Поиск Кабинет

Мембранные микровезикулы: биологические свойства и участие в патогенезе заболеваний

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 6-11

 

Авторы

Гомзикова М.О., Гайфуллина Р.Ф., Мустафин И.Г., Чернов В.М., Мифтахова З.Р., Галявич А.С., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Микровезикулы (МВ) – мембранные везикулы, которые высвобождаются от поверхности клеток в норме, а также при стимуляции или гибели клеток (тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов, эндотелиальных клеток, трансформированных клеток и др.). Долгое время полагали, что МВ не играют существенной роли и представляют собой инертный «мусор», высвобождаемый клетками в процессе жизнедеятельности, однако накапливающиеся данные свидетельствуют о важной роли МВ в различных физиологических и патологических процессах. На сегодняшний день в базах данных PUBMED, OMIM и GENE, накоплено большое количество публикаций посвященных исследованию способности МВ переносить различные биологически активные вещества (липиды, белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), применению МВ в качестве диагностических маркеров и влиянию на развитие различных заболеваний.

Высвобождение мембранных везикул характерно для бактерий, архей, растений и животных, в том числе человека. Впервые микрочастицы, циркулирующие в крови человека, описал и установил их тромбоцитарное происхождение P. Wolf в 1967 г.[1]. Впоследствии было установлено, что образование микрочастиц характерно для многих типов клеток, в том числе для лейкоцитов, эритроцитов, лейомиоцитов, эндотелиальных, стволовых, а также опухолевых клеток. Микровезикулы обнаружены в различных биологических жидкостях человека (кровь, лимфа, слюна, пот, моча)[2, 3].

В литературе под термином микрочастицы понимают непосредственно микрочастицы (микровезикулы или эктосомы), а также подобные им клеточные образования – экзосомы и апоптозные тельца, которые, однако, имеют иной механизм образования, отличаются содержимым и выполняемыми функциями, поэтому в обзоре мы будем использовать синоним термина микрочастицы – микровезикулы (МВ).

Микровезикулы – мембранные структуры различного размера (100–1000 нм), отделяющиеся от цитоплазматической мембраны (ЦПМ) клеток. МВ заключают внутри себя цитозольные компоненты, такие как ферменты, факторы транскрипции, молекулы мРНК[4, 5].

Долгое время полагали, что МВ – инертный «мусор», высвобождаемый клетками в процессе жизнедеятельности, однако накапливающиеся данные свидетельствуют о важной роли МВ в различных физиологических и патологических процессах. К настоящему времени установлено, что МВ участвуют в развитии атеросклероза и гипертензии (влияют на сердечно-сосудистую функцию), тромбоза (стимулируют коагуляцию), неврологических нарушений, воспаления, онкологических заболеваний, а также в процессе ангиогенеза[6–9].

Функция МВ определяется их составом, который зависит от типа клетки, их продуцировавшей, и стимула, вызвавшего их образование[10, 11]. Например, тромбоцитарные МВ (ТМВ) участвуют в свертывании крови, а эндотелиальные (ЭМВ) – в ангиогенезе[11]. При этом все типы МВ способны к переносу заключенных внутри них молекул в другие клетки, то есть МВ опосредуют взаимодействие между клетками на расстоянии. В то же время это способствует распространению вирусов, прионов, а также онкологических заболеваний[3].

Было показано увеличение уровня определенных типов МВ у людей с острым коронарным синдромом, атеросклерозом, ишемическим инсультом, диабетом, системной и легочной гипертензией, гипертриглицеридемией, а также при тромботических заболеваниях[2, 9, 12]. Это наблюдение позволило использовать МВ в качестве маркера соответствующих заболеваний, а также показателя эффективности лечения.

Механизмы образования микровезикул

Образование МВ происходит как в условиях in vivo, так и in vitro. Это нормальный процесс, однако при активации клеток, воздействии стресса или в процессе апоптоза МВ продуцируются в гораздо больших количествах[13].

К настоящему времени установлено, что образование МВ происходит в определенных сайтах на поверхности клетки, обогащенных холестеролом, которые называют липидными рафтами[14], в условиях нарушения мембранной асимметрии (перемещение фосфатидилсерина в наружный монослой ЦПМ), что также является маркером активации или клеточного стресса, а также реорганизации цитоскелета (рис. 1)[15].

Для ЦПМ характерно асимметричное распределение фосфолипидов между двумя монослоями (наружный монослой обогащен фосфатидилхолином и сфингомиелином, тогда как внутренний монослой содержит аминофосфолипиды – фосфатидилсерин (ФС) и фосфатидилэтаноламин (ФЭ)), которое находится под контролем ферментативного трансмембранного комплекса, включающего в себя такие ферменты, как аминофосфолипид-транслоказа, флоппаза, скрамблаза[16, 17]. Перемещение ФС в наружный монослой катализирует АТФ-зависимый фермент с «флиппазной» активностью, при этом также происходит обратный процесс – транспортировка ФС во внутренний монослой с помощью фермента аминофосфолипид-транслоказы, обладающей «флоппазной» активностью, которая поддерживает исходное асимметричное распределение фосфолипидов[16, 17].

Необходимо отметить, что процесс нарушения асимметричности мембраны является Ca2+зависимым. При увеличении концентрации ионов кальция в цитозоле происходит активация флоппазы и одновременное ингибирование аминофосфолипид-транслоказы, что приводит к перемещению ФС преимущественно в наружный монослой ЦПМ[18]. Одновременно, увеличение концентрации Ca2+ приводит к активации эндогенной протеазы кальпаина, некоторых киназ, а также к ингибированию фосфатаз[19]. Эти события в свою очередь приводят к реорганизации цитоскелета. Субстратом фермента кальпаина являются белки анкирины, которые связывают интегральные мембранные белки со спектрин-актиновым цитоскелетом, и собственно белки цитоскелета (спектрин и актин)[2, 18]. Фосфорилирование легких цепей миозина с помощью киназы легких цепей миозина (КЛЦМ) при активации Rhoассоциированной киназой I (Rho-associated kinase I, ROCK-I) при апоптозе стимулирует сократительную активность миозина, которая, вероятно, приводит к натяжению и отделению ЦПМ от цитоскелета, что способствует высвобождению МВ[18, 19].

На ранней стадии апоптоза также наблюдается увеличение концентрации ФС во внешнем монослое ЦПМ и образование МВ. Апоптозные тельца в отличие от МВ более крупные частицы (более 1,5 мкм), образующиеся вследствие фрагментации клетки на финальной стадии апоптоза[19].

Интересно отметить, что в ЭМВ обнаружена высокая концентрация ключевого фермента апоптоза – каспазы-3. Предполагается, что посредством высвобождения МВ клетка избавляется от фермента, избегая таким образом гибели[3]. При этом ингибирование фермента приводит к блокаде высвобождения МВ[18].

Однако открытым остается вопрос – одинаковы ли MВ, высвобождаемые клетками в процессе апоптоза, по липидному и белковому составу, а также по патофизиологическим свойствам, с МВ, высвобождаемыми в результате клеточной активации[11]. Роль микровезикул в ангиогенезе МВ одного типа могут как активировать, так и подавлять ангиогенез в зависимости от своего состава. ЭМВ проявляют ангиогенную активность благодаря наличию матриксных металлопротеиназ (MMP), главным образом MMP-2 и MMP-9, которые вовлечены в процесс миграции эндотелиальных клеток и формирования капилляров[20]. R. Lacroix и др. (2007) обнаружили, что МВ, образующиеся после стимуляции эндотелиальных клеток фактором некроза опухоли-α (TNFα), также способствуют ангиогенезу, преобразуя плазминоген в плазмин[21].

Активатор плазминогена, переносимый ЭМВ, был идентифицирован как урокиназный активатор плазминогена (УАП), который связывается со специфичным рецептором (урокиназный рецептор – УАПР) на поверхности ЭМВ. В результате, образование плазмина, индуцированное УАП, и последующая активация ММР способствуют миграции и формированию капилляроподобных структур эндотелиальными клетками-предшественницами. Однако имеется определенная пороговая концентрация ЭМВ, превышение которой ведет к обратному эффекту[21]. Имеются данные, что ЭМВ способны ингибировать формирование капилляроподобных структур путем увеличения продукции супероксид-аниона и активных форм кислорода (АФК)[22-23]. Увеличение продукции супероксид-аниона, который вступает в реакцию с оксидом азота (NO), ведет к уменьшению запаса NO и развитию окислительного стресса, ответственного за эндотелиальную дисфункцию. Действительно, накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что супероксид-анион и АФК играют важную роль в инициации и развитии сосудистых заболеваний, таких как гипертензия и атеросклероз[23].

Положительное влияние тромбоцитов на процесс ангиогенеза довольно хорошо известно, поэтому исследователей интересовал вопрос о роли в этом процессе ТМВ. Было обнаружено, что ТМВ также проявляют ангиогенную активность, способствуя практически всем этапам ангиогенеза (пролиферация, миграция и формирование капилляроподобных структур ЭК). При этом липидные компоненты ТМВ – главные факторы, активирующие ангиогенез[24].

Отрицательное дозозависимое влияние на процесс ангиогенеза было показано в отношении лимфоцитарных МВ (ЛМВ). ЛМВ ингибируют ангиогенез in vivo и in vitro, снижая выживаемость, пролиферацию и миграцию ЭК. В то же время отрицательный эффект не зависел от вида стимула, который вызвал образование ЛМВ (гипероксия или гипоксия)[25]. Авторы предположили, что антиангиогенные свойства ЛМВ, подобно ЭМВ, обеспечиваются механизмами окислительного стресса. Действительно, ЛМВ индуцируют активацию NADPH-оксидазы, что приводит к увеличению количества продуктов катализируемой ферментом реакции, а именно АФК и суперокид-анион[23, 25].

H.A. Mostefai и соавт. (2008) обнаружили, что МВ, образованные активированными/апоптозными лимфоцитами, способствуют ангиогенезу, увеличивая экспрессию таких проангиогенных факторов, как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), интерлейкин-1β и молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1). Положительное влияние ЛМВ отчасти обусловлено наличием на их поверхности белка Sonic Hedgehog (Shh), который повышает экспрессию двух семейств проангиогенных факторов – VEGF и ангиопоэтинов[23].

Интересны результаты исследований M.C. Deregibus и соавт. (2007): МВ, образованные эндотелиальными клетками-предшественницами, способны индуцировать пролиферацию и образование капилляроподобных структур эндотелиоцитами in vitro посредством доставки мРНК, в том числе ассоциированной с фосфатидилинозитол-3-киназным сигнальным путем, который регулирует антиапоптозную программу и процесс ангиогенеза[26].

Приведенные данные позволяют заключить, что МВ наряду с факторами роста, цитокинами и рецепторами, могут участвовать в межклеточной коммуникации, способствовать репрограммированию дифференцированных клеток и активировать ангиогенную программу в покоящихся клетках. Поскольку обнаружено, что МВ вовлечены в ангиогенез, вызывает интерес возможность их терапевтического применения.

Роль микровезикул в свертывании крови

Впервые МВ обратили на себя внимание именно благодаря участию в свертывании крови. В результате исследования феномена образования тромбина в плазме свободной от тромбоцитов, были открыты ТМВ[1], доля которых достигает 80% от всех циркулирующих микрочастиц в крови человека[19]. Обнаружено, что поверхность ТМВ в 50–100 раз более активна по сравнению с поверхностью тромбоцитов[27].

В свертывании крови также участвуют ЭМВ. Так, при инкубации плазмы с возрастающим количеством ЭМВ наблюдается сокращение времени коагуляции, а также образование тромбина in vitro[11]. Причина коагуляционной активности МВ заключается в наличии ФС во внешнем монослое мембраны, так как в процессе свертывания крови взаимодействие и последовательная активация ряда факторов свертывания происходит на отрицательно заряженной фосфолипидной мембране (ФС несет отрицательный заряд), которую, помимо активированных тромбоцитов, предоставляют разные типы МВ[12]. Вместе с тем, в мембранах многих клеток организма, в частности в мембранах лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток, а также в мембранах соответствующих типов МВ присутствует интегральный гликопротеин – рецептор фактора свертывания VIIa, называемый тканевым фактором (TФ), который участвует во внешнем пути инициации свертывания, приводящим к образованию тромбина – центрального фермента системы свертывания[11, 28, 29].

Однако имеются данные, что МВ способны проявлять свойства антикоагулянта. Так, МВ, образованные эндотелиальными клетками или моноцитами в результате индукции активированным протеином С (APC) – известным физиологическим антикоагулянтом – проявляют отрицательное влияние на процесс свертывания крови. При обработке АРС происходит его связывание со специфическим рецептором на поверхности клеток, этот комплекс сохраняется и в составе МВ в результате «отпочковывания» от мембраны продуцирующей клетки[30]. Именно АРС в составе МВ и проявляет отрицательное влияние на процесс коагуляции, ингибируя факторы свертывания Va и VIIIa[31].

Основываясь на результатах этих исследований, было высказано предположение, что МВ участвуют в регуляции про- и антикоагуляционного равновесия[30]. В целом, МВ защищают от кровотечения, однако их множественное высвобождение может привести к тромботическим осложнениям. Действительно, повышенный уровень прокоагуляционных ЭМЧ был обнаружен у пациентов с острым коронарным синдромом[32] и непосредственно в атеросклеротических бляшках[33].

Клиническое значение циркулирующих МВ: роль в развитии сердечно–сосудистых заболеваний

В крови здоровых людей облигатно циркулируют МВ различного происхождения, основная масса приходится на ТМВ, а также эритроцитарные МВ (ЭрМВ), ЛМВ и ЭМВ[4]. Повышение уровня МВ в крови при заболевании человека впервые было показано при тромбоцитопенической пурпуре (болезнь Верльгофа)[34], с тех пор широко исследуется вклад МВ при различных патологических состояниях. Неудивительно, что в первую очередь большинство исследователей заинтересовала роль МВ в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Существует положительная корреляция между уровнем МВ и тяжестью сердечно-сосудистого заболевания. Вероятно, эти процессы взаимосвязаны, так как установлено, что МВ участвуют в развитии тромбоза, нарушении сосудистой функции, воспалении – основных процессах, вовлеченных в патогенез заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Благодаря участию в свертывании крови, как было отмечено выше, множественное высвобождение МВ может привести к развитию тромбоза. Так, повышенный уровень ТМВ обнаружен у пациентов, перенесших ишемический инсульт[35], с острой тромбоэмболией лёгочной артерии[36], в случае клапанной фибрилляции предсердий, для которой характерен высокий риск развития тромбоэмболического осложнения, их количество увеличено более чем в 3 раза[37]. Повышенный уровень МВ различного происхождения (ТМВ, ЭМВ и моноцитарные МВ) обнаружен у пациентов с тромбозом глубоких вен[38]. У пациентов с высокой степенью стеноза коронарной артерии в 2,5 раза больше количество ЭМВ[39].

Уровень МВ, особенно ЭМВ, повышен также у людей с нарушением сосудистой функции и гипертензией. Признаками нарушения являются ухудшение поток-опосредованного расширения и артериальной эластичности, увеличение скорости распространения пульсовой волны и высокий уровень C-реактивного белка[40]. Установлено, что уровень ЭМВ положительно коррелирует с индексом аугментации (показатель артериальной жесткости) на сонной артерии[41, 42]. В результате, ухудшение артериальной эластичности, ассоциированное с увеличением скорости распространения пульсовой волны, ведет к повреждению эндотелия, что в свою очередь вызывает продукцию ЭМВ, как ответ на стресс. Действительно, у пациентов с декомпенсированной патологией почек, повышенное количество ЭМВ коррелировало с понижением эластичности сосудов и увеличением скорости распространения пульсовой волны[41, 42].

Увеличение количества ЭМВ при гипертензии в основе своей имеет те же причины, что и при эндотелиальном повреждении. Процесс высвобождения МВ эндотелиальными клетками, видимо, крайне чувствителен к изменениям в гемодинамике, так как даже при мягкой гипертензии количество ЭМВ увеличено по сравнению с контрольной группой и растет пропорционально увеличению давления крови[40, 43]. У пациентов с неконтролируемой гипертензией (155/80 мм рт. ст.) уровень ЭМВ в крови был в два раза выше, чем у контрольной группы (120/75 мм рт. ст.), и средний уровень между этими двумя группами был у пациентов с контролируемой гипертензией[42, 44].

Эндотелиальная дисфункция является одной из причин нестабильности бляшки и последующего развития острого коронарного синдрома[45]. Вероятно, отчасти поэтому количество ЭМВ значительно увеличено у пациентов с острым коронарным синдромом по сравнению с относительно здоровыми людьми[46–48].

Исследования последних лет показали, что многие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний (курение, гипертензия, диабет) воздействуют именно на эндотелий. Поэтому ЭМВ, как удобные биомаркеры состояния сердечно-сосудистой системы, приковывают к себе все большее внимание исследователей[42]. H. Koga и соавт. (2005)[49] показали, что уровень ЭМВ является удобоваримым маркером эндотелиальной дисфункции и показателем риска острого коронарного синдрома, даже более чувствительным, чем традиционные методы диагностики.

В этой связи особенно интересным представляется подход к определению количества ЭМВ в комбинации с предшественниками эндотелиальных клеток, соотношение которых способно отразить дисбаланс между процессами повреждения эндотелия и регенерации, что сделает диагностику эндотелиальной дисфункции более точной и информативной[50, 51].

Улучшение состояния при сердечно-сосудистых заболеваниях также выражается в снижении уровня ЭМВ в крови[52], поэтому МВ могут служить показателями успешности лечения, а также – для оценки эффективности новых препаратов.

Заключение

Благодаря участию в таких фундаментальных процессах как ангиогенез и свертывание крови, нарушение баланса МВ ведет к серьезным последствиям. Помимо указанных выше сердечно-сосудистых нарушений, изменения в количестве определенных типов МВ наблюдали и при гипертриглицеридемии, преэклампсии, антифосфолипидном синдроме, фибрилляции предсердий, заболеваниях периферических артерий, сердечной недостаточности, васкулитах, сахарном диабете и др.[42]. МВ участвуют также в развитии таких патологических состояний как атеросклероз, тромбоз, артрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, периодонтит, неврологические нарушения, а также участвуют в инвазии и метастазировании опухолевых клеток[8, 9]. В этой связи исследование МВ позволит глубже проникнуть в механизмы патофизиологических процессов, что откроет новые возможности в обнаружении на ранних этапах развития и лечении соответствующих заболеваний.

 

Подняться вверх сайта