Поиск Кабинет

Культивирование стромальных клеток костного мозга крысы на коллагене I типа разного происхождения

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 41-59

 

Авторы

Бармашева А.А., Шарутина И.А., Николаенко Н.С., Кухарева Л.В., Шамолина И.И., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Коллаген I типа широко применяется в медицине и биотехнологии в связи с относительной простотой получения и своими биологическими свойствами. Целью работы стало изучение пролиферации (индекс пролиферации), распластывания (актиновый цитоскелет, площадь распластывания) и остеогенной дифференцировки (наличие внутриклеточной щелочной фосфатазы) стромальных клеток костного мозга (СККМ) крысы на различных молекулярных и фибриллярных коллагеновых субстратах на плоскости и при трехмерном культивировании в гелях коллагена.

Препараты коллагена получали из шкур овцы или молодых быков методом щелочно-солевой экстракции. Контрольный коллаген был получен с помощью кислотной экстракции из хвостов крыс. Фибриллы коллагена на плоскости получали путем трехразового последовательного нанесения на подложку слоев молекулярного коллагена. Исследовали способность к мелированию (образованию геля) препаратов коллагена в нейтральной среде при 37°С. СККМ беспородных крыс получали центрифугированием на градиенте гистопака плотности 1,077 г/мл и культивировали в ростовой среде. Актиновый цитоскелет распластанных клеток окрашивали с помощью ро-дамин-фаллоидина. Локализацию раннего маркера остеогенной дифференцировки — щелочной фосфатазы — выявляли гистохимически с помощью окраски клеток смесью, содержащей тетразолиевый синий.

В ходе работы было установлено, что желирует не только контрольный коллаген из хвостов крысы, но и один из препаратов коллагена из шкур овец. В дальнейшем мы сравнивали поведение клеток на желирующих и нежелирующих препаратах коллагена. Наибольшие площадь распластывания, индекс пролиферации и выработка щелочной фосфатазы были у СККМ на желирующих фибриллярных коллагенах. Оба коллагена давали устойчивые гели, в которых клетки сохраняли способность к остеогенной дифференцировке до двух недель. Гелеобразующий образец коллагена I типа из шкур овец можно рекомендовать для применения в качестве носителя при трансплантации СККМ.

Коллаген является фибриллярным белком, одним из компонентов межклеточного матрикса. В настоящее время известно 27 различных генетических типов коллагена, из них 4 фибриллообразующих, на которые приходится 95% общего количества коллагенов в организме [1]. Белками, обеспечивающими механическую прочность всех тканей млекопитающих, являются фибриллообразующие коллагены типов I, II, III и V, из которых 90% приходится на коллаген типа I. Трехспиральные молекулы фибриллообразующих коллагенов, благодаря их уникальной первичной структуре, являются практически жесткими элементами in vivo и in vitro. В физиологических условиях они укладываются параллельно со сдвигом на 1/4 длины, образуя так называемую нативную фибриллу, обнаруживающую при исследовании под электронным микроскопом характерную исчерченность. За счет небольших неспиральных участков по краям тройной спирали, так называемых телопептидов, происходит сшивка и упрочнение фибриллы [2].

Коллаген I типа в больших количествах получают главным образом из кожи и сухожилий крупного рогатого скота и других млекопитающих [3]. Благодаря своему уникальному и очень консервативному аминокислотному составу, коллаген мало иммуногенен и поэтому при введении под кожу практически не вызывает иммунного ответа [4]. Кроме того, коллаген является отличным гемостатиком [5]. Все это делает коллаген материалом, широко применяемым в медицине и биотехнологии. В частности, препараты коллагена I типа, а также различные его комбинации с другими остео-тропными препаратами, в настоящее время активно используются при костной пластике в травматологии и ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии [ 6—9 ],

В последние десятилетия интенсивно развивается новое направление биотехнологии — тканевая инженерия — создание из клеток и матрикса композиций, предназначенных для восстановления тканей. Начало этому положила работа Е. Белла с сотрудниками по включению в коллагеновый гель дермальных фибробластов, которые живут, размножаются и перестраивают структуру геля [10]. В дальнейшем на основе коллагенового геля были получены эквиваленты практически всех тканей организма [11]. Уникальность коллагенового геля в качестве субстрата заключается в том, что структура молекулы фибриллярного коллагена настолько приспособлена к его фибриллообразующей функции, что раствор коллагена дает нативную фибриллу спонтанно in vitro при приведении системы к физиологическим условиям. Образующийся в этих условиях коллагеновый гель есть совокупность фибрилл, т. е. та самая структура, которая существует во всех тканях in vivo [12]. Коллаген используют также при двухмерном культивировании клеток в качестве субстрата. В этом случае возможно использование как фибриллярного коллагена, так и молекулярного коллагена. При этом поведение клеток на этих разновидностях коллагенового субстрата значительно различается; в частности, от структуры нанесенного на подложку коллагена зависят форма и организация актинового цитоскелета у культивируемых фибробластов [13, 14]. Влияние организации коллагеновой подложки на стромальные клетки костного мозга (СККМ) не исследовалось.

Способность коллагена к фибриллообразованию зависит от способа получения коллагена. Существуют три основных способа получения коллагена I типа: кислотная, ферментативная и щелочно-солевая экстракции [3].

Все они дают нативную, т. е. трехспиральную молекулу белка. Кислотная экстракция возможна только из тканей молодых животных и дает с небольшим выходом цельную молекулу коллагена с сохраненными телопеп-тидами, образующую прочные гели [15]. При ферментативной экстракции телопептиды отрезаются протеазами, и остается одна тройная спираль, образующая непрочные гели только при больших концентрациях белка, т.к. сшивки в них отсутствуют. Щелочно-солевая экстракция дает коллаген с хорошим выходом из тканей животных любого возраста, но в нем группы аспарагина и глутамина частично или полностью дезамидированы, вследствие чего изменен заряд молекулы и потеряна способность к гелеобразованию. Телопептиды в таком коллагене повреждаются в зависимости от интенсивности щелочной обработки [3]. Нам удалось подобрать условия, позволившие получить желирующую модификацию щелочно-солевого коллагена I типа.

В данной работе была поставлена задача сравнить поведение стромальных клеток костного мозга крысы — распластывание и организацию цитоскелета, пролиферацию и остеогенную дифференцировку — на различных фибриллярных коллагеновых субстратах, а для желирую-щих субстратов и при трехмерном культивировании в гелях.

Материал и методы

Выделение и культивирование СККМ крысы

В работе использованы беспородные крысы двухмесячного возраста. Согласно правилам работы с мелкими лабораторными животными крыс усыпляли с помощью эфира, стерилизовали в 30% спирте в течение IQ-15 мин. У крыс отсекали нижние конечности, снимали с них кожу и отделяли мышцы в стерильной чашке Петри. Для выделения костного мозга брали бедренные кости. Их промывали в фосфатном буфере без Са2+ и Mg2+ — PBS~ с добавлением гентамицина (Invitrogen, Великобритания) в концентрации 50 мкг/мл, отсекали эпифизы, осторожно вымывали костный мозг при помощи шприца. Ядросодержащие клетки костного мозга выделяли согласно модифицированному методу [16]. Для этого костный мозг суспендировали в 2 мл PBS~, суспензию наслаивали на 3 мл раствора гистопака (Sigma, США) плотности 1,077 г/мл и центрифугировали 20 мин при 800д при комнатной температуре. Клетки, находящиеся в интерфазном слое гистопака (в основном, ядросодержащие клетки), переносили в другую пробирку и центрифугировали в десяти объемах раствора PBS~ при 600д в течение 15 мин при комнатной температуре для очистки от гистопака. Промытые клетки суспендировали в культуральной среде, состоящей из —MEM (Sigma, США) с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров (СЗК, HyClone, США) и смеси пенициллина и стрептомицина в стандартной концентрации (Invitrogen, Великобритания). Подсчет клеток проводили под инвертированным микроскопом, используя счетчик форменных элементов крови. Клетки высевали в пластиковые чашки Петри (Nunc, Дания) диаметром 50 мм из расчета 0,5—1 х108 клеток/см2. Культивирование проводили при температуре 37°С в инкубаторе с концентрацией С02 — 5%. Клетки пассировали с помощью смеси 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора ЗДТА в физиологическом буфере (Invitrogen, Великобритания).

В экспериментах использовали клетки второго пассажа.

Методы выделения и особенности препаратов коллагена I типа

Препараты коллагена I типа № 1 и № 2 были получены из шкуры овцы методом щелочно-солевой экстракции [3]. Препарат № 3 получен из шкуры молодого быка методом такой же щелочно-солевой экстракции [3]. Препарат № 4 является стандартным коллагеном, полученным с помощью кислотной экстракции из хвостов крыс [15].

Распластывание СККМ на фибриллярном коллагене I типа

Для получения фибриллярной формы коллагена использовали метод Ю.А. Швед и Л.В Кухаревой [17]. Исследуемые образцы разводили до концентрации 100 мкг/мл в слабокислой воде, содержащей ледяную уксусную кислоту (ЛУК) (ЛУК:Н20 — 1:1000). На центр гидрофобного стекла, подвергнутого силиконизации с помощью раствора Repel-Silane ES (Sigma, США), наносили 100 мкл раствора коллагена и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин не-прикрепившийся белок убирали путем трехкратного промывания 100 мкл раствором PBS и наносили следующую порцию белка. Всего проводили три нанесения раствора коллагена. Таким образом получали три слоя коллагена на гидрофобной поверхности стекла. Последний слой белка трижды промывали раствором PBS по 100 мкл, наносили 100 мкл 0,2% раствора BSA (Sigma, США) на PBS и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Полученный субстрат трижды промывали раствором PBS и наносили на поверхность стекла 1—2x104 клеток в 100 мкл бессывороточной среды —МЕМ. Клетки на субстрате инкубировали в С02 — инкубаторе в течение 1 ч.

Анализ организации цитоскелета СККМ, распластанных на коллагене I типа Клетки, нанесенные на иммобилизованный белок фиксировали в 50 мкл 4% раствора нейтрального формалина в течение 10^20 мин при комнатной температуре. Препарат трижды отмывали от фиксатора раствором PBS, после чего проводили пермеабилизацию клеток с помощью 0,1% раствора тритона Х-100 в течение 5 мин. Препарат многократно промывали раствором PBS до исчезновения следов детергента. Раствор родамин-фаллоидина (Invitrogen, США) в разведении 1:20 на PBS наносили на препарат и инкубировали в течение 5^12 мин при 37°С [18]. Препарат промывали три раза раствором PBS и заключали в бальзам (Molecular Probes, США).

Изучение цитоскелета СККМ проводили с помощью люминесцентной микроскопии на конфокальном микроскопе Leica TCS SL (ФРГ). Для возбуждения флуоресценции использовали НеЫе-лазер с длиной волны 543 нм для родамина.

Измерения площади и периметра распластанных клеток

Измерения распластанных и окрашенных родамин-фаллоидином клеток проводили на микроскопе «Axiophot» «ВидеоТесТ-Размер 5.0». Исследовали 50 клеток на каждом образце коллагена в 10 произвольно выбранных полях препарата. Результат получали в микронах и вычисляли среднее значение с учетом стандартной ошибки среднего арифметического. Статистическая обработка результатов Стандартную ошибку среднего арифметического проведенных измерений рассчитывали с помощью программы Microsoft Excell по формуле:

где Хср — среднее арифметическое выборки; m — стандартная ошибка среднего арифметического; п — количество элементов выборки.

Контроль пролиферации СККМ, культивируемых на препаратах коллагена I типа

Определяли индекс пролиферации СККМ (отношение количества клеток на чашке в фазе субконфлюэнтного монослоя к количеству посеянных клеток). Клетки высевали в чашки Петри (40 мм) (Медполимер, Санкт-Петербург) с гидрофобной поверхностью, на которые предварительно трехкратно наносили исследуемые препараты коллагена I типа по описанной выше методике. В бессывороточной среде и оставляли на 1 ч в С02-инкубаторе, контролируя распластывание клеток под инвертированным микроскопом. После этого сменяли бессывороточную среду на ростовую среду —МЕМ, содержащую 10% СЗК и антибиотики (смесь пенициллина и стрептомицина). Измерение индекса пролиферации проводили на логарифмической фазе роста клеток через 4 сут. культивирования. Клетки снимали стандартным способом и подсчитывали их количество в ге-моцитометре. Затем определяли индекс пролиферации как отношение количества выросших клеток к количеству посеянных клеток.

Культивирование СККМ в геле коллагена I типа Коллагеновый гель (2,5 мг/мл) готовили на льду из концентрированного (3,5—9,0 мг/мл) раствора коллагена 1 типа в разбавленной уксусной кислоте путем разведения исходного раствора коллагена до нужной концентрации 10-кратной средой 199 с подведением ток в 1 мл геля) вводили в раствор коллагена на льду с помощью микродозатора, затем помещали клетки в 24-луночную плату и инкубировали в течение 15 мин при 37°С в С02-инкубаторе. В течение этого времени происходило формирование коллагенового геля с клетками. Затем поверх геля добавляли 1 мл ростовой среды.

Остеогенная дифференцировка СККМ, культивируемых на препаратах коллагена I типа и в коллагеновом геле

Для индукции остеогенной дифференцировки клетри, покрытые фибриллярным коллагеном по описанной выше методике. Через сутки ростовую среду меняли на дифференцировочную среду следующего состава: 90% —МЕМ, 10% СЗК, 10 тМ p-глицерофосфата натрия (Sigma, США), 10^8 М дексаметазона (Sigma, США), 50 мкг/мл аскорбата натрия (ICN, США). Обработку клеток такой средой осуществляли в течение 10 сут. Смену среды проводили через 3^4 сут. культивирования.

В качестве маркера остеогенной дифференцировки выбрали щелочную фосфатазу, локализацию которой выявляли гистохимически с помощью смеси BCIP/NBT (Sigma, США). Интенсивность окраски оценивали визуально.

Результаты и обсуждение

Характеристика полученных образцов коллагена I типа Ранее было показано, что контрольный коллаген I типа препарата № 4, выделенный с помощью кислотной экстракции из хвостов крыс, содержит неповрежденные телопептиды и способен к желированию (в концентрации выше 0,2 мг/мл в нейтральной среде при 37°С образует гель) [12]. Исследуемые образцы коллагена (№ 1, 2 и 3), полученные с помощью щелочно-солевой экстракции из шкур овцы и молодого быка, содержат остатки аспарагина и глутамина в частично дезамидированном и поврежденном виде, но согласно литературным данным сохраняют телопептиды [3]. Нас интересовало влияние фибриллярного (гель) или молекулярного характера коллагенового субстрата, а также источника получения коллагена (бык или овца) на пролиферацию и дифференцировку стромальных клеток костного мозга крысы на нем.

Установлено, что желирует не только коллаген препарата № 4, но и коллаген № 1. В дальнейшем мы сравниваем поведение клеток на желирующих (образцы 1 и 4) и нежелирующих (образцы 2 и 3) препаратах коллагена.

Распластывание СККМ на препаратах фибриллярного коллагена I типа.

Особенности формирования цитоскелета клеток Адгезия стромальных клеток костного мозга к фибриллярному коллагену проходила стадии, характерные для многих типов клеток: прикрепление к субстрату и последующее распластывание, в ходе которого клетки приобретают специфическую форму и организацию цитоскелета. Через 1 ч после нанесения на субстрат большая часть клеток распластывалась на коллагене и начинала мигрировать и взаимодействовать друг с другом.

СККМ, распластанные на коллагене 1 типа (препараты № 1—4), имели в основном неопределенную форму. Клетки имели большое число отдельных ламеллоподий или филлоподий (рис.1А, Б). Актин был сосредоточен главным образом под плазматической мембраной и в выростах в виде пучков филаментов неопределенной формы. В центральной части цитоплазмы организованных актиновых структур не наблюдалось. В основном актин был представлен многочисленными агрегатами, взаимодействующими между собой и образующими некоторое подобие рыхлой сети. Другим ярко выраженным типом клеток были хорошо распластанные поляризованные клетки с тонкими тяжами актиновых филаментов по периферии и четко организованной актиновой сетью в центральной части клетки (рис. 1В). В препаратах встречались небольшие по размеру клетки с большим числом псевдоподий на ветвящем крае (рис. 1 Г). Не-распластанные клетки были единичными и выглядели как маленькие округлые шары. Некоторое количество крупных клеток имели округлую форму. В них актин располагался по периферии. Эти клетки относили к разряду плохо распластанных клеток.

При сравнении распластывания клеток на образцах гелеобразующих коллагенов № 1 и № 4 было обнаружено, что степень ветвистости клеточного края СККМ была несколько ниже на коллагене № 1, однако в фиб-робластоподобных клетках более четко прослеживалась сеть актиновых филаментов со стресс-фибриллами. На рисунках 2А и 2Г представлены агрегаты взаимодействующих между собой клеток разной формы и с разным цитоскелетом.

Морфология СККМ на негелеобразующих коллагенах № 2 и № 3 (рис. 2Б, В) отличалась от морфологиии клеток на образцах коллагена № 1 и № 4. В распластанных клетках отсутствовали стресс-фибрилл, фил-лоподий и псевдоподий меньше, клетки имеют слабо выраженную сеть филаментов и небольшое количество фокальных контактов.

Размеры СККМ, распластанных на препаратах фибриллярного коллагена I типа

Результаты измерения площади и периметра распластанных клеток показали, что наибольшей площадью и периметром обладают клетки на образце коллагена № 1 и № 4 (табл. 1). Однако разница между ними находится в пределах статистической ошибки. Образец № 4 является, как уже было сказано ранее, контрольным коллагеном I типа, имеющим телопептиды и образующим гель. Коллаген образца № 1 имеет, возможно, поврежденные телопептиды, но также способен формировать гель. Клетки имеют меньшие площадь и периметр на коллагенах образцов № 2 и 3. Коллагены этих образцов также содержат, возможно, поврежденные телопептиды, но не формируют гель.

Пролиферация СККМ на препаратах фибриллярного коллагена I типа

При культивировании СККМ крысы на гидрофобных чашках Петри диаметром 40 мм с нанесенными образцами коллагена I типа первые прикрепившиеся клетки наблюдались через 30 мин после посева. В течение 4 сут. формировался субконфлюэнтный монослой. На этом этапе клетки снимали с подложки стандартным способом и подсчитывали их количество, а затем рассчитывали индекс пролиферации клеток. Результаты представлены в таблице 2.

Наибольшая пролиферативная активность наблюдалась при росте клеток на образцах коллагена № 1 и 4. На образцах коллагена № 2 и 3 пролиферация была ниже по сравнению с гелеобразующими образцами коллагена.

Остеогенная дифференцировка СККМ на препаратах фибриллярного коллагена I типа

Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы в СККМ крысы, выращиваемых на разных образцах коллагена и индуцированных в остеогенном направлении, показало наибольшее количество фермента в клетках, культивируемых на образцах № 1, 2 и 4 (рис. ЗА, Б, Г; табл. 2). В них наблюдалось наибольшее количество распластанных фибробластоподобных клеток, положительно окрашенных на щелочную фосфатазу. Наименее яркая окраска наблюдалась при культивирваниии СККМ на коллагене образца № 3. Следовательно, оптимальными образцами коллагена для проведения остеогенной дифференцировки являются образцы № 1, 2 и 4.

Трехмерное культивирование СККМ в гелеформирующих препаратах коллагена I типа

СККМ культивировали в гелях препаратов № 1 и 4 в течение двух нед., контролируя при этом распластан-ность клеток, которая сохранялась на протяжении всего времени культивирования. Через 3^5 сут. начиналась контракция геля, выраженная в постепенном стягивании края и уменьшении объема геля. Через 3 сут. культивирования производили смену среды на дифференциро-вочную (остеогеннную). На рис. 4 представлены дифференцированные остеогенные клетки, продуцирующие щелочную фосфатазу в гелях коллагена I типа (препараты № 1 и 4).

Поскольку СККМ продуцируют щелочную фосфатазу в течение 10 сут. и более в гелеобразующих коллагенах, выделенных с помощью кислотной экстракции из хвостов крыс (препарат № 4) и с помощью щелочносолевой экстракции из шкуры овцы (препарат № 1), такие коллагены могут быть использованы как для трехмерного культивирования СККМ in vitro, так и для трансплантации клеток в костную ткань для восстановления нормального остеогенеза. Возможность использования трансплантатов стромальных клеток костного мозга для прохождения нормального остеогенеза в костном дефекте была продемонстрирована в наших предыдущих работах [19, 20].

Таким образом, наибольшее распластывание стромальных клеток костного мозга и максимальный индекс их пролиферации наблюдались на образцах коллагена № 1 и № 4. Эти же образцы оказались наиболее приемлемыми для проведения остеогенной дифференцировки стромальных клеток и для их трехмерного культивирования в геле. Следовательно, наличие коллагеновых фибрилл в субстрате благоприятствует их пролиферации и остеогенной дифференцировке как при двухмерном культивировании на плоских поверхностях, так и при трехмерном — в геле. Благоприятное воздействие коллагеновых фибрилл в качестве субстрата наблюдалось и для фибробластов [13, 14]. Учитывая тот факт, что коллаген № 1 получен более технологичным способом и не уступает своими биологическими свойствами образцу контрольного коллагена № 4, можно рекомендовать применение гелеобразующего образца коллагена I типа, полученного из шкуры овцы с помощью щелочносолевой экстракции (№ 1), для применения в заместительной клеточной терапии в качестве носителя стромальных стволовых клеток.

Подняться вверх сайта