Поиск Кабинет

Матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов – хитина и хитозана

Гены & Клетки: Том IV, №3, 2009 год, стр.: 42-46

 

Авторы

Панарин Е.Ф., Нудьга Л.А., Петрова В.А., Бочек А.М., Гофман И.В., Лебедева М.Ф., Блинова М.И., Спичкина О.Г., Юдинцева Н.М., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

С целью получения резорбируемых матриц для культивирования клеток кожи человека разработаны составы и условия формования пленочных материалов на основе природных полисахаридов — хитина и хитозана. Определено количество первичных аминогрупп, обеспечивающих адгезию и пролиферацию фибробластов кожи на поверхности пленок. Необходимая степень дезацетилирования (СД) достигнута путем щелочной обработки хитина либо термообработкой хитозановых пленок. Для обеспечения пористости пленок в формовочный раствор вводили нетоксичные добавки эфиров целлюлозы, поливинил-пирролидона или поливинилового спирта (ПВС). Определены степени структурирования формовочных растворов и физикомеханические свойства полученных пленок. Проведено тестирование пленок на пригодность в качестве матриц для культивирования фибробластов кожи человека. Показано, что добавка синтетического полимера (ПВС) приводит к ухудшению адгезии и гибели клеток. Наилучшие результаты получены на пленках из частично дезацетилированного хитина (СД 0,20) и термообработанных хитозановых пленках — клетки хорошо адгези-ровали и образовали монослой за 5 суток культивирования.

Создание новых матричных материалов на основе природных полисахаридов, которые могут служить подложкой для культивирования кератиноцитов и фибробластов, покровом для раневых поверхностей и трансплантатом при восстановлении поврежденных участков кожи человека является актуальной задачей заместительной клеточной терапии. Особенно важно разработать биосовме-стимые матрицы, способные рассасываться в организме человека в процессе заживления раны без осложнений и интоксикации организма продуктами распада.

В последние десятилетия в зарубежных клиниках для решения этих проблем стали применять многослойные пласты кератиноцитов, выращенные in vitro. В процессе культивирования количество клеток, выделенное из кусочка кожи, может увеличиваться в десятки тысяч раз, что позволяет закрывать большие раневые поверхности. Однако при трансплантации пласты кератиноцитов необходимо ферментативно отделить от подложки, что приводит к повреждению клеточной мембраны и затрудняет процесс трансплантации. При трансплантации клеток, выращенных на полимерной рассасывающейся матрице, можно избежать нарушения клеточной целостности, ускорить и облегчить процесс пересадки клеточных продуктов.

В качестве таких полимерных матриц целесообразно использовать материалы на основе хитина (ХИН) и его производного хитозана. Эти природные полисахариды биологически совместимы, обладают иммуноадъювант-ным, антимикробным, фунгистатическим, радиопротектор-ным, противоопухолевым, ранозаживляющим, антихоле-стерическим и гемостатическим действием [1]. Они распадаются под действием фермента лизоцима (мура-мидаза — mucopeptide-N-acethylmuramowile hydrolyse, индекс 3.2.1.17) в организме человека на N-ацетилглюкозамин и глюкозамин — естественные продукты метаболизма. Изучение механизма воздействия названных полисахаридов на иммунную систему организма показало, что хитин и в большей степени хитозан увеличивают активность ферментов гликолиза фагоцитов [2]. Частично дезацетилированный хитин также активирует макрофаги, проявляет биологическую активность не свойственную нативному хитину и легче расщепляется лизоцимом [3].

Указанные характеристики хитина и хитозана позволяют полагать, что материалы на их основе перспективны для использования их в качестве матрицы для культивирования клеток кожи человека и последующей трансплантации их при лечении ожоговых и других травматических поражений кожного покрова.

На основании имеющихся литературных данных можно сформулировать требования, предъявляемые к полимерным матрицам, используемым в качестве субстрата для культивирования клеток кожи. Полимер и продукты его разложения в организме должны быть нетоксичными, полимерные матрицы должны быть стабильными во время культивирования клеток, сохранять прочность при перенесении на рану и резорбироваться в процессе их заживления. Для лучшей адгезии клеток матрица должна содержать на поверхности небольшое количество первичных аминогрупп, обладать пористостью и шероховатой поверхностью.

Настоящая работа посвящена разработке состава, способа формования матриц на основе модифицированного хитина и характеристике физико-химических свойств полученных материалов, а также изучению их пригодности для культивирования клеток кожи человека.

Материал и методы

В работе использован хитин, полученный из панцирей крабов (фирма «Сонат», Москва), подвергнутый дополнительной очистке от солей кальция (обработка 2% HCI), липидов (экстракция ацетоном) и протеинов (экстракция 6% NaOH), отмытый водой до нейтральной реакции, промытый ацетоном и высушенный в вакууме при 40 С. После дополнительной очистки хитин имел следующие характеристики: зольность — 0%, белок отсутствует (по реакции кумасси), элементный анализ С — 46,40; Н - 5,86; N — 6,19; [^1 = 8,4 дл/г, М = 137 кДа, рассчитано по формуле [^] = 2,4х10~3 - М0-89 [4].

Частично дезацетилированный хитин был получен щелочной обработкой очищенного хитина. После тщательной отмывки до нейтральной реакции, сушки при комнатной температуре и выдержки в эксикаторе над Р205, полученные образцы анализировали на элементный состав, содержание аминного азота методом кондукто-метрического титрования и определяли молекулярную массу вискозиметрически. Характеристики полученных образцов приведены в таблице. 1.

Поливинилпирролидон (ПВП) — синтезирован в ИВС РАН, ММ = 35 кДа

Поливиниловый спирт (ПВС) — ММ = 100 кДа.

Гидроксиэтилцеллюлоза (ГОЗЦ) ^производства «По-лимерсинтез» (Владимир), мольное замещение 1,98; ММ = 305 кДа.

Формование хитиновых пленок проводили по сухомокрому и мокрому способам. Хитин и полимерные добавки были растворены в ДМАА/5% LiCI раздельно с получением 3% концентрации по каждому полимеру. Затем были приготовлены смеси растворов полимеров с содержанием 2,5 и 10% порообразующего полимера.

Реологические измерения проводили на ротационном вискозиметре «Реотест 2.1.» с рабочим узлом цилиндр^цилиндр в диапазоне напряжений сдвига 3^600 Па в интервале температур 293^308оК.

При сухо-мокром способе растворы наносили на стеклянную подложку и выдерживали на воздухе в течение суток для формования структуры пленки, после чего пленку на подложке погружали в осадитель (вода). При мокром способе формования раствор на подложке сразу погружали в воду. Сформованные пленки отмывали водой от модификатора. Полноту удаления контролировали по его отсутствию в промывных водах (упаривание пробы на стекле) и на ионы хлора по реакции с азотнокислым серебром. Отмытые пленки сушили на воздухе с фиксацией, затем определяли деформационно-прочностные свойства и пористость по скорости фильтрации воды сквозь пленку.

Формование хитозановых пленок из 3% растворов в 2% уксусной кислоте осуществляли по сухому способу: раствор наносили на стеклянную подложку через щелевидную фильеру и сушили на воздухе, а затем прогревали при 120°С в течение 30 мин.

Механические характеристики пленок определяли в режиме одноосного растяжения на образцах в виде полос шириной 2 мм с длиной рабочей части 20 мм. Испытания проводились на универсальной установке для механических испытаний UTS 10 (UTStestsysteme, Германия). Растяжение образцов проводилось со скоростью 20 мм/мин. В процессе испытаний регистрировалась диаграмма растяжения образца; по результатам испытаний определяли модуль упругости Е, прочность стр, разрывную деформацию s и предел пластичности стп.

Тестирование образцов пленок на пригодность в качестве матриц для культивирования клеток проводили по следующей методике: шаблоны, приготовленные из образцов, стерилизовали автоклавированием под давлением 1 атм. при 120°С в течение 40 мин., дополнительно отмывали физиологическим солевым раствором без ионов Са и Mg от полимерных добавок. На каждый из образцов пленки высевали нормальные дерклеток/см2. Контролем служили фибробласты из той же клеточной популяции, посеянные на стандартные пластиковые чашки Петри. При культивировании клеток использовали питательную среду ДМЕМ (ICN, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (HyClone, США). Через сутки и 5 сут. культивирования производили оценку состояния культур с помощью светового микроскопа Биолам П-2 СПОМО, Россия) с фотонасадкой.

Результаты и обсуждение

Предварительные исследования образцов хитина различного происхождения на цитотоксичность обнаружили, что промышленные образцы хитина непригодны для культивирования фибробластов. В связи с этим была проведена тщательная очистка образцов хитина и хитозана от примесей белковой, липидной и минеральной природы. Испытания очищенных образцов хитина на цитотоксичность по отношению к фибробластам и кератиноцитам показали, что принятая нами методика очистки удаляет все токсичные примеси. Клетки адге-зируют и распластываются на хитине, а затем пролиферируют со скоростью сходной с контролем.

Согласно литературным данным влияние степени дезацетилирования (СД) хитозана на прикрепление клеток к матрице и их пролиферацию весьма существенно. Чем выше СД хитозановой матрицы, тем больше клеток к ней прикрепляется, но для роста клеток благоприятнее низкие СД [2]. К такому же выводу пришли авторы работы [5], отмечая зависимость адгезии клеток на хитозановых пленках. Фибробласты прикрепляются вдвое легче, чем кератиноциты, но пролиферация ке-ратиноцитов увеличивается с увеличением СД, в то время как фибробласты не размножаются на хитозановых пленках, хотя и остаются живыми. Противоположное заключение дано в работе [6]: хитозан с высокой СД сильно стимулирует рост фибробластов, а при низких СД проявляет низкую активность. Отмечено также, что кератиноциты замедляют рост на высоко дезацетилиро-ванном хитозане. Все приведенные данные показывают, что изменяя СД можно модулировать митогенезис клеток кожи человека in vitro.

Большое значение для адгезии клеток имеет пористость матрицы и топография ее поверхности. В работе [7] показано, что клетки хорошо прикрепляются и пролиферируют на матрицах с диаметром пор 15^100 мкм и при шероховатой поверхности.

В связи с этим нами были получены образцы частично дезацетилированного хитина (см. табл.1) и сформованы хитиновые пленки с различной пористостью, для чего в растворы хитина вводили нетоксичные добавки водорастворимый эфир целлюлозы ГОЭЦ, ПВС или ПВП, которые вымывали водой после высушивания пленок. Надмолекулярная структура пленок в значительной степени определяется структурой раствора, которая в свою очередь зависит от взаимодействия растворенных компонентов. В связи с этим была изучена реология формовочных растворов при 298 и 308°К, содержащих хитин и порообразующие добавки, получены кривые течения, представленные на рис. и рассчитаны степень структурирования и Еа-энергия активации вязкого течения (табл. 2).

Наибольшие значения степени структурирования и Еа имеет раствор хитина, введение ГОЭЦ снижает обе эти характеристики тем в большей степени, чем выше концентрация модификатора. Это означает, что введение добавки нарушает собственную структуру раствора хитина и создает новую общую структуру раствора, что связано с родством химической природы хитина и целлюлозы. Иначе проявляет себя добавка ПВП — 2,5% концентрация ПВП оказывает более сильное влияние, чем 10%. В этом случае ПВП, нарушая структуру раствора хитина при меньшей концентрации, по-видимому, создает собственную фазу при 10% концентрации.

Анализ данных по физико-механическим свойствам полученных пленок показывает (табл. 3 и 4), что при сухо-мокром формовании получены более прочные, но менее эластичные пленки, чем при мокром способе. Влияние концентрации модификатора проявляется только при сухо-мокром способе, причем при большем содержании модификатора пленки прочнее. Этот факт можно связать с данными по пористости пленок. Большее количество модификатора обеспечивает пленкам большую пористость, но при этом радиус пор уменьшается при обоих способах формования. Диаметр пор полученных пленок находится в диапазоне 20^140 Е.

Пленки из частично дезацетилированого хитина (см. табл.1, обр. 2 и 3) были сформованы сухо-мокрым способом при использовании в качестве порообразователя 2,5% ПВП с последующей отмывкой. Высушенные пленки были пластифицированы выдержкой в 5% растворе глицерина в воде.

Пленки, полученные мокрым формованием (см. табл. 3, обр. 5^8) были мутными, а потому состояние клеток на их поверхности нельзя было проследить визуально под инвертированным микроскопом. На образцах пленок 1—4 (см. табл. 3) фибробласты закреплялись и пролиферировали.

Пленки из растворов хитозана в кислоте, полученные методом сухого формования, прозрачны, прочны и эластичны, имеют низкую пористость.

Так как свежесформованные хитозановые пленки растворимы в воде, то для перевода их в нерастворимое состояние использована термообработка при 120°С. Происходящие при этом изменения — связывание уксусной кислоты, образование иминных связей, возникновение межмолекулярных сшивок приводят к уменьшению количества свободных аминогрупп, при этом физико-механические свойства пленок не ухудшаются [8].

Прогрев (табл. 5) увеличивает прочность пленок при разрыве, одновременно снижая их эластичность, что приводит к повышению жесткости пленок. Происходящее при этом уменьшение содержания аминогрупп благоприятствует закреплению и размножению клеток фибробластов и кератиноцитов. За 5 сут. культивирования на этих пленках фибробласты образуют почти сплошной слой (см. рис.). Совокупные характеристики прогретых пленок свидетельствуют об их пригодности для использования в качестве матричного материала.

Тестирование пленок, сформованных из частично дезацетилированного хитина (СД 0.12, 0.19 и 0.29), показало, что с увеличением СД хитина адгезия фибробластов на их поверхности и пролиферация клеток улучшаются. При СД 0,29 за 5 сут. культивирования образуется почти полный монослой клеток. Однако, введение в хитиновые пленки синтетического полимера (ПВС) даже в количестве 0,5% от массы хитина, приводит лишь к частичной адгезии клеток и их гибели (см. рис.).

Выводы

1. Получены прочные и эластичные пленочные материалы на основе хитозана и частично дезацетилированного хитина, сохраняющие форму и прочность в водной среде.

2. Тестирование образцов пленок в качестве матриц для культивирования фибробластов показало, что наилучшими свойствами для адгезии и пролиферации клеток обладают термообработанные хитозановые пленки и пленки из частично дезацетилированного хитина.

Подняться вверх сайта