Поиск Кабинет

Лимфоцитарный контроль дифференцировки кроветворных стволовых клеток

Гены & Клетки: Том I, №2, 2006 год, стр.: 63-75

 

Авторы

Манько В.М., Петров Р.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В наши дни сотни экспериментальных и клинических исследований посвящены проблемам стволовых клеток [СК], как эмбрионального, так и тканевого происхождения. Интерес к этому возник в связи с осмысливанием и возможностью воспроизведения двух основных качеств СК: способность к длительному самовоспроизведению и их мультипотентность, т.е. способность дифференцироваться в любую клетку организма. Первое качество дает возможность накопления СК в культуре. Второе - окрыляет своей заманчивостью лечения очень широкого круга заболеваний, травм, инфарктов, нервных и эндокринных нарушений, включая диабет. Тканевое клонирование снимает все проблемы несовместимости при трансплантациях.

Высокая значимость стволовой кроветворной клетки [СКК] для биологии и медицины определяется ее иерархическим положением в клеточной дифференцировке, дающей начало пулу жизненно важных популяций клеток периферической крови - эритроцитам, мононуклеарным фагоцитам [моноцитам и макрофагам], гранулоцитам [нейтрофилам, базофилам и эозинофилам], тучным клеткам, тромбоцитам и лимфоцитам [естественным киллерам, Т- и В-клеткам), формируемым через дочерние клетки-предшественники -миелоидную и лимфоидную стволовые клетки.

Активное изучение функций СКК индуцировали два открытия. Одно из них сделало возможным количественное определение СКК, содержащихся в различных тканях, включая костный мозг, периферическую кровь, селезенку. Это открытие было сделано канадскими исследователями Тиллом и Мак Куллохом в 1961 г. [1, 2]. Было показано, что внутривенная трансплантация клеток костного мозга сингенным летально облученным реципиентам сопровождается через 78 сут образованием в их селезенке видимых на глаз колоний дифференцированных клеток. С помощью серийных гистологических срезов селезенки облученных реципиентов установлено, что из общего числа колоний около 42-55% составляют колонии эритроидного типа, 14-24% - гранулоцитарные, 18-21% - мегакариоцитарные, 16-21% - смешанные [3, 4]. С помощью хромосомных маркеров было доказано, что каждая из колоний образуется отдельной пролиферирующей и дифференцирующейся стволовой клеткой, а численность селезеночных колоний характеризует количество СКК, содержащихся в данной взвеси клеток, осевших в селезенке после трансплантации и давших рост клеточных колоний.

Другое открытие было сделано Р.В. Петровым и Л.С. Сес-лавиной, показавшими возможность регуляции функций СКК через лимфоцитарный контроль. Оказалось, что лимфоциты, трансплантированные совместно с клетками костного мозга, изменяют характер дифференцировки генетически идентичных СКК [5, 6] и инактивируют генетически чужеродные СКК [7, 8]. Обнаруженное Р.В. Петровым и Л.С. Сесла-виной явление взаимодействия лимфоцитов со стволовыми кроветворными клетками зарегистрировано в качестве открытия Государственным Комитетом СССР по делам изобретений и открытий в Государственном реестре открытий за №192 от 1 декабря 1977 г.

Эти факты явились той необходимой основой, на которой развернулись широкомасштабные экспериментальные исследования по изучению функций стволовой кроветворной клетки и их регуляции. Эти исследования проводились с 1965 года на протяжении более чем 20-летнего периода коллективом иммунологов под руководством академика Р.В. Петрова в Институте биофизики Минздрава СССР, а затем в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства. При проведении исследований использовались разные линейные и гибридные мыши разных гаплотипов, а также конген-ные, рекомбинантные и мутантные линии, в т.ч. специально выводимые для решения поставленных задач, и различные модельные системы, созданные исследовательским коллективом, для изучения особенностей и механизмов регистрируемых реакций. Это позволило получить целый ряд пионерских данных, уникальность которых была высоко оценена на международном уровне.

Лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток, формирующих гемопоэтические колонии в селезенке облученных реципиентов.

Уже на ранних этапах изучения факторов, регулирующих основные функции СКК, была установлена выраженная зависимость их дифференцировки от взаимодействия с син-генными лимфоцитами. Оказалось, что клетки костного мозга мышей линии СВА, трансплантированные летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]Fv образуют в их селезенках примерно такое же число колоний кроветворных клеток, как и в селезенках сингенных [СВА] летально облученных мышей. При одной и той же дозе костномозговых клеток принципиально одинаковым было и отношение числа колоний эритроидного и гранулоцитарного типов [Э/Г] -2,4 и 2,1. Иначе говоря, родительские СКК в селезенке обоих генотипов дифференцировались преимущественно в эрит-роидном направлении. Однако при трансплантации клеток костного мозга мышей линии СВА в смеси с сингенными лимфоцитами [клетки лимфатических узлов] летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]Fr но не мышам линии СВА, резко снижается [вплоть до полной отмены] способность СКК формировать в селезенке реципиентов колонии эритроидного типа при одновременном увеличении численности гранулоцитарных колоний [9, 10]. С увеличением в смеси числа лимфоцитов, отношение Э/Г снижалось [с 2,0 до 0,03] вплоть до полной отмены дифференцировки СКК в направлении эритропоэза. В этом случае на серийных срезах селезенки облученных реципиентов регистрировали колонии только гранулоцитарного типа [10]. Костномозговое происхождение селезеночных колоний было доказано с помощью хромосомного маркера Т6Т6 [11]. Поскольку в полностью сингенной системе донор-реципиент [СВА+СВАхСВА] лимфоциты не влияли на характер дифференцировки сингенных СКК, было заключено, что лимфоциты, стимулированные антигеном [со стороны облученного реципиента], тормозят образование эритроидных колоний сингенными клетками костного мозга и направляют диф-ференцировку СКК в сторону гранулопоэза [10, 12].

Полученные результаты опытов были впервые доложены Р.В. Петровым на XII Международном конгрессе по переливанию крови [Москва, 17-23 августа 1969 г.], а затем и опубликованы [5, 6, 13]. В иных экспериментальных системах факт сдвига дифференцировки СКК в направлении гранулопоэза под влиянием сингенных лимфоцитов был подтвержден японскими [14] и американскими [15] исследователями.

Эффект аллогенной ингибиции и его отмена сингенными лимфоцитами

В отличие от СКК мышей линии СВА, трансплантация летально облученным мышам [CBAxC57BL/6J]Fn клеток костного мозга мышей другого родительского генотипа -C57BL/6J - сопровождается резким снижением числа селезеночных колоний [1,6±02], по сравнению с их количеством в селезенке летально облученных сингенных реципиентов -C57BL/6J [37,5±3,4]. При этом число колоний эритроидного типа увеличивалось, отношение Э/Г возрастало с 1,6 в селезенке сингенных мышей до 4,0 - в селезенке мышей F1 [9]. Этот эффект известен в литературе под разными наименованиями [Эффект аллогенной ингибиции, Эффект репрессии СКК, Эффект гибридной резистентности, Эффект сингенного предпочтения - для клеток, характеризующихся предпочтительным ростом в сингенном организме, по сравнению с реципиентом гибридной природы]. Он обычно проявляется в отношении СКК одного из двух родительских генотипов, детально охарактеризован в работах [9, 10, 12, 16]. Эффект аллогенной ингибиции не зависит от возраста доноров СКК, регистрируется при трансплантации облученным гибридным реципиентам, клеток эмбриональной печени [13-16-суточные зародыши] или костного мозга половозрелых или старых [3-месячные, 2-летние] мышей родительского генотипа [C57BL/6J] [17]. В количественном отношении эффект слабо выражен для клеток селезенки [9], содержащей как СКК, так и лимфоциты, отменяется при совместной трансплантации реципиентам-гибридам клеточных взвесей, содержащих СКК репрессируемого родительского генотипа в смеси с сингенными лимфоцитами [9, 18, 19, 20] или клетками тимуса [17]. Однако и в этом случае, несмотря на заметное усиление колониеобразующей активности СКК, характер их дифференцировки изменяется под влиянием сингенных лимфоцитов стимулированных антигеном с преимущественно эритроидного на преимущественно грануло-цитарный путь развития. Отношение Э/Г падало с 4,4 до 0,6 [19, 20, 21].

Лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток, формирующих «ранние» и «поздние» гемопоэтические колонии в селезенке облученных реципиентов

Было показано, что колонии гемопоэтических клеток в селезенке облученных реципиентов формируют, по меньшей мере, два типа предшественников [СКК]. «Ранние» колонии [7-8-суточные] образуют преимущественно коммитиро-ванные предшественники эритроидных клеток, «поздние» [10-12-суточные] - менее зрелые стволовые элементы, способные дифференцироваться в направлении различных ростков кроветворения. Показано также наличие «персисти-рующих» колоний, выявляемых на всех сроках наблюдения [22]. Как оказалось, 12-суточные колонии, образуются не примитивными стволовыми клетками [23], как это полагалось ранее [22], а формируются, по-видимому, все же иными, менее коммитированными СКК, по сравнению с СКК, формирующими 7-8-суточные колонии [24, 25].

Характеристику дифференцировки СКК на разных этапах образования колоний изучали в зависимости от генотипа доноров костного мозга, сочетания генотипов донор-реципиент, включения в костномозговой трансплантат Т-лимфоцитов или их элиминации в результате тимэктомии половозрелых доноров костного мозга.

Определение численности СКК в селезенке сингенных реципиентов на 7-8 сутки после летального облучения показало, что их содержание в клеточной популяции определяется используемой тканью и генотипом животных. В популяции спленоцитов содержание СКК в 10-20 раз меньше, по сравнению с их содержанием в костном мозге, в популяции клеток лимфатических узлов, тимуса или головного мозга СКК не выявляются [16, 26, 27, 28]. При внутривенной трансплантации 106 спленоцитов сингенным летально облученным животным число определяемых колоний в селезенке составляло в среднем: у мышей линии СВА - 12,8; C57BL/ 6J - 14,7; А - 16,8; [CBAxC57BL/6J]F,, - 18,5; C3H - 27; CC57BR - 45,6; CC57W - 59,5 [16].

Определение характера дифференцировки СКК в разные сроки [5, 7, 9, 12, 14 сут] после трансплантации сингенных клеток костного мозга летально облученным мышам разных генотипов не выявило отличий в величине отношения Э/Г, которое находилось в пределах одних и тех же величин - 1,6-2,8 [29]. Принципиально сходные результаты получены при трансплантации летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]F1 клеток костного мозга родительских генотипов СВА и C57BL/6J, характеризующихся разной чувствительностью к проявлению эффекта аллогенной ин-гибиции - сильной по отношению к СКК генотипа C57BL/6J и незначительной - по отношению к СКК генотипа СВА. При гистологическом анализе 7- и 12-суточных колоний отношение Э/Г находилось в пределах одних и тех же показателей -1,8-2,6 [12].

Вне зависимости от сроков анализа после облучения [5-14 сут], на гистологических срезах селезенки облученных реципиентов [CBAxC57BL/6J]Fv получавших трансплантат родительских [СВА] клеток костного мозга в смеси с син-генными [СВА] клетками лимфатических узлов, наблюдали сдвиг дифференцировки СКК в сторону гранулопоэза -отношение Э/Г составляло 0,3-0,5 [29].

В целом, данные, полученные в разной постановке опытов, не выявили принципиальных различий в характере дифференцировки СКК в «ранние» [5-7 сутки] и «поздние» [12-14 сутки] сроки после трансплантации только клеток костного мозга или клеток костного мозга в смеси с сингенны-ми лимфоцитами. Как на уровне «ранних», так и на уровне «поздних» колоний дифференцировка СКК находится под вышеописанным лимфоцитарным контролем [12].

Лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток, формирующих гемопоэтические колонии в костномозговой полости облученных реципиентов

Как оказалось, аналогичные процессы развиваются в костном мозге облученных реципиентов. Было показано, что в костном мозге, в отличие от селезенки, гемопоэз идет преимущественно в сторону образования колоний гранулоци-тарного типа. Так, при трансплантации клеток костного мозга мышей линии СВА в костном мозге летально облученных реципиентов [CBAxC57BL/6J]F1 донорские СКК формируют колонии преимущественно гранулоцитарного типа, отношение Э/Г составляет на 8-9 сутки после облучения 0,550,57. При включении в костномозговую смесь сингенных [СВА] лимфоцитов лимфатических узлов отношение Э/Г падает до 0,14 [10]. Иначе говоря, лимфоциты, взаимодействуя с сингенными СКК, изменяют направление их дифференцировки в селезенке с преимущественно эритроидного пути на преимущественно гранулоцитарный, в костном мозге - усиливают дифференцировку СКК по пути гранулопоэза [10, 30, 31]. Поскольку в полностью сингенной системе донор-реципиент [СВА+СВАаСВА], как и в выше приведенных результатах опытов [32], характер дифференцировки СКК под влиянием лимфоцитов не изменяется, сделано заключение о том, что СКК в костномозговой полости изменяют типичное для них направление дифференцировки под влиянием сингенных антигенностимулированных [со стороны облученного гибридного реципиента] лимфоцитов [9].

Исследование характера дифференцировки СКК в костном мозге мышей показало также возможность изменения их развития и в сторону эритропоэза [31]. Так, при различных воздействиях, сопровождающихся перераспределением Т-лимфоцитов и миграцией их в костный мозг без их предварительной антигенной активации [инъекции гидрокортизона, стрессовые нагрузки, трансплантация летально облученным реципиентам сингенных сублетально облученных клеток костного мозга в смеси с сингенными тимоцитами и пр.] в костномозговой полости животных регистрируется изменение дифференцировки СКК с преимущественно гра-нулоцитарного на преимущественно эритроидный путь кроветворения - отношение Э/Г возрастает с 0,6 до 1,2-2,0. В этих же условиях, например при гормональных нагрузках, спленоциты формируют в костномозговой полости колонии преимущественно гранулоцитарного типа. Иначе говоря, при инъекциях гормона СКК костного мозга дифференцируются в костномозговой полости реципиентов как клетки селезенки, а клетки селезенки - как клетки костного мозга. Результаты этих экспериментов обобщены в работе [12].

Т-лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток

Для характеристики лимфоцитов, контролирующих процесс дифференцировки сингенных СКК, использовали лимфоидные клетки из разных источников [мыши линии СВА], трансплантируемые в смеси с клетками костного мозга [мыши линии СВА] летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]Fr На 8-9 сутки после трансплантации на серийных срезах селезенки реципиентов считали число коло- ний различных гистологических типов [32, 33]. Наибольшую активность проявляли нефракционированные клетки лимфатических узлов, под их влиянием отношение Э/Г падало с 2,4 до 0,17. Сходной активностью характеризовались клетки лимфатических узлов тимэктомированных доноров [Э/Г 0,19]. По сравнению с кортизонрезистентными клетками лимфатических узлов [Э/Г 0,25] или нефракционированными клетками лимфатических узлов существенно меньшую активность проявляли кортизонрезистентные тимоциты, которые были примерно в 5 раз более активными, по сравнению с нефракционированными клетками тимуса [Э/Г 0,1 и 0,5, соответственно в дозах в 10 раз превышающих количество трансплантируемых нефракционированных клеток лимфатических узлов]. Т-лимфоциты из лимфатических узлов Т-мышей характеризовались такой же активностью, как и клетки лимфатических узлов интактных животных, однако Т-лимфоциты из селезенки Т-мышей не влияли на процесс дифференцировки СКК в направлении гранулопоэза. Неактивными были также В-лимфоциты из лимфатических узлов В-мышей [12, 21, 32, 33, 34].

В целом, полученные факты демонстрируют, что диф-ференцировка СКК находится под контролем лимфоцитов Т-системы иммунитета. Проведенный детальный анализ результатов экспериментов по Т-лимфоцитарной зависимости дифференцировки СКК позволил заключить, что взаимодействие Т-лимфоцитов с СКК не опосредуется через реакцию «трансплантат против хозяина» [РТПХ], регистрируемые эффекты являются следствием прямого взаимодействия лимфоцит-стволовая клетка в присутствии тканевых антигенов [4, 9, 11, 12, 35, 36]. Лимфоциты, контролирующие процесс дифференцировки СКК, были названы Т-диффе-ренцирующими [Td] [12, 21, 32, 37].

Тимический контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток

Для исследования роли тимуса в процессе диффе-ренцировки СКК выполняли тимэктомию доноров костного мозга, реципиентов или как доноров костного мозга, так и реципиентов. Колонии различных гистологических типов считали на серийных срезах селезенки реципиентов, на 8-9 сутки после их летального облучения. Выключение функции тимуса сопровождалось сдвигом дифференцировки СКК в сторону эритропоэза, отношение Э/Г увеличивалось с 2,2-2,4 до 5,2-14,5. Этот эффект наблюдали как при трансплантации клеток костного мозга тимэктомированных мышей [мыши линии СВА] сингенным летально облученным реципиентам [мыши линии СВА], так и летально облученным реципиентам гибридной природы - [CBA*C57BL/6J]Fr Включение в костномозговой трансплантат сингенных Т-лимфоцитов [мыши линии СВА] увеличивало выход колоний миелоидного типа, нормализовало дифференцировку СКК в организме сингенного реципиента [СВА] и приводило к ее резкому сдвигу в сторону гранулопоэза в организме реципиента гибридной природы. Отношение Э/Г падало с 5,2-14,5 до 2,9-6,0 [реципиенты СВА] и с 4,7-5,4 до 0,1 -0,2 [реципиенты гибриды F,,] [33, 38, 134].

В соответствии с приведенными фактами по анализу тимического контроля функций СКК находятся результаты экспериментов по исследованию дифференцировки СКК новорожденных мышей, характеризующихся минимальным количеством функционально активных Т-лимфоцитов, или старых мышей [24-28-месячных] с тимической инволюцией. В этих опытах летально облученным половозрелым мышам [СВАхC57BL/6J]F1 трансплантировали СКК-содержащие клетки печени [новорожденные мыши] костного мозга и периферической крови сингенных животных разного возраста - новорожденных, 2-недельных, 2,5- и 26-месячных. Как и во всех других экспериментах, на 8-9 сутки после облучения в селезенке считали число макроскопически видимых колоний, а на ее серийных срезах - число колоний разных гистологических типов. Было показано, что диффе-ренцировка СКК донорского костного мозга [новорожденные животные или 26-месячные) шла с превалированием эрит-ропоэза, т.е. так же, как и дифференцировка СКК тимэкто-мированных мышей. Величина Э/Г составляла 4,5-10,1. Добавление к костномозговому трансплантату старых [26-месячных) мышей сингенных клеток тимуса или лимфатических узлов животных в возрасте 2,5 мес обеспечивало нормализацию дифференцировки СКК - отношение Э/Г падало с 5,0 до 2,0-2,2 [32, з9].

Результаты экспериментов по изучению контроля Т-си-стемой иммунитета функций СКК подробно проанализированы в работе [12]. Сделаны следующие заключения.

1. Процессы дифференцировки СКК находятся под совместным Т-лимфоцитарным и тимическим контролем.

2. Под контролем Т-системы иммунитета находятся не только процессы дифференцировки СКК, но и другие их функции: пролиферации и самообновления. Как будет показано ниже, Т-система иммунитета контролирует также процессы миграции СКК.

3. Нормализация процесса дифференцировки СКК, нарушенной при Т-иммунодефиците [выключение функции тимуса), происходит в полностью сингенной системе, не требуя антигенной стимуляции Т-лимфоцитов, тогда как сдвиг дифференцировки СКК в сторону гранулопоэза осуществляется антигенностимулированными Т-лимфо-цитами.

4. Изменение характера дифференцировки СКК в полностью сингенной системе донор-реципиент и его нормализация в результате трансплантации сингенных Т-лимфоцитов подтверждает прямое взаимодействие лимфоцитов и СКК, и что оно не опосредуется через РТПХ.

Важным следствием проведенных исследований явилось создание экспериментальной системы, позволяющей моделировать направление дифференцировки СКК через лимфоцитарный контроль - изменять ее с нормальной на эритроидную и с эритроидной на гранулоцитарную.

Т-лимфоцитарный контроль пролиферации и самообновления стволовых кроветворных клеток

Заключение о Т-лимфоцитарном и тимическом контроле дифференцировки СКК неоднократно подтверждалось многочисленными экспериментальными исследованиями многих научных коллективов. Значимость открытой и описанной проблемы Т-лимфоцитарного контроля функций СКК обусловила независимое проведение двух специальных форумов по иммунологии, посвященных Т-клеточной регуляции гемопоэза [40, 41].

Было установлено, что под контролем Т-лимфоцитов находятся и другие функции СКК - процессы их пролиферации и самообновления. Как уже отмечалось, первые данные о зависимости пролиферации СКК от взаимодействия с лимфоцитами были получены Р.В. Петровым и сотрудниками и доложены в 1969 г. на XII Международном конгрессе по переливанию крови. Эти работы получили дальнейшее экспериментальное развитие. На этом же Конгрессе был представлен доклад D. Barnes и соавторов [42], в котором авторы подтвердили заключения Р.В. Петрова о лимфоцитарном контроле процессов пролиферации СКК. Здесь же мы отметим наиболее значимые исследования, развившие эти выводы в иных экспериментальных системах и подтвердившие заключения Р.В. Петрова и сотрудников о Т-лимфоцитарной зависимости таких функ- ций СКК, как их пролиферация и самообновление.

В опытах с различными воздействиями на клетки костного мозга - введение донорам костного мозга митогенов КонА или ФГА [43, 44], облучение в дозе 1,8 Гр [45], обработка клеток кроличьей антисывороткой к антигенам головного мозга мышей [46, 47, 48], антисывороткой к антигену Thy-1 [49, 50] или в результате трансплантации клеток костного мозга мышей с аллелем Thy-1.2 летально облученным мышам с аллелем Thy-1.1, иммунизированным тимоцитами животных с аллелем Thy-1.2 [51], регистрировали резкое снижение колониеобразующей способности СКК.

Добавление к облученным или обработанным митогена-ми или антисыворотками клеткам костного мозга интактных сингенных тимоцитов нормализовало колониеобразующую способность СКК. Однако добавление тимоцитов к интактным клеткам костного мозга сингенных половозрелых животных не влияло на функции СКК. Эффект усиления колониеобра-зования наблюдался лишь при добавлении тимоцитов половозрелых мышей к клеткам костного мозга или селезенки новорожденных животных [52].

В случае трансплантации клеток костного мозга мышей с аллелем Thy-1.1 летально облученным мышам с аллелем Thy-1.1, иммунизированным тимоцитами животных с аллелем Thy-1.2, колониеобразующая способность СКК так же, как их характер дифференцировки, не изменялись.

У мышей с макроцитарной анемией W/Wv известен генетический дефект, обусловливающий неполноценность кроветворения. Считалось, что генетический дефект реализуется на уровне стволовой клетки. S. Sharkis и соавт. [50] установили возможность нормализации пролиферации и дифференцировки СКК с нормализацией кроветворения у этих мышей с помощью Т-лимфоцитов нормальных доноров. Авторы назвали эти клетки «Чувствительными к антитэтасы-воротке регуляторными клетками» - TSRC (antitheta-sensitive regulatory cells). Регуляторные клетки, чувствительные к ан-титэтасыворотке, содержатся также в костном мозге. Так, было показано, что клетки костного мозга, обработанные антисывороткой к антигену Thy-1.2, фактически полностью утрачивали пролиферативную активность, они не формировали колонии в селезенке и не нормализовали анемию у мышей W/Wv [68]

Пролиферацию СКК и их дифференцировку в направлении гранулопоэза усиливали и сингенные тимоциты, трансплантированные вместе с клетками костного мозга сингенным сублетально [600 rd или 6 Gy) или летально [750 rd или 7,5 Gy) облученным мышам линии C57BL/6 с мутацией bg/bg [53].

В процессах Т-лимфоцитарной регуляции пролиферативной активности СКК участвуют не только хелперные, но и супрессорные Т-клетки, в частности, активируемые при обработке клеток костного мозга митогенами [43, 44]. Как уже отмечалось, в этих случаях колониеобразующая активность СКК падает, но она нормализуется при трансплантации реципиентам тимических клеток интактных животных.

Помимо процессов пролиферации и дифференцировки СКК, под контролем Т-системы иммунитета находятся также процессы их самообновления, усиливающиеся в 2-3 раза в результате взаимодействия с тимическими клетками. Процессы самообновления характеризуются линейной специфичностью [хорошо выражены у мышей линий C57BL/6 и BALB/c, но не у мышей B6D2F1), зависят от соотношения тимоцитов и стволовых колониеобразующих единиц [КОЕ) -оптимальное 50:1 и от возраста доноров тимоцитов [эффективны 4-5-недельные, а12-26-недельные - мало- или неэффективны). Предварительное облучение тимоцитов in vitro в дозе 1500 Р усиливает их способность влиять на самоподдержание СКК [114]. Обработка клеток костного мозга антисывороткой к антигену Thy-1 практически полностью лишает их способность к самоподдержанию [50].

Регуляция функций стволовых кроветворных клеток предшественниками Т-лимфоцитов

Выяснение природы Т-лимфоцитов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки СКК, выявило необходимость взаимодействия двух типов клеток, определяемых в костном мозге нормальных мышей. Одна из таких фракций костномозговых клеток не экспрессировала на мембране антиген SC-1, а другая характеризовалась фенотипом SC-1 +. Считалось, что антиген SC-1 экспрессируют СКК, поскольку элиминация из костного мозга SC-1+-клеток с помощью антисыворотки к головному мозгу мышей сопровождалась отменой селезеночного колониеобразования. Этот антиген был вначале определен как антиген стволовых клеток (SC-1 - Stem cell antigen 1) [46]. Оказалось, однако, что антиген SC-1 экспрессируют не СКК, а костномозговые предшественники Т-лимфоцитов (ПТЛ). СКК, наоборот, не несут на поверхности эту молекулярную структуру и имеют фенотип SC-1-. Обе фракции клеток (CS-1 + и SC-1-), выделенные из костного мозга и порознь трансплантируемые летально облученным сингенным реципиенетам, не формируют колоний кроветворных клеток в селезенке облученных животных [55]. Однако при их совместной трансплантации клетки фенотипа SC-1- образуют колонии в селезенке летально облученных мышей. Хелперами селезеночного колониеобразования являются ПТЛ [43, 55, 56, 57] фенотипа CS-1 + [55, 58].

Экспрессию антигенов Sca-1 и Sca-2 на Т-лимфоцитах, ранее считавшихся антигенами СКК, определили и другие исследователи [59].

Вспомогательная активность ПТЛ в селезеночном ко-лониеобразовании впоследствии была подтверждена многими исследованиями. Более того, оказалось, что хелперная активность ПТЛ опосредуется через растворимые продукты, секретируемые этими клетками в надосадочную жидкость [60, 57,]. Определение мембранных структур, экспрессируемых взаимодействующми клетками, показало, что ПТЛ характеризуются фенотипом Ig-, Thy-1+, Sc-1+, CD3-, L3T4+, Lyt-2+, IL-2R+, фенотип СКК - Ig-, Thy-1-, SC-1-, L3T4-, Lyt-2-[61, 62, 63, 64, 133]. Анализ механизмов регуляции колониеобразования в селезенке СКК, привел к заключению, что в кооперации, по-видимому, участвуют три типа клеток: СКК фенотипа SC-1-, зрелые Т-клетки костного мозга, проти-моциты фенотипа SC-1 + [57]. Содержание среди тимоцитов хелперных клеток, по-видимому, небольшое. Оптимальный стимулирующий эффект, по данным разных авторов, колеблется при соотношении костномозговых и тимических клеток от 1:200 до 1:250.

СКК различаются чувствительностью ответов на активирующее действие лимфоцитов Т-ряда. Так, было показано, что на стимуляцию тимоцитами отвечает лишь часть колониеобразующих клеток с плотностью >1,075 г/см-3 [65]. Более того, определили, что на действие тимоцитов отвечает лишь ~50% СКК, выживших после обработки антимозговой сывороткой, составляющее ~10% от числа СКК, содержащихся в костном мозге мышей.

Помимо незрелых клеток Т-ряда с хелперной активностью, в селезенке и тимусе [66], а также в костном мозге мышей [66, 67] обнаружены клетки с супрессорной активностью, подавляющие образование колоний СКК костного мозга и имеющие фенотип Lyt-1-, Lyt-2+, L3T4+ [67]. Супрессорные клетки экспрессировали также на мембране антиген I-J [66]. В-лимфоцитарная зависимость процессов пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Хелперное действие В-лимфоцитов

Как отмечалось выше, В-лимфоциты не обладали способностью изменять характер дифференцировки СКК, однако они проявляли выраженную вспомогательную активность в процессах взаимодействия СКК-Т-лимфоцит. Регуляторное действие В-лимфоцитов и способность этих клеток оказывать хелперную активность были впервые обнаружены нами и опубликованы в 1978 г. [68]. В исследованиях одного из направлений, развивавших обнаруженный факт, было показано, что удаление В-лимфоцитов из взвеси клеток лимфатических узлов с помощью анти-В-сыворотки (АВС) и комплемента резко снижало дифференцирующую активность Т-лимфоцитов. При трансплантации летально облученным реципиентам (CBAxC57BL/6J)Fn клеток костного мозга мышей линии СВА и анализе селезеночных колоний на 7-8-е сутки после облучения отношение Э/Г характеризовалось стандартными параметрами и составляло 1,8. В присутствии сингенных Т-лимфоцитов лимфатических узлов характер дифференцировки СКК изменялся, как и в выше описанных экспериментах, с преимущественно эрит-роидного на преимущественно гранулоцитарный путь развития, отношение Э/Г падало с 1,8 до 0,1. Однако обработка клеток лимфатических узлов АВС и комплементом приводила к заметному снижению дифференцирующей активности Т-лимфоцитов, отношение Э/Г с 0,1 повышалось до 1,0. Аналогичный результат получили при обработке клеток лимфатических узлов анти-Т-сывороткой (АТС) и комплементом, отношение Э/Г увеличилось с 0,1 до 1,0. Однако в случае трансплантации облученным реципиентам клеток костного мозга в смеси с сингенными лимфоцитами, обработанными АВС и комплементом и лимфоцитами, обработанными АТС и комплементом, отношение Э/Г восстановилось и составляло 0,1. Следует отметить, что во всех группах опытов изменяется, в основном, число эритроидных колоний. Рост колоний гранулоцитарного и мегакариоцитарного типов является стабильным. Поэтому сдвиг дифференцировки СКК носит относительный характер. Поскольку ни АВС, ни АТС полностью не отменяли дифференцирующую функцию Т-лимфо-цитов, предположили, что среди Т-лимфоцитов имеются, по меньшей мере, две фракции клеток, одна из которых не нуждается во вспомогательном действии В-лимфоцитов. С В-лимфоцитами, по-видимому, взаимодействует фракция предшественников Т-лимфоцитов, не элиминируемых АТС и комплементом [69].

В последующих экспериментах эти предположения полностью подтвердились. С помощью препаративного электрофореза были выделены 2 фракции Т-лимфоцитов. Одна из них, Т-лимфоциты со средней и высокой электрофоретической подвижностью, непосредственно взаимодействовала с СКК и направляла их дифференцировку по пути гранулопоэ-за (Э/Г 0,3-0,5). В-лимфоциты на дифференцирующую активность этих фракций Т-лимфоцитов не влияли. Другая группа Т-клеток (с низкой электрофоретической подвижностью) фактически не влияла на дифференцировку СКК (Э/Г 1,1), но в присутствии В-лимфоцитов проявляла такую же активность, как и Т-лимфоциты со средней или высокой электрофоретической подвижностью, Э/Г составляло 0,2-0,3 [70]. Как и в ранее проведенных экспериментах, В-лимфо-циты, сингенные или аллогенные, в отсутствие Т-лимфоцитов не проявляли дифференцирующую активность. В отличие от Т-лимфоцитов, тропных к лимфатическим узлам и к селезенке (см. выше) и проявлявших различное дифференцирующее действие на СКК [33], В-лимфоциты из лимфатических узлов и селезенки характеризовались одинаковой вспомогательной активностью [70]. Как оказалось, хелпер-ное действие В-клеток не подвержено генетическому ограничению [с Тd гаплотипа H-2k с равной степенью эффективности взаимодействовали В-хелперы гаплотипов H-2k, H-2b и H-2d), проявляется не только в процессах селезеночного колониеобразования, но и в процессах формирования колоний в костномозговой полости облученных мышей. В костномозговой полости Т-лимфоциты снижали соотношение Э/Г с 0,5 до 0,3, в присутствии В-лимфоцитов - до 0,1.

Обнаруженная нами В-лимфоцитарная зависимость Т-лимфоцитарного контроля функций СКК неоднократно обобщалась в литературе [12, 61, 64, 68], включая проблему хелперного действия В-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки СКК, не ограниченного генетическим комплексом Н-2 [70]. Не ограниченное комплексом Н-2 стимулирующее действие В-лимфоцитов на пролиферативную активность СКК впоследствии было подтверждено и другими авторами [71].

В-лимфоцитарная зависимость процессов пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Супрессорное и контрсупрессорное действие В-лимфоцитов

В процессе разработки В-лимфоцитарной регуляции функций СКК было установлено, что при фракционировании костного мозга и удалении фракций зрелых Т- и В-лим-фоцитов, предшественников Т-лимфоцитов [ПТЛ), а также прилипающих к пластику клеток, выделенная фракция СКК не образует колоний кроветворных клеток в селезенке облученных реципиентов. Для индукции колониеобразования, помимо очищенной фракции СКК, необходимо включение в трансплантат сингенных В-лимфоцитов или ПТЛ. Однако при добавлении В-лимфоцитов к сингенному трансплантату, содержащему помимо СКК фракцию ПТЛ, также обладающих по отношению к СКК хелперной активностью, отсутствовал как хелперный, так и аддитивный эффект. Более того, регистрировалась супрессия образования колоний [61].

Проведенный анализ хелперной и супрессорной активности В-лимфоцитов из разных тканей показал, что наибольшей хелперной и наименьшей супрессорной активностью обладают В-клетки костного мозга. В-лимфоциты селезенки хелперную активность не проявляют, но обладают резко выраженной супрессорной активностью, обеспечивающей практически полное подавление колониеобразующей способности сингенных СКК. В-лимфоциты лимфатических узлов по этим показателям занимают промежуточное положение между В-клетками костного мозга и селезенки [72].

При обработке В-лимфоцитов специфической антисывороткой к антигену В-клеток MBLA и комплементом наблюдали отмену хелперной активности клеток костного мозга и лимфатических узлов, но проявление такой активности в популяции В-лимфоцитов селезенки. Сравнительная оценка супрессорной и хелперной активности обработанных анти-В-сывороткой В-лимфоцитов зарегистрировала изменение супрессорной активности В-лимфоцитов селезенки на хелперную и резко усилила супрессорную активность В-клеток костного мозга и лимфатических узлов, обнаружив наличие контрсупрессорной активности в необработанных популяциях В-лимфоцитов лимфатических узлов и костного мозга. Иначе говоря, популяции В-лимфоцитов всех использованных тканей содержали в своем составе как хелперные, так и супрессорные клетки. При этом хелперная активность превалировала над супрессорной, что проявлялось при обработке взвесей В-лимфоцитов специфической антисывороткой, направленной против В-клеток [64]. Активация костномозговых В-лимфоцитов Т-зависимым [эритроциты барана), но не В-зависимым антигеном [ЛПС) усиливала их супрессорную активность [63]. В отличие от костномозговых В-лимфоцитов, активация В-лимфоцитов селезенки указанными антигенами не влияла на проявление их супрессорной активности, но в присутствии зрелых Т-лимфоцитов в виде примеси к СКК индуцировала проявление хелперного действия селезеночных В-лимфоцитов, особенно выраженное при активации клеток ЛПС [62].

Макрофагальная зависимость дифференцировки стволовых кроветворных клеток

Трансплантация летально облученным реципиентам [CBAxC57BL)F1 клеток костного мозга мышей линии СВА в смеси с клетками системы мононуклеарных фагоцитов сопровождалась сдвигом дифференцировки СКК с преимущественно эритроидного на преимущественно гранулоцитарное направление кроветворения. Эффект не зависел от локализации и происхождения фагоцитов [моноциты периферической крови, макрофаги лимфатических узлов, перитонеальные макрофаги, клетки макрофагоподобной линии J-774) и от их генетической идентичности с клетками костного мозга -сингенные, аллогенные и ксеногенные [73]. При блокаде клеток системы мононуклеарных фагоцитов кремнеземом дифференцировка СКК развивается в преимущественно эритроидном направлении [74].

Миграция и рециркуляция стволовых кроветворных клеток

Для изучения процессов миграции и рециркуляции СКК был разработан [Р.В. Петров, Р.М. Хаитов), апробирован и внедрен в экспериментальные исследования ряд модельных систем. Они представляют собой комбинацию методов с экранированием свинцовым экраном участка костного мозга [источник СКК) при облучении мышей в летальной дозе, адреналэктомией, тимэктомией или спленэктомией и визуальным подсчетом числа колоний кроветворных клеток, формируемых СКК, в селезенке, микроскопическим подсчетом численности СКК на гистологических препаратах [серийные срезы тканей разных органов - селезенки, костного мозга и др.) или путем определения в различных тканях реципиентов размножающихся донорских клеток, выселяющихся из экранированного участка костного мозга или экзогенно введенных и идентифицируемых по хромосомному маркеру Т6Т6.

Миграция и рециркуляция стволовых кроветворных клеток, идентификация выселяющихся из костного мозга кроветворных клеток-предшественников

Для определения параметров миграции и рециркуляции СКК использовали парабиотически соединенных сингенных мышей линии СВА, одна из которых несла хромосомный маркер Т6Т6. До операции одного из партнеров [мыши СВА-Н) облучали тотально ш-лучами в летальной дозе [850 Р), второму партнеру [мыши СВА-Т6Т6) при летальном облучении экранировали участок костного мозга. Через 12-14 сут после облучения в селезенке тотально облученного парабионта [мыши СВА-Н) определяли численность [по числу селезеночных колоний) и происхождение СКК [по хромосомной метке). В более поздние сроки [30-60 сут) с помощью хромосомного маркера Т6Т6 у мышей СВА-Н определяли репопуляцию стволовыми клетками тканей тимуса, лимфатических узлов, селезенки и костного мозга. Проведенный анализ показал, что у летально облученных мышей СКК быстро репопули-руют гемопоэтические ткани вследствие их миграции из защищенного участка костного мозга в периферическую кровь, циркуляции в организме и заселения облученных тканей [75]. Показано, что все селезеночные колонии у мышей СВА-Н несли хромосомный маркер Т6Т6 и были образованы СКК, мигрировавшими из экранированного участка костного мозга. Таким же происхождением характеризовались СКК, репопулировавшие кроветворные и лимфоидные органы тотально облученного парабионта. Темп выселения СКК из экранированного участка костного мозга не снижался, по меньшей мере, в течение 24 час. Установлена прямая зависимость между количеством защищенных свинцовым экраном клеток, числом выселяющихся в кровоток СКК и выживаемостью облученных мышей [4, 75]. Доказано, что восстановление животных после облучения происходит благодаря миграции и рециркуляции СКК, но не гуморальной стимуляции со стороны необлученных участков костного мозга [36, 75].

Использование этой системы с облучением ранее экранированного участка костного мозга и защитой ранее облучавшейся остальной поверхности тела в различные периоды времени после первого сеанса облучения дало возможность количественно установить численность СКК, выселяющихся из костного мозга за различные временные интервалы. Показано, что число колоний в селезенке зависит от времени между облучением и подсчетом их числа и определяется количеством мигрировавших за это время СКК в селезенку [36]. Доказан контроль миграции СКК со стороны генов главного комплекса гистосовместимости [11, 36].

Т-лимфоцитарный и тимический контроль миграции и дифференцировки стволовых кроветворных клеток

У половозрелых мышей [СВАxC57BL/6J]F1 удаляли тимус и в разные сроки [14-56 сут]. После этого животных облучали в летальной дозе с экранированием участка костного мозга [1/2 голени]. Через 8-9 дней после облучения в селезенке мышей считали число макроколоний, а на ее серийных срезах - число колоний разных гистологических типов. У тимэктомированных мышей, по сравнению с ложнооперированными, наблюдали резкое угнетение миграции СКК из экранированного участка костного мозга и практически полное торможение их гранулопоэтической, но не эритропоэтической дифференцировки, число колоний эритроидного типа не изменилось. Результатом этого явилось существенное увеличение соотношения колоний эритроидного и гранулоцитарного типов [Э/Г] - с 1,8 до тимэк-томии до 5,5 - на 14 сутки и до 17,2 - на 30 сутки после удаления тимуса. Инъекция таким мышам тимозина или трансплантация сингенных клеток тимуса или лимфатических узлов полностью нормализовала процессы миграции СКК и характер их дифференцировки, сопоставимый с таковой контрольных мышей - отношение Э/Г снижалось с 17,2 до 1,7 [76].

Сходные данные зарегистрированы у стареющих мышей [СВАxC57BL/6J]F1 с возрастной инволюцией тимуса - снижается число СКК, мигрирующих из экранированного при летальном облучении участка костного мозга [1/2 голени] в селезенку и увеличивается соотношение Э/Г - с 1,9 у 2-месячных мышей до 5,7 - у 7-месячных и до 15,8 -у 26-месячных [39].

На основании полученных данных было заключено, что процессы миграции СКК находятся под совместным контролем - тимическим и Т-лимфоцитарным [36]. Более того, как отмечалось выше, под контролем Т-системы иммунитета находятся и другие важные функции СКК - процессы их пролиферации, дифференцировки и самообновления [12].

Гормональный контроль миграции стволовыхкроветворных клеток

Изучали влияние гипофиз-адреналовой системы на процессы миграции и рециркуляции СКК. Использовали мышей [CBAxC57BL/6J]Fn с экранированным участком костного мозга [стопа, * голени или задняя конечность до коленного сустава] во время летального облучения. Двусторонняя ад-реналэктомия за 2-7 сут до лучевого воздействия сопровождалась резким снижением уровня 11 -оксикортикостероидов в плазме крови и существенным усилением миграции СКК [77]. При этом состояние гипокортицизма не влияло на характер дифференцировки СКК [78], а регистрируемый эффект не зависел от объема экранированного костного мозга [79]. Аналогичный эффект наблюдали при сублетальном облучении мышей за 1-2 дня до удаления надпочечников или через 7 сут после операции [78, 79]. Вместе с тем, удаление надпочечников не влияло на репопуляцию селезенки летально облученных мышей F1 экзогенными стволовыми клетками и не стимулировало их размножение. Таким образом, было установлено, что кортикостероидные гормоны оказывают выраженное угнетающее действие на процессы эмиграции из костного мозга и рециркуляции эндогенных СКК. При снижении гормонального уровня эти процессы заметно интенсифицируются [36].

Справедливость такого заключения была подтверждена результатами экспериментов, проведенных на мышах с ги-перкортицизмом, индуцированным подкожными повторными инъекциями адренокортикотропного гормона [АКТГ] пролонгированного действия. Повышение уровня гормона в крови вызывало резко выраженное угнетение миграции СКК из экранированного участка костного мозга в селезенку [80]. Сходные данные были получены в опытах с введением АКТГ сублетально облученным мышам [81 ]. Более того, у оппозит-ных по уровню кортикостерона в крови линий мышей СВА и C57BL/6J выявили обратную зависимость между содержанием гормона в крови и интенсивностью миграции СКК [78]. Оказалось, что повышение уровня гормона в крови приводит также к сдвигу дифференцировки СКК в направлении грану-лопоэза. Таким образом, состояние гипокортицизма, индуцированное адреналэктомией, стимулирует процессы миграции СКК, тогда как состояние гиперкортицизма, вызванное введением АКТГ пролонгированного действия, угнетает миграцию СКК из костного мозга. Иначе говоря, процессы миграции СКК в организме находятся под гормональным контролем и зависят от уровня глюкокортикоидов в крови, определяемого гипо-физ-адреналовой системой. Подробный анализ этих данных проведен в работах [21, 36].

В целом, результаты проведенных исследований показывают, что процессы миграции СКК контролируются не только Т-системой иммунитета, но и гипофиз-адреналовой.

Роль гуморальных факторов в функциональной активности стволовых кроветворных клеток

Наряду с известными факторами, влияющими на функции СКК, такими как эритропоэтин, интерлейкин-3, колониестимулирующие факторы и др., осуществлялись попытки идентификации растворимых продуктов регуляторных клеток, контролирующих рассмотренные выше функции СКК. Так, А.М. Поверенный [43] и Т.Н. Семенец [82] зарегистрировали действие на СКК, наряду с отмеченным эффектом тимозина и интерлейкина-3, интерлейкина-2, а также супрессорных факторов, вырабатываемых Т-лимфоцитами стимулированными митогенами КонА и ФГА [43, 44] Роль тимозина в Т-лимфоцитарном контроле дифференцировки СКК регистрировалась и в наших исследованиях [32]. А.А. Ярилиным, помимо уже упоминавшегося интерлейкина-2, впервые были выявлены и описаны гуморальные факторы стимулирующего и ингибирующего действия - продукты предшественников Т-лимфоцитов (ПТЛ), оказывающие влияние на функции СКК [57, 60]. В работе [83] описаны активированные Т-лимфоциты в качестве источника факторов, регулирующих СКК.

Изучение цитокиновой регуляции функций гемопоэти-ческих клеток-предшественников показало также стимулирующее действие интерлейкина-1 на колониеобразующую функцию СКК [84]. Однако в этом случае не исключается опосредованное действие интерлейкина-1 через активность ряда факторов, секретируемых под его влиянием. Показана, например, секреция Т-лимфоцитами колониестимулирующих факторов под влиянием интерлейкина-1, действующих на гемопоэтические клетки [85]. Сходным действием на колониеобразующую способность СКК характеризуется TNF-a - фактор некроза опухоли-альфа [86].

При разработке проблемы В-клеточной регуляции функций СКК было установлено, что хелперное и супрессорное действие В-лимфоцитов на СКК опосредуется, как и в случае Т-лимфоцитарного контроля, через секретируемые ими продукты неиммуноглобулиновой природы. Это было доказано при использовании надосадочной жидкости В-лимфоцитов разной органной локализации, надосадочной жидкости полученных В-клеточных гибридом на основе В-лимфоцитов селезенки или лимфатических узлов, надосадочной жидкости не вырабатывающей иммуноглобулины клеток миеломы, а также выделенных из надосадочной жидкости и очищенных иммуноглобулинов [61, 64].

При анализе клеточных факторов, определяющих функционирование СКК, является очевидной их множественность. Помимо описанных выше клеточных субпопуляций трех основных систем (Т-системы, В-системы, системы клеток мононуклеарных фагоцитов), регуляторное действие на функции СКК оказывают естественные киллеры [30, 87, 88, 89, 90], описано стимулирующее действие эритробластов на колониеобразующую активность СКК [91].

Один из механизмов взаимодействия СКК с регуляторными клетками может включать их прямое взаимодействие по типу рецептор-лиганд, как в случае Т-В-взаимодействий при индукции иммунного ответа, определяемое, например, особенностями молекул главного комплекса гистосовместимости взаимодействующих клеток. Такое взаимодействие может быть индуцирующим, определяющим последующие функции взаимодействующих клеток, включая и продукцию цитокинов регуляторными клетками. Экспрессия СКК различных рецепторных структур, лигандами для которых являются множественные продукты гистологически разных клеточных типов, может определяться степенью их коммитированности, тогда как разная продукция цитокинов различными клеточными типами может определять необходимость их существенного пополнения за счет СКК при тех или иных возникающих потребностях организма.

Однако не может быть исключена и зависимость проявления различных функций СКК от конститутивно продуцируемых регуляторными клетками растворимых продуктов. Множественность цитокинов, продуцируемых гистологически разными клеточными элементами, описана [92, 93] и продолжает изучаться.

Лимфоцитарный контроль пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток, взаимодействующих с аллогенными лимфоцитамим. Роль тимуса, Т- и В-лимфоцитов

Взаимодействие СКК и несингенных лимфоцитов, не только аллогенных, но и ксеногенных, является важнейшей составной частью открытия Р.В. Петровым и Л.С. Сеславиной явления взаимодействия СКК и лимфоцитов. Этой проблеме посвящено большое количество публикаций в отечественной и зарубежной литературе, вскрытые механизмы явления и сформулированные на их основе заключения неоднократно публиковались и обобщались в обзорных работах [8, 16, 21, 94, 95]. Ограничимся лишь теми публикациями, как и в случае взаимодействия СКК с сингенными лимфоцитами, которые имеют наибольшее значение для фундаментальной и прикладной иммунологии и клеточной трансплантологии.

Феноменология явления заключается в том, что лимфоциты, взаимодействуя с несингенными СКК в культуре клеток in vivo (в организме летально облученного реципиента), блокируют процессы их пролиферации и дифференцировки. Инактивированные лимфоцитами СКК не образуют колонии в селезенках реципиентов, обычно определяемых на 7-9 сутки после летального облучения реципиентов и трансплантации им клеток. Процессы инактивации СКК лимфоцитами, выделенными из разных тканей, развиваются при сочетании различных несингенных друг другу генотипов, так же как и при использовании облученных реципиентов разных генотипов [7, 8, 94, 96]. Колонии не образуются также в костномозговой полости облученных реципиентов [18]. Анализируемые с помощью хромосомного маркера (Т6Т6) клетки генотипа донорского костного мозга в тканях реципиента не выявляются [11, 35, 97]. Инактивации лимфоцитами подвергаются также аллогенные СКК эндогенного происхождения, определяемые в селезенке на 7-9 сутки после сублетального облучения мышей [34]. В большинстве опытов, за исключением тех, в которых решались проблемы изучения специальных механизмов клеточных взаимодействий, донорами костного мозга (источник СКК) были мыши линии С57BL/6J, донорами клеток тимуса или лимфатических узлов (источник лимфоцитов) были мыши линии CBA, летально облученными реципиентами служили мыши (CBAxC57BL/6J)Fr в селезенках которых определяли колониеобразующую способность костномозговых СКК.

Как и в случае Т-лимфоцитарного контроля функций сингенных СКК, было показано, что процессы миграции, пролиферации и дифференцировки несингенных СКК контролируются зрелыми, резистентными к действию кортизона и к тимэктомии во взрослом состоянии Т-лимфо-цитами, выявляемыми в костном мозге, периферической крови, тимусе, селезенке, лимфатических узлах и в перитонеальном экссудате нормальных мышей [21, 95, 98, 99 100, 101], В-лимфоциты инактивирующей способностью не обладают, но проявляют хелперную активность [68]. Оказалось при этом, что среди Т-лимфоцитов, как и в экспериментах, описанных выше, обнаруживаются по меньшей мере, две субпопуляции эффекторных Т-лим-фоцитов. Одни из них инактивируют несингенные СКК без помощи В-клеток, другие инактивируют несингенные СКК только в результате взаимодействия с сингенными В-лимфоцитами. Проведенные исследования обобщены в работе [21 ].

При изучении механизмов взаимодействия СКК с несин-генными Т-лимфоцитами было доказано, что процессы инактивации несингенных СКК не опосредуются через реакцию «трансплантат против хозяина» [102] и осуществляются живыми несенсибилизированными Т-лимфоцитами при первичном контакте с генетически чужеродными клетка-ми-предшественниками [97]. Активация Т-эффекторов изоантигенами генотипа доноров костного мозга [103], но не посторонними гетерологичными корпускулярными или растворимыми антигенами (эритроциты барана, яичный альбумин, бычий сывороточный альбумин, нормальная лошадиная или кроличья сыворотки [97, 103], усиливает процессы взаимодействия несингенных клеток и сопровождается процессами инактивации несингенных СКК существенно меньшим количеством лимфоидных клеток.

В 1968 г. Р.В. Петров высказал предположение о том, что инактивирующее или тормозящее действие лимфоцитов на несингенные СКК может распространяться и на другие клетки-предшественники, обладающие признаками стволовых элементов в смысле их способности размножаться и дифференцироваться в зрелые формы. Детальный анализ клеток-предшественников, мишеней инактивирующего действия несингенных Т-лимфоцитов, представил доказательства, полностью подтверждающие это предположение. Оказалось, что СКК костного мозга в результате взаимодействия с аллогенными лимфоцитами утрачивают способность формировать колонии кроветворных клеток в селезенке и в костномозговой полости облученных реципиентов, а оставшиеся неинактивированными СКК изменяют характер их дифференцировки в сторону преимущественного образования колоний миелоидного типа [9]. Как отмечалось выше, с помощью хромосомного маркера Т6Т6 доказано, что размножающиеся клетки инактивируемого генотипа не обнаруживаются в селезенке, в костном мозге, тимусе и в лимфатических узлах реципиента. С помощью различных методических приемов установлено, что в результате межклеточных взаимодействий инактивируются предшественники продуцентов антител, определяемые методом Кеннеди в селезенке на серийных срезах [104] и их потомки, определяемые методом Ерне в клеточной популяции спленоцитов [105]. Инактивации подвергаются остеобласты и клетки, формирующие очаги кроветворения в костномозговой полости облученных животных [106]; фетальные СКК печени [107] и опухолевые клетки [108]; клетки селезенки, индуцирующие реакцию «трансплантат против хозяина» [109]; гемоглобин-образующие клетки [110] и др.

На основании анализа имеющихся данных сделано заключение, что феномен взаимодействия несингенных клеток, сопровождающийся инактивацией лимфоцитами несингенных СКК имеет общее значение, развивается против разнообразных активно пролиферирующих клеток-предшественников не только в любом участке кроветворной системы, но и в других участках организма. При этом учет эффекта инактивации несингенных клеток осуществляется различными методами -по блокированию той или иной функциональной активности клеточных элементов или по элиминации того или иного гистологического типа клеток [16].

Характеристика эффекта взаимодействия лимфоцитов с несингенными СКК показала, что основные процессы, обеспечивающие инактивацию функций СКК лимфоцитами, осуществляется в пределах одного часа после трансплантации реципиентам клеточной смеси [111, 112]. По-видимому, в этот период времени развиваются первичные процессы взаимодействия трансплантированных клеток. Последующие этапы этого сложного, развивающегося во времени процесса включают колонизацию тканей облученного реципиента, перераспределение клеток, активацию лимфоцитов со стороны изоантигенов облученного генетически чужеродного реципиента и клеток-мишеней, инактивацию СКК. Колонизация тканей лимфоцитами происходит быстро и завершается за 3-4 часа. Процессы колонизации сменяются процессами перераспределения лимфоидных клеток, которые завершаются за 3-4 суток и приводят к накоплению лимфоцитов в селезенке. В эти сроки и развивается собственно процесс инактивации СКК Т-лимфо-цитами, завершающийся очень быстро - в течение 1-3 дней, как в селезенке, так и в костном мозге реципиентов [113].

Трансплантация облученным реципиентам генетически несовместимых клеточных взвесей, содержащих как СКК, так и лимфоциты обоих генотипов, сопровождается, как правило, преимущественной инактивацией СКК одного из генотипов смеси клеток [11, 21, 96, 97]. Изучение генетического контроля процессов взаимодействия несингенных СКК и лимфоцитов, показало уникальность феномена, отличающего его от известных проявлений клеточного иммунитета, контролируемых главным комплексом гистосовместимости Н-2 у мышей[114, 115, 116]. Использование огромного спектра различных линий и гибридных мышей разных гаплоти-пов, а также мутантных, рекомбинантных и конгенных линий привело Р.В. Петрова и коллектив, руководимых им иммунологов и иммуногенетиков к заключению о том, что проявление эффекта инактивации СКК лимфоцитами контролируется генетическими структурами как комплекса Н-2, так и не Н-2-комплекса. При этом различия по не Н-2 комплексу даже более значимы для проявления эффекта, по сравнению с различиями только по комплексу Н-2. Иначе говоря, проявление эффекта не определяется преимущественным контролем со стороны главного комплекса гистосовместимости и зависит от еще некартированных генов, не сцепленных с комплексом Н-2 мышей [114, 115, 116].

Заключение

В заключение следует отметить, что полученный массив данных представляет собой не только фундаментальное обоснование принципиальной возможности целенаправленной регуляции функций стволовых клеток [СК), но и выполненные на их основе практически значимые разработки прикладного характера.

Одной из них является формулирование вывода о нецелесообразности лечения лучевых поражений и других состояний, требующих пересадки СКК, смесью клеток от нескольких генетически различающихся доноров, как это предлагалось делать в клинике, из-за взаимной инактивации СКК. Эта проблема изложена в работе Р.М. Хаито-ва [117].

Другой аспект связан с использованием явления инактивации СКК лимфоцитами для поиска веществ направленного лимфотропного действия. Неоднократно демонстрировалось, что эффект инактивации СКК лимфоцитами имеет место не только в системе экзогенного, но и эндогенного колониеобразования [34, 117], т.е. возможен количественный учет реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ) по числу инактивируемых лимфоцитами СКК эндогенного происхождения. Совершенно очевидно, что такая система характеризуется двумя одновременно протекающими процессами -размножением эндогенных СКК и инактивацией их Т-лим-фоцитами. Оба процесса могут быть количественно учтены путем подсчета численности колоний в селезенках животных соответствующих групп. Это дает возможность в одном эксперименте количественно сравнить два наиболее важных критерия иммуномодуляторов различной природы, включая иммунодепрессанты и цитостатики: действие, направленное на подавление пролиферации стволовых клеток [митостатический эффект) и истинно иммунодепрессивное действие [лимфотоксический эффект), направленное на Т-инактивирующие лимфоциты и обеспечивающее отмену их инактивирующей способности. Эти принципы были использованы для разработки экспериментальных систем с целью оценки митостатических и лимфотоксических свойств препаратов различной природы, а также оценки активности препаратов, обеспечивающих отмену действия инициирующих РТПХ лимфоцитов [38, 119, 120, 121]. В разработанных системах испытанные препараты характеризовались активностью, определяемой по теоретически ожидаемым результатам [12].

Еще один аспект разрабатываемой проблемы регуляции функций СКК был использован для оценки эффекторных функций Т-лимфоцитов разных животных, в том числе крупных, при различных иммунозависимых патологических состояниях или при разного рода воздействиях. Заключение о том, что взаимодействие СКК с лимфоцитами генетически не ограничено и инактивация СКК развивается не только при использовании аллогенных, но и ксеногенных лимфоцитов [122, 123], индуцировало разработку новой экспериментальной системы. В этом случае летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]Fn трансплантировали только клетки костного мозга мышей линии C57BL/6J или клетки костного мозга мышей C57BL/6J в смеси с лимфоцитами тех или иных животных. По числу колоний, определяемых в селезенке реципиентов через 7-9 суток после трансплантации клеток, судили об инактивирующей активности эффек-торных Т-лимфоцитов. Оказалось, что функции пролиферации и дифференцировки СКК мышей подвергаются инактивирующему действию лимфоцитов собак, овец, кур, морских свинок, крыс [124, 125] и даже человека [126].

Сходная система использовалась в экспериментах с трансплантацией лимфоцитов взрослых кур в смеси с ал-логенными гемопоэтическими клетками на хориоалланто-исную мембрану 10-11-дневных куриных эмбрионов, син-генных донорам лимфоидных клеток. Взаимодействуя с несингенными гемопоэтическими клетками, лимфоциты блокируют их функциональную активность [127]. Это дает возможность характеризовать активность лимфоцитов при разных иммунозависимых патологических состояниях или при различных воздействиях.

Одной из тенденций современного научного сообщества в области медицины и биологии, наблюдаемой в течение ряда последних лет, является возврат существенного интереса к стволовым клеткам [СК] и, в частности, к СКК. Этот возврат определяется открывшимися возможностями клонирования растений и животных, перспективой управления процессами размножения и дифференцировки СК с целью их использования для получения массива клонированных популяций, необходимых для применения в качестве терапевтического средства для лечения гематологических и негематологических заболеваний. Имеется в виду не только терапия лейкозов, но и таких заболеваний, как инсулин-зави-симый сахарный диабет [I типа], ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера и др. Клинические перспективы клеточной терапии с использованием СК и определяемые биологические основы проблемы являются предметом многих дискуссий и обобщений [128, 129, 135].

Не менее интригующей проблемой, практическое решение которой видится в весьма далекой перспективе, является управление функциями СК с целью получения массивов ткани и даже отдельных органов в целях практической медицины. Заключительные этапы этих проблем, по-видимому, являются скорее биотехнологическими проблемами, чем фундаментальными, однако доведение их до практического приложения требует огромных усилий экспериментального характера. Понимание этих задач обусловило проведение множественных исследований, направленных на разработку проблем разного уровня - от обозначения СК разной степени коммитированности [129, 130, 131] и теории специальных ниш, обеспечивающих поддержание СК во взрослом организме в течение неопределенно долгого периода времени и определяющего их функции с помощью определенных сигналов [130, 132], до определения маркерных структур СК на их поверхности, условий поддержания СК в функциональном состоянии, характеристики функций, попыток использования СК в клинической практике [128, 132, 135]. Многие из этих проблем обозначены в монографии Р.М. Хаитова [36], многие дискутируются [133, 131].

Наиболее обсуждаемой проблемой является пластичность СК, определяемая как способность генетически маркированных СК одного органа, например, половозрелой мыши, обеспечивать после трансплантации рост клеток других органов, противореча тем самым установившейся закономерности о линейной ограниченности СК половозрелых млекопитающих [131]. Это обнажает проблему непредсказуемости потенциала пластичности и возможности диффе-ренцировки СК в совершенно ином, непредвиденном, направлении, например, в сторону формирования опухолевых клеток, определяемом, в частности, отсутствием репрессор-ных или контролирующих факторов сингенного организма. Степень контролируемости «вредной» для организма диф-ференцировки СК и последующего размножения данного клона клеток при функционировании СК в генетически несовместимом организме совершенно не ясна. Является очевидным, что на современном уровне знаний не только не снимаются, но и продолжают быть актуальными такие проблемы, как проблемы взаимодействия СК с клетками организма [син-генными - при трансплантации СК сингенным реципиентам и с несингенными - при трансплантации СК генетически чужеродным реципиентам], контролирующими, как это было показано выше, основные функции СКК.

Обозначенные проблемы, как уже отмечалось, подлежат дальнейшей разработке. Однако вне зависимости от результатов этих исследований является очевидной значимость накопленных данных по регуляции основных функций СКК клетками системы иммунитета для решения проблем терапевтического применения СК, стоящих на повестке сегодняшнего дня.

Подняться вверх сайта