Поиск Кабинет

Культивирование эпителиоподобных клеток на пленочных матриксах из хитозана

Гены & Клетки: Том VI, №1, 2011 год, стр.: 82-84

 

Авторы

Бузинова Д.А., Хмельницкая Е.А., Шиповская А.Б., Островский Н.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены результаты адгезии и пролиферации эпителиоподобных клеток эмбрионального и постнатального происхождения на пленочных матриксах из хитозана. Использовали три клеточных линии эпителиоцитов: эпителий почки эмбриона макаки (МА-104), почки собаки (MDCK), а также карциномы легкого человека (А 549). Выявлена достаточно высокая адгезия и пролифериративная активность всех типов клеточных культур на исследуемых пленочных субстратах. В зависимости от молекулярной массы хитозана формирование полноценного монослоя эпителиоцитов МА-104 и MDCK наблюдалось на 3–4 и 4–6 сут. культивирования соответственно. Эпителиальные опухолевые клетки А 549 полноценный монослой не образовывали.

В современной комбустиологии остается нерешенной проблема замещения дефектов кожного покрова при глубоких обширных ожогах, когда выполнение аутодермопластики затруднено из-за дефицита донорских ресурсов кожи [1]. В этом случае оптимальной является пересадка выращенных вне организма эпителиальных и соединительнотканных клеток человека (кератиноцитов, фибробластов) [2–4]. Однако существующие способы переноса эпителиальных пластов на раневую поверхность приводят к повреждению и гибели значительной части пролиферативно активных клеток. В связи с этим, культивирование клеточных культур целесообразнее проводить на биорезорбируемых полимерных матриксах с последующей трансплантацией тканеинженерной конструкции (фармацевтического биотрансплантата) на рану [5–7].

В этом плане представляется перспективным использование в качестве биодеградируемой подложки для создания таких тканеинженерных конструкций хитозана – производного аминополисахарида хитина. Это сравнительно дешевый полимер, обладает ежегодно возобновляемой и потому практически неограниченной сырьевой базой. В процессе получения хитозана практически полностью утрачивается его антигенность. Кроме того, данный аминополисахарид близок по функциональным качествам к компонентам дермы in vivo. Ранее нами показано, что пленочные материалы из хитозана обладают ярко выраженным бактерицидным действием [8] и высокой сорбционной способностью к раневому экссудату [9]. В клинических исследованиях (Центр термических поражений, г. Саратов) установлена нетоксичность пленочных матриксов из хитозана и их биосовместимость с дермальными тканями [10]. При лечении ожогов II-III А степени выявлено снижение уровня бактериальной обсемененности раны и ускорение репаративных процессов (практически в 2 раза) по сравнению с традиционной терапией [11].

В литературе имеются сведения о культивировании фибробластов человека и млекопитающих на подложках из хитина [12–14] и хитозана [14– 15], на хитозановых [16] и хитозан-коллагеновых скаффолдах [17, 18], а также гибридных хитозанполилактидных наноструктурированных матриксах [19]. Данных о культивировании кератиноцитов сравнительно немного [20, 21]. Способность кератиноцитов к адгезии, дифференцировке и пролиферации на хитозановых матриксах практически не исследована. Между тем, ввиду быстрого перехода фибробластов в фиброциты, обладающих менее выраженными ростстимулирующими свойствами [22], а также развития гипертрофии соединительной ткани (келоидный рубец), для получения фармацевтических биотрансплантатов для восстановления эпидермальных тканей целесообразнее использовать кератиноциты.

Цель настоящей работы – культивирование эпителиоцитов человека и млекопитающих на пленочных матриксах из хитозана.

Материал и методы

Использовали образцы хитозана со средневязкостной молекулярной массой (СММ) 87 и 200 кДа, степенью деацетилирования 83,6 и 82,0 мольн.% (ЗАО «Биопрогресс», Россия). Пленки получали поливом 2% растворов хитозана в 2% уксусной кислоте на полиэтилентерефталатные подложки с последующим испарением растворителя. Формование проводили при температуре 22±2°С и нормальном атмосферном давлении. Для перевода полимера из солевой формы в форму основания пленки выдерживали в 1 М NaOH [23], затем промывали дистиллированной водой до рН = 7, высушивали на воздухе и стерилизовали УФ-светом в ламинарном боксе в течение 1 ч. Все полученные пленки были прозрачными, толщина составила 10–15 мкм.

Для культивирования выбраны эпителиоподобные по морфологии клетки человека и млекопитающих эмбрионального и постнатального происхождения из коллекции НИИ вирусологии РАМН: эпителий почки эмбриона макаки (МА-104), эпителий почки собаки (MDCK) и карцинома легкого человека (А 549). Ферментативную дезагрегацию для пассирования клеток проводили смесью 0,25% раствора трипсина с 0,2% раствором версена в соотношении 3:1 при 37°С. Жизнеспособность клеток оценивали на флуоресцентном микроскопе «МИКМЕД 2» (Россия), окрашивание проводили акридиновым оранжевым и этидиум бромидом. Для всех трех видов клеточных культур жизнеспособность клеток составила не менее 98%. Суспензию клеток в концентрации 30×104 кл/см2 наносили на образцы пленок. В качестве контроля использовали стандартные культуральные флаконы с внутренней поверхностью, обработанной поли-D-лизином («Orange Scientific», Бельгия). Клетки культивировали в ростовой среде DMEM:F12 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (ООО «БиолоТ», Россия) в атмосфере 5% СО2 при 37°С. Питательную среду меняли через 2–3 сут. Наблюдение за адгезией и пролиферацией клеток проводили на инвертированном микроскопе «Биолам П» (Россия) с цифровой CCD-камерой DMC 300 («Scopotek», Китай): объектив 40×, разрешение 3 Mpx. Эффективность адгезии клеток к субстрату оценивали по количеству прикрепившихся клеток, видимых в поле зрения микроскопа, через 1,5 ч после высева, результат культивирования – по срокам формирования монослоя.

Результаты и обсуждение

Проведены четыре серии экспериментов. Каждая серия включала три параллельных опыта по выращиванию клеток каждого типа на пленочном матриксе из хитозана определенной молекулярной массы. Во всех случаях, вне зависимости от СММ полимера и типа клеточной культуры, эффективность прикрепления клеток к субстрату составляла 90–95% и более.

Результаты наблюдения за адгезией и пролиферацией клеток на пленке из хитозана с СММ = 87 кДа в разное время культивирования представлены на рисунке. Видно, что спустя сутки инкубирования наблюдается высокая адгезия и пролиферация всех типов клеток на полимерной матрице (рис. А–В).

Формирование полного монослоя эпителиоцитов МА-104 наблюдалось в среднем на 4-е сут. культивирования, а MDCK – на 6–7-е сут. (рис. Г, Д). Общее количество клеток в сформированном монослое составило 3,3×106 кл/см2. Клетки карциномы легкого человека А 549 не образуют полноценного монослоя ни в одном из опытов (рис. Е), в том числе и при использовании пленочного матрикса, полученного из образца полимера с СММ 200 кДа.

Наилучший результат роста клеток выявлен для пленок из хитозана с СММ = 200 кДа. Так, в отличие от образцов с более низкой СММ, образование сплошного слоя клеток МА-104 наблюдалось на 3-и сут., а MDCK – на 4-е сут. культивирования. Следует отметить, что в принятых условиях проведения опытов воспроизводимость культивирования клеток во всех сериях экспериментов составила 98±2%.

При использовании в качестве субстрата стандартной подложки с нанесенным слоем поли-Dлизина формирование монослойного пласта клеток для всех трех типов клеточных культур наблюдалось на 3-и сут. культивирования.

Сравнительный анализ полученных результатов показал, что, несмотря на некоторое снижение эффективности роста клеток на пленочных субстратах из хитозана по сравнению с контролем, она остается на достаточно высоком уровне. Это может свидетельствовать о наличии на поверхности хитозановых матриксов специфических сайтов связывания с рецепторами клеток.

Таким образом, полученные результаты указывают на перспективность использования матриксов из хитозана в качестве подложки для культивирования эпителиальных клеток. Это позволит подойти к созданию комбинированных полимерно-клеточных биокомпозитов на основе полимерных матриц, резорбируемых естественным метаболическим путем, необходимых для реализации процессов регенерации поврежденного термической травмой кожного покрова, что является предметом дальнейших публикаций.

Подняться вверх сайта