Поиск Кабинет

Мезенхимные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма

Гены & Клетки: Том I, №3, 2006 год, стр.: 36-41

 

Авторы

Кругляков П.В., Лохматова Е.А., Климович В.Б., Зарицкий А.Ю.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Мезенхимные стволовые клетки (МСК) - плюрипотентные стволовые клетки взрослого организма все чаще и чаще находят применение в клинических исследованиях. Их применение в травматологии, кардиологии, неврогии обусловлено их дифференцировочным потенциалом. Однако все большее количество исследователей считает что терапевтический эффект трансплантации МСК, доказанный во многих доклинических и клинических исследованиях, определяется не только дифференцировкой, но регуляторной функцией этих клеток. Применение МСК при иммунопатологических состояниях - возможность выяснить их регуляторные свойства, их способность влиять на иммунные процессы организма. На сегодняшний день накоплен опыт применения МСК как на различных экспериментальных моделях, так и в клинике. Анализ существующих данных позволяет нам рассуждать о влиянии МСК на отдельные компоненты иммунной системы позвоночных.

Введение

Исследование биологии стволовых клеток взрослого организма является актуальной задачей современной экспериментальной медицины и клеточной биологии. Все более широкое применение находят различные стволовые клетки в эксперименте и клинике. Один из типов стволовых клеток взрослого организма - мезенхимные стволовые клетки [МСК], открыты еще в 70-х годах прошлого века, но только сейчас их начали использовать в экспериментальной медицине и клинике [1 ]. МСК применяют в кардиологии, неврологии, травматологии. В данном обзоре мы остановились на таком свойстве МСК как регуляция иммунного ответа.

МСК представляют собой популяцию плюрипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться в направлении ряда соматических клеточных линий. МСК могут являться предшественниками остеобластов, хондроцитов, ади-поцитов [2, 3], а также эндотелиальных клеток, скелетных ми-оцитов [4], клеток нервной ткани [5] и кардиомиоцитов [6, 7].

Фенотипически МСК идентифицируют по отсутствию маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, таких как CD34-, CD45-, glycophorinA-, CD14-; HLA-DR, антигенов CD80 and CD86, и по наличию следующих сигнальных молекул: CD105 (endoglin), CD129, CD166, CD90[Thy1], CD44 [hyaluronate receptor], CD29, CD13, CD106 [VCAM-1], ICAM-2, LFA-3 [8, 9]. В малом количестве МСК представлены [1:104-105 мононуклеарных клеток] в костном мозге [8], где они участвуют в формировании стромы, необходимой для поддержания гомеостаза и функционирования собственных и трансплантированных гемопоэтических клеток [10, 11].

МСК способствуют росту гемопоэтических предшественников путем секреции ряда цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-14, ИЛ-15, фактор LIF [leukemia-inhibitory factor], макрофагальный колониестимулирующий фактор [М-КСФ], гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор [ГМ-КСФ], фактор роста стволовой клетки [8, 9]. МСК также могут способствовать миграции гемопоэтических стволовых клеток [ГСК], введенных путем внутривенной инфузии в костный мозг, экспрессируя хоуминг-рецепторы и хемокины, например, SDF-1 [stromal-derived factor-1 ] [9].

Миграция трансплантированных МСК в костный мозг также может происходить по градиенту концентрации SDF-1 за счет экспрессии CXCR4. Тот же механизм взаимодействия SDF-1 и CXCR4, а также HGF и c-met, предложен для объяснения хоуминг-эффекта МСК в отношении поврежденных тканей [12, 13].

Плюрипотентность МСК, специфическая миграция в область повреждения и адгезионные свойства - все это обуславливает восстановительную функцию МСК. МСК способны мигрировать к месту повреждения, закрепляться, дифференцироваться и осуществлять функцию замещенных клеток.

Именно эти свойства МСК дают возможность использовать для репарации и регенерации тканей, например, миокарда, нервной ткани, костей, сухожилий, хрящей [14-16].

Ксеногенная и аллогенная трансплантация МСК

При моделировании экспериментального инфаркта миокарда у йоркширских свиней была продемонстрирована следующая особенность МСК: трансплантированные клетки не вызывали иммунного ответа при интрамиокардиаль-ном введении. МСК были трансплантированы взрослым иммунокомпетентным животным без проведения иммуно-супрессивной терапии. При последующем анализе, меченые клетки были локализованы в периинфарктной зоне. Исследователи не выявили реакции отторжения [17-19].

Пренатальное или постнатальное введение аллогенных МСК при развитии несовершенного остеогенеза у человека не только не сопровождалось отторжением введенных клеток, но и приводило к существенному улучшению течения данного заболевания у детей [20-23]. Не отторгались аллогенные МСК и у детей с врожденными метаболическими нарушениями [24]. Кроме того, приживление аллогенных МСК в костном мозге было выявлено у больного апластической анемией [25].

Сниженные иммунореактивные свойства МСК были показаны на модели ксеногенной трансплантации. Костномозговые стромальные клетки, выделенные от мышей, вводились иммунокомпетентным крысам. Иммуносупрессивную терапию в данной серии экспериментов не проводили. Меченые клетки мыши обнаруживались в кавернах костного мозга крыс-реципиентов, по меньшей мере в течение 13 недель после трансплантации [26].

Схожие результаты были получены при использовании другой модели ксенотрансплантации, где МСК человека вводились в брюшную полость плода овцы на 85-й день гестации. Известно, что плод овцы до 75-го дня гестации обладает несовершенной иммунной системой. После этого периода он способен отторгать алло/ ксеногенный клеточный материал [27]. Введенные ксеногенные МСК были способны персисти-ровать в различных тканях плода в течение всего времени исследования [тринадцати месяцев) и дифференцироваться в специфичные для различных тканей клеточные типы, не вызывая при этом иммунного ответа со стороны реципиента [28].

Иммунофенотип МСК отличается следующими особенностями: отсутствием костимулирующих молекул B7-1, B7-2, CD40, Сй40-1_, относительно низким уровнем экспрессии MHC I класса и отсутствием экспрессии MHC II класса. Этот феномен объясняет приживаемость МСК в аллогенном и ксеногенном организме без развития реакции «хозяин против трансплантата».

Экспрессия MHC II класса на поверхности МСК может быть индуцирована воздействием интерферона g [INFg) [29, 30]. Продукция INFg сопровождает течение всех воспалительных процессов, в том числе и при реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ). Однако, несмотря на экспрессию МНС II класса, аллогенные МСК не вызывают дополнительной активации цитотоксических лимфоцитов и неспособны вызывать Т-клеточный ответ [31, 32].

Более того, существуют факты, подтверждающие участие МСК в регуляции негативной селекции тимоцитов. Исследователям удалось доказать, что при трансплантации костного мозга МСК дифференцируются в эпителиальные клетки тимуса, которые определяют селекцию Т-клеток. [33]. Таким образом, можно предположить, что МСК способствуют развитию у реципиента иммунологической толерантности к клеткам донора.

Иммунорегуляторные свойства МСК

В многоцентровом клиническом исследовании было показано, что котрансплантация гемопоэтических клеток и МСК существенно [до 15%) снижала вероятность возникновения РТПХ при аллогенной трансплантации у больных с лейкозами [контрольной группе это показатель составил 40%). Кроме того, повышалась средняя выживаемость пациентов с сочетанной трансплантацией ГСК и МСК [34].

Заслуживает отдельного анализа опыт лечения 9-летнего мальчика больным острым лимфобластным лейкозом после аллогенной гаплоидентичной трансплантации ГСК. Развившаяся РТПХ 4-й степени с поражением печени и кишечника была резистентна ко всем современным методам иммуносупрессивной терапии, т.е. была практически несовместима с жизнью. Введение МСК от гаплоидентичного донора стволовых клеток сопровождалось быстрой регрессией проявлений РТПХ и нормализацией лабораторных показателей. По данным колоноскопии не было обнаружено значимых патологических изменений слизистой оболочки кишки. По данным биопсии стенки кишки была выявлена легкая РТПХ, а 4% эпителиальных клеток в образце обладали женским генотипом. Следует заметить, что МСК вводились на фоне продолжающейся терапии циклоспорином [35]. Трудно предположить, что введение МСК сыграло свою позитивную роль только в регенерации пораженных органов. Следует отметить, что через полтора года после трансплантации у больного вновь развилась РТПХ. Следовательно, мы не можем утверждать, что введение МСК приводит к полной анергии донорского материала. Повторное введение МСК позволило вновь прервать РТПХ [36].

Также описана 20-летняя пациентка с острым миелоб-ластным лейкозом, которой были трансплантированы периферические CD34+ гемопоэтические клетки ее отца, не подходящего по HLA-гаплотипу, и одновременно были введены МСК того же донора. У пациентки не было проявлений ни острой, ни хронической РТПХ. Через 31 месяц после трансплантации у нее наблюдался стойкий полный гематологический ответ без явного рецидива заболевания [37].

Идея использовать МСК как инструмент регуляции иммунного ответа и тем самым уменьшать проявления РТПХ лежит в основе мультицентровых клинических испытаний, в которых пациенты с онкогематологическими заболеваниями получали донорские МСК одновременно с инфузией ГСК в качестве профилактики РТПХ. По полученным данным, общий процент острой и хронической РТПХ был явно ниже среди пациентов, которым были введены МСК, в сравнении с контрольной группой [38].

Итак, МСК не отторгаются при алло- и ксенотранспланта-ции. При введении реципиенту МСК не вызывают иммунного ответа, не лизируются цитотоксическими Т-лимфоцитами и натуральными киллерами. Иными словами, МСК в организме реципиента становятся «невидимыми» для Т-лимфоцитов [28, 29, 39].

Результаты, полученные в условиях in vivo, подтвердились в экспериментах in vitro. Они свидетельствуют о том, что МСК проявляют слабые иммуногенные свойства и вызывают супрессию аллогенных и аутогенных Т-клеток [29, 40-44]. При этом выяснилось, что МСК от аллогенного или ксеногенно-го донора обладают большей супрессирующей активностью, чем аутологичные клетки [45].

Влияние МСК на иммунную систему реципиента может происходить на нескольких уровнях развития реакции отторжения. Во-первых, как упоминалось выше, МСК способны влиять на Т-клетки, во-вторых, МСК способны взаимодействовать с антигенпрезентирующими клетками, в-третьих, МСК воздействуют на популяцию натуральных киллеров [рис. 1).

МСК и Т-клетки

Феномен взаимодействия МСК и аллогенных Т-клеток к настоящему моменту подтвержден многочисленными исследованиями. Известно, что в присутствии аллогенных МСК не происходит активации Т-клеток, а также снижается уровень пролиферации активированных Т-клеток [29, 40-49]. К настоящему моменту известен внутриклеточный механизм такого влияния МСК. Остановка пролиферации активированных Т-клеток в присутствии МСК происходит в ранней G1 фазе клеточного цикла и опосредована снижением экспрессии циклина D2 [50]. Более того, после взаимодействия с МСК в Т-клетках наблюдается усиление экспрессии другого ингибитора клеточного цикла - белка p27 Kip1, который приводит к остановке клеточного цикла как в контрольной точке G1/S, так и в G2/M [50, 51]. Роль непосредственного контакта между Т-клетками и МСК до конца не ясна. Имеется единственное сообщение, указывающее на то, что межмембранное взаимодействие МСК и Т-клеток приводит к остановке пролиферации последних. Исследователи обнаружили, что при сокультивировании МСК с Т-клетками уровень пролиферации активированных Т-клеток снижался, а на поверхности МСК активно экспрессировался мембранный белок PD1 [programmed death 1). При добавлении в смешанную культуру антител к PD1 уровень пролиферации Т-клеток возрастал на 50% [52].

Модулирующий эффект МСК на пролиферацию и активацию Т-клеток наблюдается не только в смешанных культурах клеток, но и при использовании полупроницаемой мембраны. В связи с этим внимание исследователей было направлено на продукты секреции МСК. В роли медиаторов, супрессирующих Т-клетки, выступают TGF-b [transforming growth factor-b) и HGF (hepatocyte growth factor). При добавлении в культуру активированных Т-клеток TGF-b и HGF или МСК уровень пролиферации Т-клеток существенно снижался. Одновременное добавление антител против TGF-b и HGF в обе экспериментальные системы приводило к восстановлению пролиферативной активности Т-клеток до исходного уровня [8, 29].

Кроме того, постоянным продуктом секреции МСК является простагландин E2 (PGE2). Ингибиторы продукции PGE2 также способны in vitro ограничивать МСК-опосредо-ванную иммуносупрессию. Получены данные, что в присутствии ингибиторов PGE2 уровень пролиферации лимфоцитов возрастал на 70%, что было сопоставимо с результатами, полученными в отсутствии МСК. Кроме того, в присутствии ингибиторов PGE2 увеличивается уровень секреции фактора некроза опухоли a (TNFa) и IFNy активированными дендритными клетками (ДК) и Т-лимфоцитами [53].

Другой путь ограничинения Т-клеточного ответа реализуется на этапе ИЛ-2-зависимой активации. Рецепторы к интерлейкину 2 (ИЛ-213а) экспрессируются на периферических лимфоцитах непостоянно. Уровень экспрессии их повышается после антигенной стимуляции клеток. В присутствии МСК на поверхности периферических лимфоцитов экспрессия ИЛ-213а уменьшается, что препятствует их активации [54].

Существуют факты, свидетельствующие о том, что суп-рессирующий эффект МСК может быть связан и с индукцией апоптоза активированных Т-клеток [55]. Индуктором апоптоза может служить индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО) - один из основных ферментов метаболизма аминокислоты триптофана. Отсутствие триптофана вызывает апоптоз Т-клеток [56]. Показано, что МСК экспрессируют ИДО в ответ на стимуляцию клеток IFNy Действительно, после активации антигенами Т-лимфоциты продуцируют IFNg. Этот факт может объяснить отсутствие апоптоза в смешанной культуре МСК и нестимулированных Т-клеток [55].

Существует предположение, что МСК могут участвовать в регуляции дифференцировки Т-клеток, преимущественно в направлении CD4+CD25+ [T-регуляторов], и тем самым принимать опосредованное участие в регуляции других популяций лимфоцитов [рис. 2]. В результате стимуляции ростка Т-регуляторов происходит супрессия пролиферации эффекторных клеток [цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров], а также, ограничение дифференцировки ДК [56].

МСК и натуральные киллеры (NK)

Влияние МСК на популяцию неактивированных NK-клеток схоже с воздействием на Т-клетки. Присутствие МСК ингибирует пролиферацию NK-клеток. Добавление в смешанную культуру МСК и NK-клеток интерлейкина 2 [ИЛ-2] или интерлейкина 1 5 [ИЛ-1 5] - стимуляторов деления и активации NK-клеток, не приводит к изменению пролиферативного и цитотоксического статуса последних [57, 58]. Механизм такого влияния МСК, вероятно, как и в случае с Т-клетками, связан с продукцией PGE2 и TGFp. PGE2 суп-рессирует цитотоксичность NK-клеток и продукцию провос-палительных цитокинов, опосредованную ИЛ-2 и ИЛ-1 5 [59, 60]. Добавление в смешанную культуру МСК и NK-клеток ингибитора PGE2 приводит к частичному восстановлению уровня пролиферации NK-клеток [58]. Схожие изменения происходят и при добавлении в смешанную культуру антител к TGFp [58, 61].

Однако при добавлении МСК к культуре активированных NK-клеток супрессия не наблюдается. Более того, NK-клетки лизируют аллогенные МСК. Такое влияние активированных NK-клеток на МСК может быть объяснено следующим образом. Известно, что активированные NK-клетки продуцируют IFNg. Как упоминалось выше, IFNg вызывает экспрессию молекул МНС II класса на поверхности МСК, а также экспрессию некоторых других молекул, способных взаимодействовать с активированными рецепторами NK-клеток [CD 112, CD1 55, CD226] [29, 30, 59]. В результате межклеточного взаимодействия МСК лизируются, причем лизироваться могут и аутогенные клетки [63]. Т аким образом, несмотря на общее супрессирующее воздействие на иммунную систему, МСК, вероятно, не участвуют в ограничении реакций организма против опухолевых клеточных элементов.

МСК и антигенпрезентирующие клетки (АПК)

Влияние МСК на АПК изучено к настоящему моменту недостаточно. Показано, что взаимодействие МСК и АПК блокирует созревание АПК и смещает их дифференциров-ку в направлении регуляторных АПК [64]. При этом, несмотря на экспрессию интерлейкина-1 р [ИЛ-1 р] и костимулятор-ной молекулы CD86, в АПК снижается уровень экспрессии провоспалительных факторов ИЛ-12, TNFa и возрастает экспрессия противовоспалительного цитокина ИЛ-10 [65]. Гипотетически, медиатором этих изменений АПК может служить упомянутый выше фактор TGFp, секретируемый МСК [53].

Г ипотеза о том, что МСК оказывают иммуномодулирующий эффект через индукцию регуляторных АПК, позволяет связать следующие лабораторные и клинические данные. С одной стороны, регуляторные АПК в эксперименте способны защищать мышей от острой РТПХ [66]. С другой стороны, МСК человека были успешно использованы у пациентов с лейкемией для лечения острой РТПХ в результате пересадки костного мозга [35].

РТПХ включает в себя ряд патофизиологических механизмов, приводящих к повреждению тканей организма-реципиента: увеличение секреции провоспалительных цито-кинов [TNFa, IFNg, ИЛ-1, ИЛ-2, Ил-12], активацию ДК и макрофагов, NK-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Ингибирование провоспалительных цитокинов ведет к уменьшению тяжести и риска возникновения РТПХ [53].

В результате взаимодействия МСК с клетками иммунной системы меняется профиль цитокиновой секреции. Под воздействием МСК уменьшается секреция TNFa дендритными клетками 1 типа, и увеличивается уровень секреции ИЛ-10 дендритными клетками 2 типа; также уменьшается секреция IFNg T-клетками и натуральными киллерами, и увеличивается уровень секреции ИЛ-4 [53].

МСК и В-клетки

Кроме взаимодействия с Т-лимфоцитами и NK-клетками и АПК, МСК влияют на В-клеточный иммунный ответ, ограничивая пролиферацию, дифференцировку и хемотаксис В-лимфоцитов. Возможные механизмы могут быть связаны с ограничением экспрессии В-клетками хемокиновых рецепторов [CXCR4, CXCR5, CCR7]. CXCR4 вовлечен в ранний В-клеточный лимфопоэз, а также способствует адгезии В-клеток к эндотелию венул лимфатических узлов. CXCR5 привлекает антиген-активированные В-клетки в герминативные центры и способствует проникновению В-лимфоцитов в пейеровы бляшки. CCR7 совместно с CXCR4 способствует адгезии В-клеток к эндотелию венул лимфатических узлов и движению В-клеток памяти во вторичные лимфоидные органы [67].

Таким образом, МСК оказывают общее супрессирующее воздействие на иммунную систему реципиента [см. рис. 1 ]. Эффективность системного применения аллогеных и ксено-генных МСК продемонстрирована на иммунокомпетентных животных и в единичных клинических случаях. Ex v/vo-подготовленные клетки могут быть использованы в клинических ситуациях, когда существует риск недостаточного приживления трансплантата [неподходящие по HLA родственные доноры, подходящие неродственные доноры], для предотвращения или уменьшения тяжести РТПХ, для облегчения приживления и стимуляции пролиферации гемопоэтических предшественников. На настоящий момент механизм выявленного супрессиру-ющего эффекта до конца не ясен. Вероятно, он реализуется комплексно через паракринные свойства МСК и прямое взаимодействие МСК с клетками иммунной системы реципиента. Важно отметить, что МСК не препятствуют столь важному компоненту аллогенной трансплантации как реакция донорских клеток против опухоли [68].

Перспективы применения МСК

Феномен супрессии иммунной системы реципиента может найти применение не только при аллогенной трансплантации костного мозга, но и при аутоиммунных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и рассеянный склероз. Схожие механизмы течения этих патологий и РТПХ позволяют предположить, что трансплантация аллогенных или ксеногенных МСК может позволить снизить динамику развития заболевания.

Для сравнения иммуномодулирующего действия МСК и ГСК перед трансплантацией из образца костного мозга удалили все клеточные элементы, способные к адгезии. В этом случае смертность лабораторных животных в течение 90 дней после трансплантации составила 75%, тогда как использование сочетания обедненного костного мозга и популяции клеток, способных к адгезии, позволяло мышам выживать, по меньшей мере, в течение 48 недель и оказывало лечебный эффект на аутоиммунные заболевания. У мышей данной группы, в отличие от животных с трансплантацией только ГСК, иммуногистохимическое исследование показало отсутствие лимфаденопатии и таких проявлений аутоиммунных заболеваний, как пролиферация мезангия почечных клубочков с отложением депозитов IgG и лимфоцитарная инфильтрация тканей суставов с формированием паннуса. Серологическое исследование показало нормальный уровень циркулирующих иммунных комплексов и ревматоидного фактора в сыворотке крови [69].

Аутоиммунным заболеванием, патогенез которого связан с Т-клеточным звеном иммунитета, является рассеянный склероз (РС). Считается, что моделью РС у мышей является аутоиммунный энцефаломиелит, вызванный энцефалогенным пептидом MOG35-55 (myelin oligodendrocyte glycoprotein). При введении мышам MOG35-55 у животных развивается типичная неврологическая симптоматика, характерная для РС. При гистологическом исследовании наблюдаются пери-васкулярные воспалительные инфильтраты в субарахнои-дальном пространстве, очаги демиелинизации в спинном и головном мозге, а также клеточные инфильтраты, представленные Т-лимфоцитами и макрофагами в паренхиме ЦНС. Эффективность применения МСК у мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом продемонстрирована в одной из экспериментальных работ [70]. В этом исследовании было продемонстрировано, что внутривенное введение МСК в остром периоде заболевания уменьшало тяжесть неврологических проявлений. Гистологическая оценка выявила что клинический эффект сопровождался уменьшением очагов демиели-низации и воспалительных инфильтратов в нервной ткани. Анализ локализации донорских МСК показал их миграцию преимущественно в селезенку и лимфатические узлы. В то же время, использование МСК в периоде хронизации заболевания не привело к явным клиническим и гистологическим изменениям. Так как применение МСК в ранней воспалительной фазе оказывало явный тормозящий эффект на развитие заболевания, авторы предположили, что лечебное действие МСК могло быть опосредовано их взаимодействием с популяцией эффекторных Т-лимфоцитов [70, 71].

МСК могут оказывать лечебное воздействие и на последствия аутоиммунных заболеваний. На мышиной модели острой аутоиммунной кардиомиопатии было показано, что трансплантация МСК в миокард животных, перенесших патологию, приводит к снижению развития дилатации сердца, тормозит развитие фиброза миокарда и приводит к сохранению функциональных параметров сердца [72].

Итак, в настоящее время широко обсуждается вопрос о клиническом использовании МСК в гематологии, при аутоиммунных заболеваниях и при трансплантации органов, основанный на способности данных клеток подавлять иммунореактивность [39, 71, 73]. При анализе данных о позитивной роли МСК в купировании иммунопатологических процессов возникает вопрос, почему собственные МСК организма не способны с ними справиться. Объяснений может быть несколько: неспособность аутогенных МСК рециркулировать в очаг иммунопатологического процесса; неспособность аутогенных МСК подавлять аутоиммунные процессы; нарушение свойств аутологичных МСК при данных заболеваниях. В настоящее время подтверждено последнее предположение. Было обнаружено, что у больных с диагнозом «апластическая анемия» МСК не способны подавлять пролиферацию и секрецию цитокинов Т-клетками, что имеет ключевое значение в патогенезе данного заболевания [74]. Следует заметить, что механизмы влияния донорских МСК на клетки иммунной системы реципиента, а также взаимодействия донорских МСК и МСК реципиента в настоящее время недостаточно понятны и требуют дальнейшего изучения, так же, как и оценка возможного риска (онкологические заболевания, вирусные инфекции) при использовании МСК в терапевтической практике.

Подняться вверх сайта