Поиск Кабинет

Механизмы влияния β-амилоидного пептида на ретроградный аксонный транспорт

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 135-137

 

Авторы

Мухамедьяров М.А., Сафиуллов З.З., Утяшева Р.П., Ризванов А.А., Зефиров А.Л., Исламов Р.Р.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Нарушение аксонного транспорта является широко распространенным явлением и ранним событием при многих нейродегенеративных заболеваниях. Целью данной работы стало изучение механизмов нарушения ретроградного аксонного транспорта в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мыши после аппликации β-амилоидного пептида (βАП) (25-35) на центральный отрезок перерезанного седалищного нерва.

Под общим наркозом мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра, а затем на центральный отрезок нерва апплицировали раствор, в зависимости от экспериментальной группы животных, содержащий ретроградный флуоресцентный маркер Fluorogold (5%), либо βАП (25-35) (10-6 М), либо и то и другое. Через 24 ч после операции поясничный отдел спинного мозга процессировали для морфометрического и иммуногистохимического анализа.

В контроле количество Fluorogold-позитивных мотонейронов составило 1223,7±162,7 (n = 7), тогда как при аппликации βАП (25-35) – 393,2±85,3 (n = 5, p < 0,01), что говорит о выраженном угнетении ретроградного аксонного транспорта. Окраска поликлональными антителами к каспазе-3 не выявила мотонейронов в состоянии апоптоза, а окраска моноклональными антителами к βАП (25-35) была отрицательна как на оперированной, так и на интактной стороне спинного мозга.

Таким образом, выявленное нами угнетающее действие βАП (25-35) на ретроградный аксонный транспорт не связано с апоптотической гибелью нейронов или накоплением βАП (25-35) в теле нейрона, а, вероятно, обеспечивается внутриаксонными эффектами. Полученные данные имеют важное значение для понимания механизмов патогенеза болезни Альцгеймера.

Внутриклеточный транспорт веществ и органелл является необходимым условием существования всех клеток млекопитающих, но наибольшую важность этот процесс имеет для нейронов. Это связано с наличием у нейронов отростков и их значительной длиной (длина аксона мотонейрона может составлять более 1 м). Выделяют антероградный и ретроградный аксонный транспорт. Антероградный транспорт обеспечивает доставку материалов из тела нейрона в различные компартменты аксона (натриевые каналы – преимущественно в перехваты Ранвье, синаптические белки – в окончание аксона, и др.), а ретроградный – в обратном направлении (интернализированные синаптические везикулы, сигнальные молекулы и т.д.).

Установлено, что аксонный транспорт нарушается при большинстве распространенных нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероза, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и др.) [1–2]. Чаще всего, такие нарушения связаны с накоплением патологических белковых агрегатов внутри аксонов, однако детальные механизмы дефектов аксонного транспорта при разных патологиях различны. Нарушения аксонного транспорта описаны на ранних стадиях заболевания у трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера [3–4], вместе с тем, механизмы описанных феноменов не ясны. Предполагается, что нарушения аксонного транспорта при болезни Альцгеймера связаны с эффектами β-амилоидного пептида (βАП) и гиперфосфорилированного тау-белка, которые играют центральную роль в патогенезе данного заболевания [1, 5].

В данной работе мы исследовали эффекты и механизмы влияния βАП на ретроградный аксонный транспорт в спинномозговых мотонейронах мыши.

Материал и методы

Методика операции. Эксперименты проводились на трех группах лабораторных мышей дикого типа. Под общим наркозом мышам перерезали левый седалищный нерв в средней трети бедра и на центральный отрезок нерва надевали силиконовую трубку длиной 5 мкм. Далее, в зависимости от экспериментальной группы, трубку заполняли 5 мкл 5% раствора ретроградного флуоресцентного маркера Fluorogold (группа «FG-контроль»), либо 5 мкл 5% раствора Fluorogold с добавлением 10-6 M βАП (25-35) (группа «FG-βАП»), либо 5 мкл 10-6 М раствора β-амилоидного пептида (2535) (группа «βАП»). Свободный конец трубки запечатывали вазелином. Через 24 ч животных под наркозом перфузировали фосфатно-солевым буфером, а затем 4% раствором параформальдегида в фосфатно-солевом буфере. Далее, выделяли поясничный отдел спинного мозга, фиксировали в 4% растворе параформальдегида, а затем хранили в 30% растворе глюкозы для последующего морфологического анализа.

Подсчет Fluorogold-позитивных мотонейронов. Для подсчета Fluorogold-позитивных мотонейронов в спинном мозге мышей групп «FG-контроль» и «FGβАП» готовили серийные поперечные срезы поясничного отдела спинного мозга (30 мкм) на виброслайсере (WPI, США). Количество Fluorogold-позитивных мотонейронов подсчитывали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus BX51WI c использованием ультрафиолетового фильтра (рис. А), а затем вычисляли их суммарное количество во всех срезах спинного мозга одного животного. Статистическую обработку производили при помощи программного комплекса Origin 7.5. Достоверность различий между величинами оценивалась по t-критерию Стьюдента, при этом различия считали статистически достоверными при р < 0,05.

Иммуногистохимия. Для выявления βАП (25-35) и каспазы-3 (маркер апоптоза) проводили иммуногистохимическое окрашивание поперечных парафиновых срезов (5 мкм) спинного мозга мышей группы «βАП» непрямым иммунопероксидазным методом. Для выявления каспазы-3 использовали поликлональные антитела (Sigma-Aldrich, 1:1000, США), для выявления βАП (25-35) – моноклональные антитела (GenScript, 1:100, США). Иммунную реакцию с первичными антителами проводили с помощью стрептавидин-биотинового комплекса (Elite ABC Kit, Vector Laboratories, США). Иммунопреципитат визуализировали с помощью диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase, Vector Laboratories, США). Для контроля проводили окрашивание без первичных или вторичных антител (отрицательный контроль). Готовые срезы изучали под микроскопом Olympus BX51WI.

Результаты и обсуждение

В контроле (группа «FG») количество Fluorogoldпозитивных мотонейронов составило 1223,7±162,7 (n = 7). В группе «FG-βАП» количество Fluorogoldпозитивных мотонейронов было снижено примерно в 3 раза и составило 393,2±85,3 (n = 5, р < 0,01) (рис.). Таким образом, мы впервые получили данные о том, что βАП (25-35) обладает выраженным угнетающим эффектом на ретроградный аксонный транспорт в мотонейронах.

Чтобы выяснить, не связан ли обнаруженный эффект с апоптотической гибелью мотонейронов, мы провели иммуногистохимическую оценку наличия активированной каспазы-3 – одного из маркеров апоптоза в срезах спинного мозга. Анализ иммуногистохимической реакции не выявил различий в окраске ядер между мотонейронами передних рогов оперированной и интактной сторон. Учитывая литературные данные о том, что при активации каспаза-3 перемещается из цитоплазмы в ядро и именно в ядре выполняет свои ключевые про-апоптотические функции [6-8], можно сделать вывод о том, что аппликация βАП (25-35) на культю седалищного нерва, как и перерезка нерва, не вызывает апоптоз мотонейронов.

Далее, при помощи иммуногистохимического метода мы оценили возможность ретрогарадного транспорта βАП (25-35) по аксону в тела мотонейронов в наших экспериментальных условиях. Окраска антителами к βАП (25-35) была негативна в мотонейронах передних рогах как на оперированной, так и на интактной стороне спинного мозга.

Таким образом, выявленное нами угнетающее действие βАП (25-35) на ретроградный аксонный транспорт не связано с апоптотической гибелью нейронов или накоплением βАП в теле клетки, а, вероятно, обеспечивается внутриаксонными эффектами βАП. Возможными механизмами выявленного феномена могут быть взаимодействие βАП с белками, обеспечивающими ретроградный аксонный транспорт (динеин и др.), затруднение прохождения ретроградно транспортируемых материалов из-за накопления фибрилл βАП внутри аксона, и др.

Хорошо известно, что βАП секретируется и накапливается во внеклеточном пространстве. Вместе с тем, ряд исследований последних лет доказывает, что βАП может накапливаться и внутри клетки. Двумя основными источниками внутринейронного βАП может быть внутриклеточная продукция βАП и его захват из внеклеточного пространства путем эндоцитоза [9]. Эти данные свидетельствуют о важном значении полученных нами результатов. Нарушение ретроградного аксонного транспорта под действием βАП может значительно усиливать нейрональную дисфункцию, в частности, за счет нарушения связи между телом нейрона и пресинаптическим окончанием аксона.

Полученные данные имеют важное значение для понимания клеточных эффектов внутринейронного βАП, а также механизмов патогенеза болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с накоплением βАП, в целом.

Подняться вверх сайта