мозга человека после деплеции Т-клеток улучшает долговременное приживление [45]. Эти результаты почти идентичны тем, которые наблюдаются при трансплантатациях костномозговых клеток в клинике, и подтверждают адекватность модели плодов овцы для анализа ГСК человека.

Исследовательская группа во главе с E.D. Zanjani в 1993 г., изучая ГСК человека, подняла фундаментальный вопрос относительно их фенотипа [36]. Большинство протоколов обогащения ГСК человека основаны на данных о том, что они экспрессируют CD34 антиген и характеризуются отсутствием маркеров зрелых миелоидных или лимфоидных клеток, таких, как Lin. Lin-/CD34+/HLA-DR--клетки костного мозга человека способны к долговременному приживлению в плодах овцы и продукции зрелого потомства всех линий в отличие от Lin-/CD34+/HLA-DR+ -клеток, которые не приживаются [44]. CD38 экспрессируется колоние-формирующими клетками, но, вероятно, не характерен для ГСК. Для подтверждения этой гипотезы Lin-/CD34+/CD38-- и Lin-/CD34+/CD38 + -костномозговые клетки трансплантировали плодам овцы. Длительное приживление наблюдалось у животных, получивших клетки первой популяции, в то время как после внутриутробного введения Un-/CD34+/CD38+-клеток наблюдалось транзиторное, кратковременное приживление [44]. В аналогичной работе было показано, что CD133 совместно с CD34 может быть использован как маркер ГСК [46]. Исследования на имму-нодефицитных мышах, которым инъецировали ГСК человека, свидетельствовал, что CD34--клетки также могут приживляться и генерировать зрелые человеческие ГСК [47]. Когда CD34+- и CD34--клетки костного мозга или периферической крови человека после обработки цитокинами вводили плодам овцы, обе популяции приживлялись и давали начало человеческим ГСК, подтверждая первоначальные наблюдения [48, 49].

Самообновление ГСК и поддержание примитивных клеток-предшественниц в овечьих химерах исследовались в других сериях экспериментов. В частности, плодам овцы трансплантировали Lm/CD34+-кпетки костного мозга человека, различающиеся по экспрессии Thy-1 [50, 51]. Интересно, что приживление наблюдалось только у животных, которые получили CD34+/Lin-/Thy-1 +-клетки, тогда как в случае Thy-l^-клеток приживления не было показано. После 3 мес. у овец, которые получили CD34+/Lin-/Thy-1 +-клетки, определялось количество примитивных CD34+-клеток, которые могли экспортировать краситель Родамин 123 (Rho10), а также численность CAFC (cobblestone area-forming cells). По количеству CAFC можно спрогнозировать число примитивных гемопоэтических клеток-предшествен-ниц со свойствами, соответствующими ГСК. Частота CAFC среди CD34+Rho1ow-клеток и в химерных овцах была сходна с частотой CAFC среди CD34+Rho1ow-клеток в оригинальном трансплантате [51]. Эти исследования продемонстрировали, что исходная популяция CD34+/Lin/Thy-1 ^клеток содержит примитивные ГСК, способные к приживлению и экспансии в организме овцы [50, 51].

В исследованиях на мышах высокий уровень экспрессии c-kit рецептора был характерен для ГСК [17, 18]. Человеческие CD34+-костномозговые

клетки, которые экспрессировали c-kit на высоком (c-kithigh) и низком (c-kitlow) уровнях или не экспрессировали вовсе (c-kit-), инъецировали плодам овцы. Незначительный уровень приживления определялся у животных, которые получили CD34+/c-ki^-кпетки [52]. Первоначально приживление наблюдалось на сходном уровне у животных, которым трансплантировали человеческие CD34+/c-kithigh- и CD34+/c-k/tl0w-кпетки. Однако после 3 мес. только в случае введения клеток с низким уровнем экспрессии c-kit в организме животных-реципиентов определялись клетки человека [42]. Эти данные позволяют утверждать, что примитивными человеческими клетками, ответственными за приживление и экспансию в организме плода овцы, были CD34+/c-k/tl0w-кпетки [52].

Плод овцы также использовался в качестве модели для исследования генетических заболеваний человека, таких как Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит (X-SCID), который характеризуется дефицитом Т-лимфоцитов и нефункциональными В-лимфоцитами, что в свою очередь приводит к отсутствию гуморального и цито-токсического иммунного ответа. X-SCID вызывается мутацией гена у-рецептора IL-2, который кодирует общую у-цепь (ус) рецепторов IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 и IL-15 [53]. Чтобы определить, может ли плод овцы служить удобоваримой моделью для исследования терапии X-SCID, цитокин-мобилизованные CD34+-клетки периферической крови от пациентов с X-SCID трансплантировались плодам овцы. Так же, как у X-SCID пациентов, человеческие ус-миелоидные клетки и В-клетки были найдены в овечьих химерах, но Т-лимфоциты отсутствовали. Трансдукция клеткам X-SCID пациентов ретровируса, содержащего ген у-рецептора IL-2, до трансплантации приводила к образованию овец-химер с большим количеством ус+-Т-лимфоцитов [54], что совпадало с результатами клинического исследования генной терапии X-SCID [55, 56]. Однако у 2 из 11 пациентов в клиническом исследовании впоследствии развилась Т-клеточная лейкемия [57], тогда как в эксперименте — у шести овечьих химер — не отмечалось побочных эффектов в течение 10 мес. наблюдения [54].

Мышиные модели

Несмотря на то, что плод овцы удовлетворяет всем критериям, необходимым для использования в качестве модели человеческого гемопоэза, она неприемлема для большинства исследовательских лабораторий. Расходы на содержание больших животных в комбинации с 100-кратным увеличением количества цитокинов, необходимых для выработки наибольшего количества человеческих клеток, определяют значительные экономические ограничения для использования этой модели. Кроме того, трансплантация человеческих клеток в плод овцы требует тонких и сложных хирургических навыков, которыми мало кто обладает. Многие научные группы работали над созданием животной модели человеческого гемопоэза, которая суммировала бы преимущества, демонстрируемые плодом овцы с экономической эффективностью небольшой животной модели. Эти усилия сфокусировались на мышах с генетически обусловленными иммунодефицитами [32, 33].

BNX мыши являются гомозиготными по трем мутациям, вызывающим иммунодефицит: мутация аллеля beige (bg, бежевыйЛ мутация аллеля nude (nu, лысый) и Х-сцепленный иммунодефицит (xid).

Мыши, гомозиготные по bg-мутации, имеют гипопигментацию кожи, и у них формируются гигантские внутриклеточные гранулы, приводящие к неправильной сортировке лизосомальных белков. Иммунная функция у этих мышей нарушена прежде всего из-за дефекта активности натуральных киллеров (NK-клетки). Эффекты bg-мутации сходны с таковыми при человеческом синдроме Чедиака-Хигаши (CHS). Были выделены гены, содержащие bg и CHS-мутации [58, 59]. Мышиные и человеческие гены высоко гомологичны, экспрессируются повсеместно и кодируют белок, который напоминает статмин — протеин, вовлеченный в полимеризацию микротрубочек [58, 59].

Мыши, гомозиготные по nu-мутации, являются лысыми и не имеют тимуса; последнее приводит к тяжелой супрессии иммунной системы [60]. Ген, который мутирован у nu-мышей и крыс, является членом winged helix или fork head семейств транскрипционных факторов [61, 62]. Мутация xid вызывает легкий иммунный дефект, ассоциированный с потерей некоторых функций В-клеток у гомозиготных самок или гемизиготных самцов мышей [63]. Мутация xid является точечной мутацией в гене ти-розинкиназы Брутона или Btk гене [64, 65].

Комбинация xid и nu мутаций вызывает иммунодефицит, который тяжелее, чем при каждой мутации в отдельности. Недостаточность NK-клеток, вызванная bg-мутацией, делает bg/bg, nu/nu, xid/— (известных как BNX) мышей почти полностью иммунодефи-цитными.

Оригинальное описание успешной трансплантации и поддержания примитивных человеческих гемопоэтических клеток в мышиной модели было сделано S. Kamel-Reid и J.E. Dick (1988), которые вводили человеческие костномозговые клетки сублетально облученным BNX мышам [66]. Мыши-реципиенты содержали низкие концентрации (<1%) человеческих клеток в костном мозге и селезенке, которые можно было определить за счет выявления человеческой повторяющейся ДНК в этих органах. Вдобавок, человеческие колоние-формирующие клетки из тех же тканей могли быть идентифицированы путем их избирательного роста в питательной среде с добавлением человеческих цитокинов IL-3 и GM-CSF. Так как эти цитокины не поддерживают рост мышиных колоние-формирующих клеток, была возможность простимулировать небольшое количество человеческих клеток-предшественниц в течение 8 нед. после трансплантации [66].

Основываясь на этом первоначальном успехе, другие исследовательские группы сфокусировались на проблеме увеличения низкого уровня человеческих клеток, приживающихся у BNX мышей. Так, J.A. Nolta et al. (1994) предположили, что мышиное микроокружение может быть «негостеприимным» для ГСК человека и выдвинули гипотезу, согласно которой одновременное введение с ГСК стромаль-ных клеток человека, обеспечивающих продукцию ИЛ-3 (видоспецифический цитокин, который важен для поддержания и дифференцировки ГСК человека), может привести к формированию оптимальных ниш для ГСК [67]. Ко-трансплантация ГСК и про-цессированной стромы костного мозга улучшила степень приживления человеческих клеток на 6%

[67]. Человеческие гемопоэтические клетки-предшественницы выделялись из селезенки и костного мозга мыши-реципиента до 9 мес. после трансплантации. Так как процессированные стромальные клетки не персистируют так долго, как гемопоэтические клетки-предшественницы, авторы заключили, что введение стромальных клеток облегчает приживление и пролиферацию ГСК человека [67]. В этом же исследовании авторы показали, что клетки, ответственные за долговременное приживление, экспрессировали CD34 [67].

У BNX мышей, перенесших трансплантацию костномозговых CD34+-клеток, отмечалась продукция человеческих Т-лимфоцитов, клеток-предшествен-ниц и зрелых клеток большинства миелоидных типов, однако отсутствовала продукция В-лимфоцитов[68].

Поскольку полный набор типов ГСК человека не может быть полностью выявлен у большинства BNX мышей, подвергшихся трансплантации, окончательный анализ ГСК человека провести невозможно. Однако потенциал дифференцировки в лимфоидные и миелоидные клетки — это свойство, ассоциированное с большинством примитивных гемопоэтических клеток-предшественниц. Для выяснения вопроса, способны ли любые клетки, которые приживались в организме BNX мыши, давать начало и лимфоидным, и миелоидным клеткам, человеческие CD34+-клетки пуповинной крови, трансфицированные ретровирусами с геном резистентности к неомицину (neo), трансплантировали облученным BNX мышам наряду с процессированными стромальными клетками. После трансплантации человеческие гемо-поэтические колонии, содержащие пео-провирус, выделяли из животных-реципиентов. Авторы также отделяли человеческие CD33+-миелоидные и CD3+-лимфоидные клетки от мышиных клеток путем FACS-сортинга и раздельно культивировали миелоидные и Т-лимфоцитарные колонии. ДНК выделяли из колоний, и наличие провируса подтверждали путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) [69]. Если ми-елоидные клетки-предшественницы и Т-лимфоциты, содержащие пео-провирус, происходили из одних клеток-предшественниц, то ген ретровируса должен был быть встроен в одно и то же место генома в каждом типе клеток. Место встраивания провируса устанавливали с помощью ПЦР, где длинная концевая последовательность провируса встраивалась в клеточную ДНК [70]. В ходе анализа полученных результатов было выявлено, что во всех клетках-предшественницах провирус имел одинаковую локализацию. Эти исследования представили первые и наиболее существенные доказательства наличия среди человеческих клеток, которые приживляются в BNX мышах, клеток, которые имеют свойства, ассоциированные с ГСК [69].

Несмотря на изначальный успех с BNX мышами, низкий уровень приживления человеческих клеток привел к тому, что многие группы исследовали перешли к использованию SCID мышей в качестве реципиентов человеческих клеток. Мутация scid — это делеция гена ДНК-зависимой протеинкиназы (ДНК-ПК) [71]. Мыши, гомозиготные по мутации scid, не имеют функциональных В- и Т-лимфоцитов из-за дефектов V(D)J рекомбинации и восстановления двуспиральных разрывов, делающих SCID мышей дефицитными и в клеточных, и в гуморальных иммунных функциях. T. Lapidot et al. (1992) продемонстрировали, что приживление человеческих клеток, введенных CB.17 SCID мыши, было выше по сравнению с приживлением, наблюдаемым у BNX реципиентов. Также улучшение приживления и пролиферации человеческих клеток может быть получено у SCID мышей, которым вводили человеческие SCF и PIXY 321 — молекулы слияния (fusion molecule). Человеческие клетки персистировали в костном мозге мыши 8-10 нед., т.е. время, в течение которого животные обычно выводились из эксперимента [72].

Несмотря на то, что гомозиготные scid/scid мыши имеют дефицит гуморальных и клеточных иммунных функций, NK-клетки у них функционируют нормально. Благодаря тщательной работе L. Shultz et al. (1995) было выяснено, что линия мышей с диабетом без ожирения (nonobese diabetes, NOD) является NK-дефицитной [73]. Мутация scid была перенесена на NOD основу путем повторного обратного скрещивания. Получившаяся в результате линия, обозначенная как NOD-SCID, является «более иммунодефицитной», чем любые другие линии, несущие scid мутацию, из-за дефицита NK-клеточной активности [73]. Показано, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) мышей NOD-SCID в лучшей степени поддерживают приживление ГСК человека, нежели ММСК мышей других иммунодефицитных линий [74]. По сравнению с CB.17 SCID или другими SCID линиями, уровень приживления ГСК человека у NOD-SCID мышей составлял в среднем 10—30% в зависимости от количества и источника введенных клеток [75-77]. Приблизительно 30% гомозиготных NOD-SCID мышей склонны к развитию тимом, которые, как было показано, являются результатом эндогенного внедрения ретровируса Emv-30 [78]. Осторожное обратное скрещивание привело к развитию дополнительной линии NOD-SCID мышей, у которых частота тимом была значительно снижена [79]. Остаточная иммунная функция у NOD-SCID мышей далее компрометирована путем обратного скрещивания аллеля с выпадением Р2-микроглобулина и NOD-SCID фона. NOD-SCID Р2-0 мыши поддерживают наибольший уровень трансплантированных человеческих клеток [79].

Человеческие клетки, выявляющиеся у NOD-SCID мышей после трансплантации, относились, прежде всего, к В-клеточной линии (CD19 + ) с небольшим количеством миелоидных клеток (CD14+ и CD11b + ). Иногда небольшое количество человеческих Т-лимфоцитов может быть идентифицировано в рудиментарном тимусе NOD-SCID мышей. Однако зрелые эритроидные клетки и эритроидные клетки-предшественницы не могут быть достоверно определены у NOD-SCID мышей, подвергнутых трансплантации нормальных костномозговых CD34+-клеток [80].

Как и с BNX мышами, неспособность поддерживать все гемопоэтические линии осложняет анализ активности человеческих ГСК у NOD-SCID мышей. В этой связи, клетки, которые восстанавливают лимфоцитарную популяцию у SCID мышей, обычно описываются как SCID-репопулирующие клетки (SRC) [5, 80]. Аналогично человеческим ГСК, SRC входят в состав Lin-/CD34+-популяции клеток пуповинной крови человека, костного мозга и мобилизованной периферической крови. Также многие авторы обнаружили, что Lin-/CD34+/CD38--субпопуляция клеток содержит большое количество SRC [81-83]. Недавно было показано, что ГСК человека у NOD-SCID мышей происходят из двух популяций CD34+-клеток. «Первая волна» клеток происходит из коротко живущих предшественников; «вторая волна», которая перекрывает первую, происходит из долго живущих клеток-предшественниц [84].Эти данные позволили авторам предположить, что первая и вторая волны человеческих ГСК могут отражать потомство CD34+/ CD38+- и CD34+/CD38--клеток, соответственно.

Также у NOD-SCID мышей были обнаружены признаки наличия человеческих примитивных гемопо-этических клеток-предшественниц, которые не экспрессировали CD34. Данный феномен был описан, когда NOD-SCID мышам вводились CD34--клетки. Человеческие гемопоэтические клетки-предшественницы и зрелые клетки образовывались в количествах, которые могли конкурировать с таковыми, образующимися при трансплантации CD34+-клеток [47]. Многие из клеток у NOD-SCID реципиентов, перенесших трансплантацию CD34--клетками, экспрессировали CD34, тем самым указывая на то, что CD34--клетки могут давать начало CD34+-клеткам у NOD-SCID и BNX мышей [47, 85].

Аналогично BNX мышам, клональный человеческий гемопоэз показан у NOD-SCID реципиентов человеческих клеток с вирусной трансфекцией. N.C. Josephson et al. (2002) исследовали множественные клоны CD19+-В-лимфоцитов и экспонированные популяции отдельных миелоидных клеток, полученных у NOD-SCID мышей, которым трансплантировали клетки, трансфицированные foamy-вирусом [86]. В отличие от BNX мышей, где все включения в лимфоидные клеточные линии имели партнеров среди миелоидных клеток, у NOD-SCID мышей менее 20% провирусных включений имели партнеров в В-лимфоцитарных клонах и миелоидных клетках [87]. Таким образом, эти данные подтвердили, что человеческие клетки, присутствующие у NOD-SCID мышей через 6-10 нед. после трансплантации, происходят из различных популяций коротко живущих и долго живущих SRC.

NOD-SCID мыши используются как модели для изучения человеческих гемопоэтических заболеваний. Серии исследований показали, что костномозговые клетки пациентов с лимфоидными и миелоидными лейкемиями, трансплантированные SCID мышам,участвуют в развитии лейкемий [86-91]. Также имеется несколько примеров использования NOD-SCID мышей как модели для изучения наследственных человеческих гемопоэтических заболеваний. Так, костный мозг пациентов с р-талассемией имеет явную эритроидную гиперплазию, вызванную неэффективной продукцией красных клеток. Когда NOD-SCID мышам трансплантировались костномозговые CD34+-клетки, полученные от пациентов с р-талассемией, эритроидная гиперплазия являлась достаточной для преодоления обычно неэффективной продукции эритроидных клеток у жи-вотного-реципиента [75]. NOD-SCID-P2-0 мыши, получившие инъекцию CD34+-клеток от пациента с Х-сцепленной хронической гранулематозной болезнью (gp91phox-недостаточность), продуцировали человеческие нейтрофилы с дефектом оксидазной активности. Трансплантация X-CDG CD34+-клеток с трансдукцией лентивируса, содержащего gp91phox ген, восстанавливала оксидазную активность человеческих нейтрофилов [92]. Таким образом, NOD-SCID мыши могут служить моделью для разработки средств лечения человеческих гемопоэтических заболеваний.

Гуманизированные SCID мыши

Для оптимизации гемопоэтического микроокружения человеческих клеток у иммунодефицитных мышей была выведена линия гуманизированных SCID-hu мышей. Изначально фрагменты человеческого плодного тимуса были имплантированы под почечную капсулу SCID мыши с последующей инъекцией CD34+-клеток человека. Результатом была продукция циркулирующих человеческих Т-лимфоцитов и миелоидных клеток в относительно короткий период [93]. SCID-hu Thy/Liv модель представляет усовершенствование этой системы, в которой и человеческий плодный тимус, и печень плода трансплантируются под капсулу почки SCID мыши. У большинства этих животных человеческие клетки и Т-клетки лимфоцитарной и миелоидной линий определяются в периферической крови животных в период от 6 до 12 мес. [94]. Исследование трансплантированных органов выявило наличие в них человеческих гемопоэтических гранулоцитарно-ма-крофагальных колониеформирующих клеток (CFU-GM) и примитивных человеческих эритроидных бур-стформирующих единиц (BFU-E) [94]. Кроме того, эти животные содержали полный набор дифференцированных человеческих Т-лимфоцитов, включая CD3+/CD4+ CD8 + , CD3+/CD4- CD8 + и CD3+/CD4+/

CD8--клетки [95]. Обычно человеческие Т-клетки у иммунодефицитной мыши вызывают тяжелую летальную РТПХ [96]. Однако трансплантаты человеческого тимуса у SCID-hu Thy/Liv мыши, как было показано, содержали мышиные дендритные клетки, что объясняет и толерантность, и долговременную продукцию человеческих Т-лимфоцитов без РТПХ [97].

Окончательным усовершенствованием SCID-hu линии является SCID-hu костная модель. В этой модели фрагменты фетальных костей человека трансплантируются подкожно SCID мыши. Костные фрагменты васкуляризируются в течение 4—6 нед., обеспечивая «человеческое» гемопоэтиче-ское микроокружение, в котором небольшое количество человеческих миелоидных предшественников и В-клеток могут поддерживаться в течение 12 нед. и более [98]. SCID мыши с фрагментами фетальных костей, тимуса и селезенки (BTS) человека известны как SCID-hu BTS мыши. SCID-hu BTS мыши могут поддерживать ГСК человека всех линий в течение 36 нед. и более [99]. Более того, костные фрагменты могут вводиться прямо с очищенными гемопоэти-ческими клетками, что в последующем может повлиять на их способность к восстановлению популяции и пролиферации. SCID-hu BTS модель используется для определения фенотипа большинства примитивных человеческих ГСК. CD34+/Lin-/Thy-1+-клетки, введенные в человеческий костный фрагмент у SCID-hu BTS мыши, были обогащены клетками, которые генерируют гемопоэтические клетки-предшественницы и зрелые клетки [99, 100].

Заключение

Развитие животных моделей, в которых ГСК человека могут приживляться и пролиферировать, имело фундаментальное значение в изучении гемо-поэза человека. Относительные достоинства каждой из моделей, описанных выше, представлены в таблице. Общим для всех указанных моделей является то, что наивысший уровень приживления получен с клетками пуповинной крови, далее с костномозговыми клетками и, наконец, с мобилизованными клетками периферической крови [41-43, 101-104]. Однако, несмотря на прогресс, достигнутый за годы исследований, причина относительно низкого уровня человеческих клеток, генерируемых в этих моделях, до сих пор не ясна. Но, оценивая прогресс за последние 5 лет, можно сделать вывод, что эта проблема будет решена за счет средств генной инженерии.

Подняться вверх сайта