Поиск Кабинет

Лечебный эффект системной трансплантации культивируемых аутогенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных с резистентными формами туберкулеза легких

Гены & Клетки: Том II, №1, 2007 год, стр.: 77-80

 

Авторы

Васильева И.А., Коноплянников А.Г., Ерохин В.В., Цыб А.Ф., Багдасарян Т.Р., Даниленко А.А., Лепехина Л.А., Кальсина С.Ш., Семенкова И.В., Агаева Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Известно, что системная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) может способствовать развитию репаративных процессов в различных поврежденных тканях, в том числе и в ткани легкого. Это послужило основанием для нашего исследования, в котором изучали эффект системной трансплантации (внутривенного введения) аутогенных МСК при проведении комплексной терапии больных с резистентными формами туберкулеза легких. В нашем исследовании, начатом три года назад, под наблюдением находится 27 больных с туберкулезом легких, из которых 15 пациентов относились к категории MDr (multidrug resistance), а 12 пациентов — к категории X-DR (X-drug resistance). Все больные являлись бактериовыделителямис распространенными кавернозными процессами в легочной ткани, у 17 пациентов до включения в схему терапии системной трансплантации 150-200 млн размноженных в клеточной культуре МСК из аутогенного костного мозга был хронический туберкулез (продолжительность заболевания -от 13 месяцев до 5 лет), а у остальных 10 пациентов диагноз заболевания был поставлен за 6-12 месяцев до включения в схему лечения клеточной терапии. У всех пациентов предыдущее достаточно длительное специфическое противотуберкулезное лечение было безуспешным или недостаточно эффективным (среди них был 1 пациентс одним оперативно удаленным легким). После системной трансплантации аутогенных МСК пациентам продолжали проводить ранее начатую медикаментозную терапию. 16 пациентов наблюдаются после системной трансплантации МСК в течение 1,5-2 лет и более, а остальные 11 пациентов - не менее 6 месяцев. После введения МСК во всех 27 случаях наблюдался положительный клинический эффект; больные отмечали улучшение общего состояния, уменьшение одышки, значительное уменьшение или исчезновение слабости и недомогания, 24 пациента прибавили в весе. У 20 пациентов через 3-4 месяца после трансплантации аутогенных МСК отмечено стойкое прекращение бактериовыделения, а у 11 больных в дальнейшем наступило заживление длительно существующих каверн легочной ткани. В настоящий период у 9 из 16 больных, которым трансплантировали МСК 1,5-2 года назад, можно констатировать стойкую ремиссию туберкулезного процесса. У 6 пациентов этой группыы наблюдается существенная положительная бактериологическая и морфологическая динамика, только в 1 случае из 16 эффекттрансплантации МСКограничился непродолжительным клиническим улучшением. Таким образом, включение в курс противотуберкулезной терапии трансплантации размноженных в культуре аутогенных МСК может явиться перспективным способом повышения эффективности проводимой терапии у пациентов с резистентными формами туберкулеза легких.

Введение

Системное [внутривенное] введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в организм в настоящее время рассматривается как один из перспективных методов активизации репаративных процессов в поврежденных органах и тканях [1, 2]. Для легких оседание МСК в тканях документировано в ряде исследований [3, 4], однако проявления биологического эффекта клеточной терапии поврежденных легких с использованием МСК неоднозначны, а возможный терапевтический эффект практически не изучен [5-7]. Необходимость использования дополнительного воздействия на способность поврежденной легочной ткани к репарации в некоторых ситуациях весьма остра. К ним, несомненно, относятся ситуации лечения больных с резистентными формами туберкулеза. Мы уже сообщали о нашем первом опыте такой терапии [8], а в данной работе предпринята попытка обобщить некоторые из полученных результатов работы, которая ведется силами двух наших научных учреждений в течение последних 3 лет.

Материал и методы

Под наблюдением в нашем исследовании, начатом три года назад, находятся 27 больных с туберкулезом легких, из которых 15 пациентов относятся к категории MDR [multidrug resistance], а 12 пациентов - к категории X-DR (X-drug resistance). Лечение подобных больных представляет сложную терапевтическую задачу, обусловленную устойчивостью возбудителя заболевания к большинству противотуберкулезных препаратов, в т. ч. - к наиболее активным. По сути дела, MDR и, особенно, X-DR туберкулез сродни туберкулезу доантибактериальной эпохи, против которого нет эффективных средств этиотропной терапии.

Информация о поле, возрасте пациентов и продолжительности заболевания представлена в табл. 1. Распространенность патологического процесса в легких представлена в табл. 2.

Все пациенты после выявления заболевания подвергались специфическому лечению стандартными режимами химиотерапии, а после выявления лекарственной устойчивости возбудителя использовали схемы на основе резервных химиопрепаратов в соответствии с данными тестов на чувствительность микобактерий туберкулеза [МБТ]. Длительная комбинированная противотуберкулезная терапия у данной группы пациентов не оказала желаемого эффекта, больные перешли в категорию хронических с постоянным выделением мультирезистентных форм микобактерий и прогрессирующими воспалительно-деструктивными изменениями в легочной ткани. При этом, у 17 (63,0%) больных наблюдались фиброзные полости распада, которые, как правило, не поддаются терапевтическому лечению даже в случае сохранения чувствительности МБТ к химиопрепаратам.

В этой ситуации возникла необходимость дополнения проводимого лечения процедурой системной трансплантации аутогенных МСК, проводимой в рамках разработанного клинического протокола, утвержденного Учеными Советами двух учреждений и одобренного Этическим Комитетом ЦНИИТ РАМН, а также на основе информированного согласия каждого пациента. Исследование проводилось в рамках отраслевой программы «Новые клеточные технологии - медицине», утвержденной Президиумом РАМН 29 мая 2002 г.

Метод получения и размножения аутогенных МСК в необходимом для системной трансплантации количестве (порядка 150-200 млн клеток) в настоящее время разрешен Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗиСР РФ (лицензия ФС-2006/206). Описание этого метода уже представлено в публикации [3] и коротко сводится к следующему.

Клетки костного мозга (0,5-1 мл) получали путем пункции грудины или подвздошной кости пациента под местной анестезией в строго стерильных условиях, которые соблюдали в процессе всей дальнейшей работы с клетками в культуральном боксе. После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант из суспензии костномозговых клеток отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки переносили в среду 199 (здесь и далее указанные среды и посуда закупались в фирмах, уполномоченных на поставку МЗиСР РФ]. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин для получения осадка, который ресуспен-дировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды использовали среду RPMI-1640, содержащаую пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл], L-глютамин (2 мМ) и 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Культивирование проводили в пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см2, в которые вносили 5x106-l07 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали в термостат на 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см2), а впоследствии - при нарастании клеточной массы - с площадью дна 175 см2. Такой метод культивирования позволял к концу 5-6-й недели добиться получения популяции аутогенных МСК пациента в количестве (1,5-2)x108 клеток, необходимой для трансплантации в организм донора исходного костного мозга. Дополнительно проведенными исследованиями было показано, что полученные в условиях примененного в нашей работе способа культивирования клетки человека во всех исследованных случаях имели фенотип CD10low/CD34-/CD45-/CD105+/c-kitr, что характерно для клеток, относимых в настоящее время к МСК. Как мы уже сообщали ранее [3], в выполненных на лабораторных животных опытах была показана безопасность применения полученных таким способом культур МСК в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффектов.

Перед внутривенным введением пациентам клеток из полученных выращиванием в культуре популяций делался посев для контроля возможного бактериального загрязнения (его не было выявлено ни в одном случае). Для осуществления системной трансплантации 150-200 млн аутогенных МСК, размноженных в культуре, клетки взвешивались в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и путем постановки капельницы вводились пациенту в течение 40-60 минут. Примерно у 20% пациентов трансплантация МСК приводила к развитию слабой трансфузионной реакции (повышение в первые сутки температуры до 37,2-37,4°С, ломота, разбитость], которая не требовала дополнительного пособия и исчезала на следующие сутки. После системной трансплантации аутогенных МСК пациенты продолжали получать ранее назначенное медикаментозное лечение. Контроль за результатами лечения вели по динамике клинических проявлений заболевания, бактери-овыделения и специфических изменений в легких по данным рентгено-томографического и КТ исследований.

Результаты и их обсуждение

После системной трансплантации МСК из 27 пациентов 16 наблюдаются в течение 1,5-2 лет и более, а остальные 11 пациентов - не менее 6 месяцев. Спустя от 1 до 5 месяцев после введения МСК у всех 27 больных наблюдался положительный клинический эффект: улучшение общего состояния, уменьшение одышки, значительное уменьшение или исчезновение слабости и недомогания, 24 пациента значительно прибавили в весе и отмечали «прилив сил и энергии».

У всех больных на момент введения МСК отмечались воспалительные изменения в клиническом анализе крови: лейкоцитоз с увеличением палочкоядерной фракции, моноцитоз и /или лимфопения, ускорение СОЭ до 27-65 мм/ч. Через 1-2 месяца после трансплантации стволовых клеток показатели периферической крови улучшались: нормализовалось количество лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов, СОЭ снижалась до нормальных и субнормальных цифр (2-19 мм/ч).

Одним из наиболее важных критериев активности специфического процесса является бактериовыделение. У 20 (74,1%) больных, длительное время выделявших микобактерии туберкулеза, через 3-4 месяца после трансплантации аутогенных МСК отмечено стойкое прекращение бактери-овыделения, подтвержденное микробиологическими и молекулярно-генетическими методами.

Наиболее полную информацию о течении, характере и распространенности туберкулеза дают рентгено-томографи-ческие методы исследования. Так, у 11 (40,7%] больных в дальнейшем наступило заживление длительно существующих каверн в легочной ткани, в т. ч. числе фиброзных - в 7 наблюдениях. У 15 пациентов отмечалось выраженное рассасывание воспалительных изменений, частичное закрытие полостей распада и/или уменьшение их размеров при множественных деструкциях. В качестве примера заживления существующих более 2-х лет каверн в обоих легких приводятся рентгенограммы больной Б. до введения МСК и спустя 6 и 17 месяцев после него (рис.).

В настоящий период у 9 (56,3%) из 16 пациентов, которым трансплантировали МСК 1,5-2 года назад, можно констатировать стойкую ремиссию туберкулезного процесса с рассасыванием воспалительных и исчезновением деструктивных изменений в легких, у 6 (37,5%) - существенную положительную бактериологическую и морфологическую динамику. Лишь в одном случае из 16 эффект трансплантации МСК ограничился непродолжительным клиническим улучшением. Остальные 11 больных продолжают начатое ранее лечение, об эффективности которого можно будет судить спустя 12-1 5 месяцев.

Заключение

Таким образом, полученный в данном пилотном исследовании материал позволяет надеяться на то, что использование системной трансплантации аутогенных МСК открывает новые перспективы при лечении пациентов с резистентными формами легочного туберкулеза. Природа наблюдаемых эффектов пока остается недостаточно понятной, можно только констатировать усиление регенеративных процессов в поврежденных участках легких. Вызваны ли они длительным существованием в тканях трансплантированных МСК с их необычными иммунологическими свойствами (способностью ослаблять продукцию активных форм кислорода клетками, принимающими участие в развитии воспалительных процессов [9]) или эффекты опосредуются в основном через паракринные механизмы [10], или еще какими-то другими возможными механизмами, например, нормализацией кроветворения с уменьшением доли клеток-продуцентов фактора некроза опухолей, что существенно для развития патологических процессов в поврежденных тканях легкого при туберкулезе, можно будет выяснить только на основе продолжения экспериментально-клинических работ в данном направлении. Одновременно можно отметить, что полученные результаты указывают на перспективность использования аутогенных МСК при лечении резистентных форм легочного туберкулеза не только путем проведения клеточной терапии, но и генной терапии, основанной на использования МСК для доставки ряда генов в поврежденные ткани легкого (например, гена у-интерферона).

Подняться вверх сайта