Поиск Кабинет

Криоконсервированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки стимулируют репаративный хондрогенез в дегенеративно измененном межпозвонковом диске

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 29-34

 

Авторы

Юхта М.С., Волкова Н.А., Жуликова Е.П., Гончарук Е.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Альтернативой традиционному лечению дегенеративных изменений межпозвонковых дисков является клеточная терапия мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК).

Целью работы была оценка терапевтического потенциала криоконсервированных культур аллогенных ММСК костного мозга при данной патологии. Крысам со смоделированным компрессионным дегенеративно-дистрофическим повреждением межпозвонкового диска СоVI-VII на коллагеновой губке в зону дефекта вводили по 0,5×106 нативных или криоконсервированных клеток, в том числе меченных РКН-26 клеток. Контрольные группы были представлены животными с естественным ходом восстановительного процесса (без применения терапевтических методов) и введением физиологического раствора. На 30-е сут. после терапии проводили гистоморфометрическое исследование и люминесцентную микроскопию срезов межпозвонковых дисков СоVI-VII. В контрольных группах животных отмечался крайне низкий регенеративный потенциал. На фоне клеточной терапии наблюдалась тенденция к репарации линейных дефектов, фрагментаций пучков коллагеновых волокон фиброзного кольца, более выраженная в случае применения нативной культуры ММСК. Применение криоконсервированной культуры ММСК сопровождалось увеличением количества хондроцитов дорсальной части фиброзного кольца на единицу площади среза межпозвонкового диска СоVI-VII в 1,25 раз относительно модельных значений. Высота фиброзного кольца при этом увеличивалась на 12,5±3,3%, а денситометрический показатель хрящевой ткани – на 64±5,7% относительно модельных показателей.

При люминесцентной микроскопии криостатных срезов межпозвонковых дисков СоVI-VII на 30-е сут. после введения меченых нативных или криоконсервированных ММСК в наружных отделах фиброзного кольца и по его краю наблюдали свечение в красном диапазоне спектра в виде округлых включений и конгломератов, что свидетельствовало о выживаемости и миграции в диск трансплантированных и (или) их дочерних клеток.

Полученные нами данные свидетельствуют о стимулирующем эффекте криоконсервированной суспензии ММСК при дегенеративно-дистрофических повреждениях межпозвонковых дисков.

В МПД дегенеративные изменения наступают значительно раньше, чем в костных и мышечных структурах. Минимальные их проявления обнаруживают в возрасте 11–16 лет[1]. В дальнейшем они лишь прогрессируют, вызывая болевой синдром в области туловища и конечностей в среднем к 35– 45 годам[2].

Проблема лечения дорсопатий, в частности, обусловленных дегенеративно-дистрофическими изменениями МПД, еще далека до полного разрешения. В настоящее время наряду с совершенствованием уже существующих методов лечения ведется поиск новых подходов к терапии данной патологии. Учитывая, что наиболее значимыми клеточными и биохимическими изменениями, связанными с дегенерацией МПД, является снижение в нем численной плотности хондроцитов – клеток, синтезирующих компоненты внеклеточного матрикса хрящевой ткани, – можно предположить, что клеточная терапия при этой патологии должна показать достаточно высокую клиническую эффективность[3]. Перспективным «терапевтическим» типом клеток в данном случае являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), которые уже хорошо «зарекомендовали себя» в исследованиях в рамках травматологии и ортопедии. Некоторые экспериментальные исследования in vitro показали, что MMСК способны при определенных условиях приобретать фенотип клеток фиброзного кольца (ФК)[4] и пульпозного ядра (ПЯ)[5]. Разработанные на сегодня протоколы криоконсервирования ММСК костного мозга обеспечивают высокое качество сохраненного клеточного препарата, что позволяет применять его в любой нужный для лечения момент. Таким образом, исследования выполнимости и эффективности применения криоконсервированных ММСК (КрММСК) при дегенеративно-дистрофических повреждениях хрящевой ткани МПД in vivo являются актуальными.

Материал и методы

Целью работы являлась экспериментальная оценка репаративного потенциала аллогенных КрММСК костного мозга при дегенеративно-дистрофическом повреждении хрящевой ткани МПД.

ММСК выделяли из резецированных фрагментов бедренной кости крыс (n = 7, массой 100–150 г) путем вымывания костного мозга раствором Хенкса с последующим пропусканием через иглы уменьшающегося диаметра. Полученную суспензию центрифугировали при 1500 об/мин (834 g) в течение 5 мин., осадок ресуспендировали и высевали с плотностью 103 кл/см2. Культивирование клеток проводили по методу, обеспечивающему адгезию стромальной фракции к культуральному пластику с последующим удалением фракции неадгезировавших клеток. Клетки культивировали в питательной среде IMDM (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота (HyClone, США), гентамицин (150 мкг/мл; Фармак, Украина) и амфотерицин Б (10 мкг/мл; Sigma, США). В работе были использованы стандартные условия культивирования (37°С, 5% СО2, 95% влажности) в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония). Смену питательной среды проводили каждые 3-и сут. Клетки культивировали в течение 14 сут. до достижения 75% конфлюентности монослоя, после чего их использовали в виде суспензии нативных ММСК.

Для криоконсервирования суспензии ММСК использовали ростовую среду с добавлением криопротектора ДМСО (ПанЭко, Россия) и ЭС в конечных концентрациях 10% и 20% соответственно. Криоконсервирование проводили по 2-этапной программе (1°С/мин до -80°С с последующим погружением в жидкий азот)[6]. Образцы хранили в условиях низкотемпературного банка не менее 3 мес. Размораживание суспензий ММСК проводили на водяной бане (37°С) до достижения жидкой фазы с последующим удалением криопротектора путем медленного добавления к суспензии клеток раствора Хенкса 1:9 (РАА, Австрия) и центрифугирования. Целостность мембран КрММСК определяли с использованием теста на включение трипанового синего (SigmaAldrich, CША). Для определения пролиферативного потенциала клетки высевали на 6-луночные планшеты (РАА, Австрия) с плотностью 1×105 кл/лунку. Динамику прироста клеток оценивали каждые 2 сут. на протяжении 17 сут.[7]. Контролем для определения влияния криоконсервирования на пролиферативный потенциал и целостность мембран ММСК были культуры нативных клеток.

Исследование in vivo было выполнено на 49 крысах-самцах массой 300–350 г. У всех животных моделировалось компрессионное дегенеративнодистрофическое повреждение МПД путем формирования лордоза хвостового отдела позвоночника и его фиксации в таком положении в течение 60 сут.[8]. По достижению указанного срока действие компрессии у всех животных прекращали. У животных контрольной группы I (n = 7) заживление проходило «самопроизвольно» – без каких-либо терапевтических вмешательств. Животным контрольной группы IІ (n = 14) в область дефекта МПД СоVI-VII вводили коллагеновую губку Gelaspon® (Ankerpharm, Германия) размером 0,8×0,8×0,5 см, пропитанную 0,1 мл физиологического раствора. Животным экспериментальных групп III (n = 7) и IV (n = 7) аналогичным способом в зону дефекта вводили по 0,5×106 аллогенных нативных или КрММСК в 0,1 мл раствора Хенкса (РАА, Австрия) на коллагеновой губке, соответственно. В ряде случаев для визуализации трансплантированных клеток in vivo их предварительно метили флуоресцентным красителем РКН-26 (Sigma-Aldrich, США). Окрашивание клеток флюоресцентным красителем РКН-26 проводили согласно инструкции фирмы производителя[9]. Животных выводили из эксперимента на 30-е сут. после операции. Кроме того, в эксперименте использовали здоровых животных аналогичной массы и возраста без моделирования повреждения МПД (интактные животные), а также с моделированным повреждением (на сроке 60 сут.), но без каких-либо терапевтических воздействий. Оценку результатов проводили с помощью рентгенологического, гистоморфометрического и люминесцентного методов.

Компьютерную томографию (КТ) проводили на рентгеновском спиральном компьютерном томографе General electric CT/e Dual (Германия) 3 животным из каждой группы, введенным в наркоз. Технические параметры сканирования – срезы в сагиттальной плоскости, толщина среза 0,1 мм; шаг 1 мм, 120 кВ, 100 мАс. Компьютерную обработку полученных изображений проводили с помощью программного обеспечения eFilm (TM) Lite (TM) и Syngo fastView. Оценивали плотность дорсальной части ФК МПД СоVI-VII в единицах Хаунсфилда (HU).

Для гистоморфометрического исследования эксплантировали часть позвоночника на уровне СоIV-X и изготавливали целлоидиновые срезы по стандартной методике[10] с окраской обзорными красителями (гематоксилином и эозином), использовали микроскоп Carl Zeiss (Германия) с цифровой фотокамерой Canon EOS 30D. При помощи морфометрической сетки и окуляр-микрометра по ранее опубликованному методу[11] оценивали высоту ФК и численную плотность клеток дорсальной части ФК МПД СоVI-VII, степень разволокнения и фрагментации коллагеновых волокон, наличие линейных дефектов и участков с пониженной численнойи плотностью и (или) отсутствием хондроцитов в ФК, целостность границы ФК/ПЯ. Высоту определяли по конечным элементам ФК на уровне наиболее приближенных друг к другу поверхностей тел выше и ниже расположенных позвонков. Численную плотность клеток определяли как среднее арифметическое измерений во внешнем, центральном и внутреннем отделах дорсальной части ФК путем подсчета количества ядер на единице площади среза (0,102 мм2) с последующим пересчетом на 1 мм2. При определении степени разволокнения и фрагментации коллагеновых волокон, распространенности линейных дефектов, участков с пониженной плотностью и (или) отсутствием хондроцитов оценивалась удельная площадь, занимаемая патологическим элементом.

Детекцию трансплантированных клеток проводили в криостатных срезах МПД СоVI-VII толщиной 7 мкм с помощью люминесцентного микроскопа (LOMO МИКМЕД-2, Россия). Гашение аутолюминесценции проводили путем 30-минутной инкубации образцов с 0,3 М раствором глицина (Merck, Германия). Полученные результаты фиксировали фотографированием.

Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с международными требованиями гуманного обращения с лабораторными животными[12]. Cтатистическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Statistica 8.0, Microsoft Excel с использованием непараметрических критериев. Результаты представлены в виде средних арифметических и стандартных ошибок средних (M±m), критическое значение уровня значимости принималось равным 0,05.

Результаты

Жизнеспособность ММСК после криоконсервирования составляла 82,1±5,2%, в контроле 98,4±3,2% клеток имели неповрежденную мембрану. При исследовании ростовых характеристик КрММСК на начальных этапах культивирования наблюдали снижение способности клеток к адгезии и последующей пролиферации по сравнению с неконсервированными образцами. Через 5 сут. культивирования количество клеток in vitro по сравнению с контролем было меньше на 30,5±6,2%. На 17-е сут. в культурах КрММСК прирост клеток стабилизировался, однако был меньше на 23,2±5,1%, чем в контроле.

При исследовании гистологических препаратов МПД СоVI-VII интактных животных патологических изменений выявлено не было. ФК состояло из радиальных пластин коллагеновых волокон, вдоль которых располагались хондроциты (рис. 1А). Последние представляли собой фибробластоподобные вытянутые клетки с плотными овоидными ядрами (рис. 2А). Гистологическая картина МПД животных контрольных групп I и II (см. рис.1В и Г) существенно не отличалась от исходного состояния МПД при смоде- лированном повреждении (см. рис.1Б).

В структуре МПД СоVI-VII определялись признаки дегенеративно-дистрофического повреждения хрящевой ткани в виде разволокнения, расслоения и фрагментации коллагеновых волокон, снижения плотности хондроцитов, нечеткости контуров границы между ФК и ПЯ, образования центральных линейных дефектов, окруженных ацеллюлярными участками ФК. Гетероморфные хондроциты располагались поодиночке или образовывали изогенные группы. В непосредственной близости к линейным дефектам ФК наряду с характерными для этого типа хрящевой ткани клетками встречались крупные хондроциты со сферическими ядрами, окруженными широким ободком цитоплазмы (см. рис. 2В и Г). Такая «трансформация» хондроцитов на фоне резкого снижения численной плотности клеток свидетельствует о напряженности восстановительных процессов на данном участке ФК[13].

При микроскопическом исследовании гистологических препаратов МПД СоVI-VII животных III группы на 30-е сут. после введения нативных ММСК определялось частичное восстановление его структуры (см. рис. 1Д). Наблюдалась репарация линейных дефектов, фрагментаций пучков коллагеновых волокон, становилась более четкой граница между ФК и ПЯ. При этом фибробластоподобные клетки с плотными овоидными ядрами располагались не только по ходу коллагеновых волокон, но и густо пронизывали их толщу, что свидетельствовало о высокой интенсивности репаративных процессов (см. рис. 2Д).

Применение суспензии КрММСК так же способствовало репаративному хондрогенезу в МПД СоVI-VII, но эффект был менее выражен при сравнении с использованием нативных ММСК. На 30-е сут. отмечалась тенденция к нормализации гистологического строения ФК МПД СоVI-VII (см. рис. 1Е): снижение степени разволокнения коллагеновых волокон, значительное сокращение площади, занимаемой линейными дефектами, улучшение контуров границы между ФК и ПЯ. Клеточная популяция ФК, так же как и в случае применения нативных ММСК, была представлена некрупными фибробластоподобными клетками с овоидными ядрами и узким ободком цитоплазмы. При этом клетки располагались пре- имущественно вдоль коллагеновых волокон, лишь в отдельных участках пронизывая их толщу (см. рис. 2Е).

Для объективной оценки выявленных качественных изменений были проведены количественные измерения высоты, численной плотности хондроцитов и денситометрической плотности хрящевой ткани дорсальной части ФК МПД СоVI-VII, результаты которых представлены в таблице.

Согласно полученным данным, на фоне терапии КрММСК высота дорсальной части ФК МПД СоVIVII увеличивалась на 12,5±3,3%, численная плотность хондроцитов – на 26±2,9%, а денситометрический показатель хрящевой ткани – на 64±5,7% относительно модельных значений. Введение же нативных ММСК сопровождалось увеличением численной плотности клеток хрящевой ткани диска в 3,5 раза, высоты ФК МПД СоVI-VII на 25±4,1%, а денситометрической плотности – на 91±7,3%, при этом в группах контроля тенденция к восстановлению исследуемых показателей отсутствовала вовсе (табл.).

При люминесцентной микроскопии криостатных срезов МПД СоVI-VII животных, которым были трансплантированы меченные PKH-26клетки, на 30-е сут. наблюдалось свечение в красном диапазоне спектра, которое было четким в виде вкраплений и конгломератов и локализовалось в наружных отделах ФК и по его краю. При этом в случае применения КрММСК определялось меньшее количество люминесцирующих элементов. Отличие между нативной и криоконсервированной популяциями клеток состояло также и в интенсивности люминесценции, которая была более выражена в МПД животных, перенесших терапию нативными ММСК. При микроскопическом исследовании криостатных срезов МПД контрольных животных с введением физиологического раствора свечение не определялось, что исключало аутолюминесценцию.

Обсуждение

На сегодняшний день из литературных источников известно, что в зависимости от степени дегенеративных изменений в МПД трансплантация ММСК может оказывать стабилизирующее действие, останавливая прогрессию патологического процесса без индукции репаративного процесса[14]. Но следует отметить, что в подобных исследованиях введение ММСК осуществлялось в виде суспензии инъекционным способом, что, возможно, не позволяло клеткам в полной мере проявить свой терапевтический потенциал[15].

Наши исследования in vivo показали, что локальное введение КрММСК оказывает стимулирующий эффект на процессы регенерации в дегенеративно измененной хрящевой ткани МПД, качественно влияя на их течение. Так, если в ФК животных с естественным ходом репаративного процесса и введением физиологического раствора преобладал «синтетический компонент» регенерации, то в группах с трансплантацией ММСК – пролиферативный. Наиболее выраженный стимулирующий эффект введение КрММСК оказывало на численную плотность хондроцитов и денситометрический показатель хрящевой ткани, в меньшей степени влияя на высоту ФК МПД СоVI-VII. Это может быть обусловлено отсутствием прямой корреляции между исследуемыми показателями и требует дальнейшего изучения на более отдаленных сроках наблюдения.

Репаративный эффект ММСК при дегенеративно-дистрофическом повреждении хрящевой ткани МПД, по-видимому, как и в случае суставного хряща, обусловлен как паракринной, так и митотической активностью трансплантированных клеток. ММСК в процессе культивирования синтезируют широкий спектр цитокинов и хемокинов, в том числе и одни из самых мощных антиапоптотических, анаболических и митогенных стимуляторов хондрорепарации – инсулиноподобный фактор роста-1 и трансформиру- ющий фактор роста b[16, 17].

Выживаемость трансплантированных ММСК и их миграцию в поврежденную хрящевую ткань МПД наглядно показывают эксперименты с использованием предварительно меченных флуоресцентным красителем РКН-26 клеток. Результаты люминесцентной микроскопии согласуются с данными работ по исследованию выживаемости трансплантированных в МПД аллогенных ММСК в пределах срока наблюдения[14, 18]. Более низкая интенсивность люминесценции и меньшее количество светящихся элементов в случае введения криоконсервированных клеток могут быть связаны со снижением их пролиферативной активности после цикла замораживания-размораживания. Тем не менее, по данным гистоморфометрических и КТ-исследований КрММСК сохраняют способность стимулировать репаративный процесс в дегенеративно измененной хрящевой ткани МПД.

Выводы

Терапия аллогенными КрММСК костного мозга оказала стимулирующий эффект на репаративный хондрогенез в дегенеративно измененном МПД. После местного введения на трехмерном носителе как нативные, так и крММСК выживают до 30 сут. в зоне трансплантации и частично мигрируют в хрящевую ткань диска. Однако полученные нами результаты указывают на меньшую выраженность положительного эффекта КрММСК по сравнению с нативными клетками.

Подняться вверх сайта