Поиск Кабинет

Криоконсервирование ткани плаценты человека – источник гемопоэтических прогениторных клеток и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 54-62

 

Авторы

Шаблий В.А., Кучма М.Д., Кирик В.М., Онищенко А.Н., Лукаш Л.Л., Лобынцева Г.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе показана возможность получения жизнеспособных гемопоэтических прогениторных и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из криоконсервированной плаценты. Установлено, что относительное содержание SSClow-клеток в CD34+/CD45low-популяции, полученной из криоконсервированной плаценты, достоверно выше, чем из нативной. Также впервые описаны отличия экспрессии CD90 и CD31 на CD34+/CD45low/SSClow клетках пуповинной крови и плаценты. Клональный анализ клеток, выделенных из криоконсервированной плаценты, показал присутствие предшественников, образующих колонии гранулоцито-моноцитов, моноцитов, гранулоцитов и эритроцитов. Из криоконсервированной ткани плаценты можно получить культуру стромальных клеток с иммунофенотипом CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/CD45–/CD34–/CD133–/CD14– и способностью к направленной дифференцировке in vitro в адипогенном и остеогенном направлениях.

В последние годы плацента млекопитающих рассматривается не только как орган, выполняющий метаболическую, иммунную и гормональную функции для обеспечения развития плода. В работе A. Barcena (2009) было показано, что плацента человека играет большую роль во внутриутробном гемопоэзе. В частности, из ворсинок хориона было выделено две популяции гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК): CD34+/CD45low и CD34++/CD45low. Исследования показали, что последняя популяция клеток обладает способностью формирования колоний миелоидной и эритроидной линий, может дифференцироваться в клетки фенотипа CD56+ NK и в клетки-предшественницы CD19+ B-лимфоцитов [1].

Иммуногистохимический анализ тканей плаценты показал присутствие популяции клеток фенотипа CD34+/CD45+ в стромальной ткани волосков хориона, тогда как клетки фенотипа CD45bright были найдены лишь в стенках сосудов. Суспензия клеток, полученная из сосудов плаценты, включала популяцию клеток с фенотипом CD34+/CD38–, трансплантация которых иммунодефицитным мышам приводила к восстановлению гемопоэза [2].

По результатам современных исследований также установлено, что из тканей плацентарного хориона и амниона можно получить мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (MМСК) и мультипотентные клетки цитотрофобласта, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии маркеров эмбриональных стволовых клеток (Oct-3/4, Nanog, SSEA-4) и щелочной фосфатазы [3, 4].

Несмотря на быстрые темпы развития данного научного направления, еще не разработана стандартизированная методология выделения из криоконсервированной ткани плаценты мультипотентных клеток и, соответственно, не описаны их молекулярнобиологические свойства, в том числе способность к мультилинейной дифференцировке. Не вызывает сомнений тот факт, что поиск оптимальных условий криоконсервирования ткани плаценты и дальнейшее получение определенных пулов мультипотентных стволовых клеток чрезвычайно актуальны как для научных целей, так и для практического применения. Именно поэтому важными задачами работы является разработка стандартных протоколов (согласно правилам GLP и GMP) криоконсервирования ткани плаценты и выделения из нее мультипотентных прогениторных клеток.

Целью данного исследования было разработать метод криоконсервирования плаценты человека, охарактеризовать популяции ГПК и ММСК, полученные из нативной и криоконсервированой плаценты.

Материал и методы

Криоконсервирование плаценты. Плаценту получали в условиях родильного зала или операционной после физиологических родов и операции «кесарево сечение» на сроках беременности 39–41 нед. у пациенток в возрасте 23–36 лет на основании предварительно полученного письменного информированного согласия.

Плаценту промывали раствором Хэнкса с добавлением 50 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, переносили в пробирки емкостью 50 мл с 2–3 мл раствора Хэнкса и измельчали на фрагменты 1–3 мм. К фрагментированной ткани добавляли ДМСО (Sigma, США) до конечной концентрации 0,7–1,4 M, помещали в криоампулы и проводили замораживание. Для исследования отбирали образцы ткани, которые не имели бактериальной и грибковой флоры, и по результатам ПЦР-анализа не содержали HCV, HBV, CMV, HSV 1/2, EBV, Trepаnema pallidum, Toxoplasma gondii, HIV-1, Chlamidium trachomonis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Urеаplasma parvum. Криоконсервированные образцы хранили в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание осуществляли на водяной бане (+38…40°С) до появления жидкой фазы, ДМСО из ткани выводили путем медленного добавления раствора Хэнкса.

Выделение плацентарных ГСК. Нативную ткань промывали на шейкере раствором Хэнкса и измельчали, криоконсервированную ткань размораживали. Клетки плаценты выделяли путем ферментации в растворе 0,2% коллагеназы І (Serva, Германия), 0,35 мг/мл гиалуронидазы (Sigma, США) и 100 ед/мл ДНКазы I (Sigma, США), 1 мг/мл BSA в течение 30–40 мин при +37°С, пипетировали и фильтровали через клеточный фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США). Оставшуюся после ферментации ткань заливали свежей порцией ферментов и инкубировали 20–40 мин, добавляли фетальную бычью сыворотку (ФБС) (Gibco, Германия), фильтровали, затем центрифугировали при 300g в течение 10 мин., супернатант удаляли и в осадок клеток вносили PBS с добавлением 0,125 % BSA. Фракции клеток после двух этапов ферментации объединяли. Суспензию клеток наносили на фиколл (Biochrome, Германия) с плотностью 1,077 г/л и центрифугировали при 400 g в течение 30 мин. Полученную фракцию мононуклеаров 2 раза отмывали от фиколла в растворе PBS с добавлением 0,125% BSA, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин.

Определение колониеобразующей активности. Выделенные по представленной выше методике клетки культивировали в среде AIM-V (Gibco, Германия) с добавлением 50 нг/мл SCF, 10 нг/мл G-CSF, 10 нг/мл GM-CSF, 10 нг/мл IL-3, 9 нг/мл Epo (Biochrom, Германия), 30% ФБС (Gibco, Германия) и 0,3% агара. Колонии подсчитывали на живых препаратах на 7-е и 14-е сут. культивирования. На 14-е сут. культивирования культуру фиксировали 2,5% раствором глютаральдегида в течение 10 мин и высушивали 24 ч при комнатной температуре. Перед покраской проводили дополнительное фиксирование метанолом в течение 10 мин. Окрашивали по Романовскому в течение 15 мин.

Получение плацентарных MMСK. Нативную ткань плаценты промывали раствором Хэнкса и измельчали. Криоконсервированную ткань размораживали. Клетки выделяли путем ферментации в растворе 0,2% коллагеназы І (Serva, Германия) и 0,8 ед/мл диспазы (Gibco, Германия) в течение 10–30 мин при температуре 37°С. Для снижения активности ферментов добавляли ФБС (Sigma, США) до конечной концентрации 10%. Полученную суспензию проводили через фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США), фильтрат клеток отмывали путем центрифугирования в течение 10 мин. при 300g и вносили в ростовую среду альфа-МЕМ (Sigma, США), содержащую 15% ФБС (Gibco, Германия), 2 мМ глютамина, 5мм НЕРЕS (Biomedicals), 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, в культуральные флаконы для адгезивных клеток из расчета 300–400 тыс. клеток на 1 см2. Культивирование проводили при 37°С в атмосфере с 5% СО2 со сменой среды 2 раза в неделю, пересев осуществляли при достижении культурой 80–90% конфлюэнтности монослоя в соотношении 1:3, клетки для пересева обрабатывали в течении 3–5 мин 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (Biochrom, Германия) до полного открепления.

Проточная цитофлуориметрия. Иммунофенотипирование суспензии клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами (Becton Dickinson, США) в рабочей концентрации 0,5 мкг на 106 клеток: anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7 , anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue, anti-CD31 PE, anti-CD133 PE. Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуориметр-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения FACS Diva 6.1, анализируя одновременно 2 параметра светорассеяния и 6 параметров флуоресценции. Для настройки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без внесения антител (unstained control), образцы с каждым из антител отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител без одного (fluorescence minus one control).

Дифференцировка ММСК. Для определения способности дифференцироваться в остеогенном направлении культуру клеток на 3 пассаже культивировали с дексаметазоном, β-глицерофосфатом и аскорбат-2-фосфатом в течение 21 сут. Минерализованный матрикс выявляли окрашиванием 1% раствором ализаринового красного. Хондрогенную дифференцировку проводили в среде ДМЕМ с 6,25 мкг/мл инсулин-трансферрин-селенина (Sigma, США), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США), 0,1 мМ аскорбат-2-фосфата (Sigma, США) и 10 нг/мл TGF-β3 (Biochrom, Германия). Выявление протеогликанов осуществляли окрашиванием альциановым синим (Sigma, США). Для адипогенной дифференцировки клетки культивировали в ДМЕМ с добавлением 10% ФБС, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ изобутил-метилксантина (Sigma, США), 100 мМ индометацина (Sigma, США) и 10 нг/мл инсулина в течение 21 сут. Жировые включения выявляли окрашиванием Oil Red (Sigma, США).

Статистическая обработка данных. Уровень экспрессии поверхностных маркеров измеряли в процентах. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Statistica 6.0 (StatSoft) с использованием U-критерия Манна – Уитни.

Результаты

Анализ выделенных из нативной плаценты жизнеспособных мононуклеарных клеток по уровню экспрессии CD45 и параметрам прямого и бокового светорассеяния показал присутствие популяций, похожих на гранулоциты, лимфоциты и моноциты (рис. 1). Содержание гемопоэтических клеток в нативной плацентарной ткани составляло в среднем 81,5% (64,6–93,8%) от фракции мононуклеарных клеток.

По характеру экспрессии CD34 среди CD34+CD45low-клеток можно выделить две популяции: с низким и высоким уровнем экспрессии CD34. Обратное гейтирование плацентарных CD34low-клеток показало, что они, в отличие от клеток пуповинной крови, являются морфологически неоднородной популяцией и лишь очень незначительное их количество по параметрам светорассеивания FSC/SSC соответствует ГПК (рис. 2).

Популяция CD34hi/CD45low-клеток, содержание которой в нативной и криоконсервированной плаценте составляет 1,06% (0,32–2,2%) и 0,78% (0,45–1,21%) соответственно, в большей степени соответствует ГПК пуповинной крови (см. рис. 2).

Анализ по протоколу ISHAGЕ позволяет оценить содержание популяции клеток с фенотипом CD34+/ CD45low/SSClow, которую, по литературным данным, можно отнести к ГПК. Кроме того, используя этот протокол, мы показали, что содержание популяции ГПК среди гемопоэтических клеток нативной и криоконсервированной плаценты человека существенно не отличается и составляет 0,66% (0,36–1,05%, n = 6) и 1,11% (0,18–2,82%) соответственно (рис. 3).

Нужно заметить, что содержание ГПК среди популяции CD34+/CD45low было статистически значимо выше (n = 6, p ≤ 0,05) в суспензии клеток из криоконсервированной плаценты по сравнению с таковыми из нативной ткани и составляло 85,6% (68,9–96,5 %) и 60,8% (44,9–75,6 %) соответственно.

Уровень экспрессии CD90 ГПК из ткани плаценты статистически значимо выше (n = 9, p ≤ 0,05), чем в случае ГПК пуповинной крови, а именно 24,52% (6,24–49,84%) и 2,27% (0,08–10,54%) соответственно.

Нами установлено, что CD34+-клетки и ГПК, выделенные из плацентарной ткани, характеризовались более высоким уровнем экспрессии CD31 по сравнению с соответствующими популяциями клеток пуповинной крови (рис. 4).

Клональный анализ показал, что в плаценте присутствуют предшественники гранулоцитов, эритроцитов и моноцитов, образующих колонии гранулоцитомоноцитов, моноцитов, гранулоцитов и эритроцитов (рис. 5).

При культивировании плацентарных клеток на 9–12-е сут. образовывались агрегаты клеток, вокруг которых начинали распластываться эпителиальные и фибробластоподобные клетки. Такие агрегаты впоследствии давали растущие клоны фибробластоподобных клеток. На 15–19-е сут. культура образовывала монослой (рис. 6).

Цитофлуориметрический анализ стромальных клеток показал высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров: CD105, CD73, CD90 и отсутствие маркеров гемопоэтических клеток CD34, CD133, CD45, CD14 (рис. 7).

При окрашивании культуры плацентарных клеток на 21-е сут. после начала индукции дифференцировки в остеогенном и адипогенном направлениях ализарин красным и красным масляным, был обнаружен минерализованный матрикс и жировые включения, подтверждающие дифференцировку в целевых остеогенном и адипогенном направлениях соответственно (рис. 8).

Обсуждение

В результате проведенных исследований нами установлено, что в плацентарной ткани присутствуют гемопоэтические клетки, которые при цитометрическом исследовании в координатах прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния имеют морфологически сходные с пуповинной кровью характеристики. Среди CD45+-плацентарных клеток присутствуют популяции CD34low/CD45low и CD34hi/CD45low, что также характерно для клеток пуповинной крови [5]. Содержание клеток с фенотипом CD34hi/CD45low составляло 0,46% (0,28–0,67%), что коррелирует с данными, полученными A. Barcena с соавт. (2010) [1].

Путем обратного гейтирования мы показали, что CD34low/CD45low-популяция клеток, в отличие от CD34hі/CD45low, является морфологически неоднородной и содержит небольшое количество клеток, которые морфологически соответствуют ГПК. Нужно отметить, что наличие CD34low/CD45low-клеток с высокой гранулярностью цитоплазмы может указывать на признаки дифференцировки и апоптоза [6]. При культивировании эти клетки образовывали небольшое количество эритроидных и гранулоцитомоноцитарных колоний, что свидетельствует об их более высокой коммитированности по сравнению с CD34hi/CD45low [7].

Рис. 8. Культуры стромальных клеток, 21 сут.: А – контроль к дифференцировке в адипогенном направлении; Б – дифференцировка в адипогенном направлении; В – контроль к дифференцировке в остеогенном направлении; Г – дифференцировка в остеогенном направлении. Окраска: Б – красный масляный; Г – ализариновый красный . Ув. ×50 Таким образом, для количественной оценки ГПК из ткани плаценты мы считаем необходимым использовать протокол ISНAGE [8] и оценивать CD34+/ CD45low/SSClow среди всех жизнеспособных CD45+клеток.

Кроме того, нами показано, что содержание ГПК (CD34+/CD45low/SSClow) в нативной и криоконсервированной ткани плаценты достоверно не отличалось, но содержание клеток SSClow среди CD34+/CD45low было выше в суспензии клеток, полученной из размороженной плаценты, что может свидетельствовать о разрушении высокогранулярных клеток при замораживании-оттаивании ткани аналогично гранулоцитам в костном мозге и пуповинной крови [5].

В связи с тем, что CD34low-популяция по морфологической характеристике неоднородна и вызывает псевдофлюоресценцию на каналах FITC и PE, определение относительного содержания CD90+ и CD31+клеток в этой популяции нельзя считать достоверным в данном исследовании.

ГПК, выделенные из нативной и криоконсервованной плаценты, имеют высокий уровень экспрессии CD90 и CD31, что также было отмечено в работе A. Barcena с соавт. (2009) [7]. Нами показано, что плацентарные ГПК имеют достоверно более высокий уровень экспрессии этих маркеров по сравнению с образцами пуповинной крови, что может говорить о различной функциональной активности этих популяций клеток.

Есть данные о том, что клетки с фенотипом CD34+/СD90+/Lin- имеют более высокую клоногенную активность по сравнению с CD34+/CD90-/Lin-, а сортировка популяции CD34+/CD90+ клеток костного мозга ведет к обогащению на LTC-IC (long term culture-initiating cell) и HPP-CFC (high proliferative potential-colony forming cells), и эти клетки имеют мультилинейный потенциал [9]. Также известно, что CD90 экспрессируется ГПК пуповинной крови [10] и фракция клеток с фенотипом Lin-/CD34+/CD38–/ CD90+/CD45RA содержит гемопоэтические стволовые клетки [11].

CD31 экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках желточного мешка мышей [12], мультилинейных прогениторах, предшественниках миелоидных и В-лимфоидных клеток костного мозга человека [13]. Функция CD31 ГПК недостаточно изучена, но выяснено что этот белок обеспечивает взаимодействие со стромальными клетками ниши и участвует в трансэндотелиальной миграции [14]. Таким образом, высокий уровень экспрессии CD31 плацентарными ГПК, возможно, связан с их взаимодействием со стромальными клетками микроокружения. Также добавление блокирующих антител против CD31 к клеткам пуповинной крови в культуре приводило к значительному повышению количества БОЕ-Э и КОЕ-ГМ, что указывает на роль CD31 в процессах дифференцировки [15].

Нами показано, что при культивировании плацентарных клеток как до, так и после криоконсервирования, наблюдается рост КОЕ-ГМ и БОЕ-Э, что также описано в работах других авторов [2, 16].

В работе V. Serikov с соавт. (2009) описан метод криоконсервирования целостной плаценты с использованием перфузии раствором криопротекторов (15% пропилен гликоля, 14% DMSO, 14% формамид и 57% PBS) с пенициллином 100 U/мл, стрептомицином 100 мг/мл, фунгизоном 0,25 мг/мл и замораживанием при -80°C в течение 12 ч, после чего ткань переносили в жидкий азот для хранения при -196°C. Трансплантация мобилизованных ГПК из криоконсервованной плаценты с использованием AMD-3100 облученным иммунодефицитным мышам линии NOD/SCID приводит к восстановлению гемопоэза и химеризму клеточного состава крови и костного мозга [16].

Недостатком данного метода является использование мобилизирующих агентов и замораживание цельной плаценты, что требует проведения перфузии, при которой необходимо использовать антикоагулянты. Такой метод технически более сложен, чем механическое измельчение плаценты ножницами, а также не предусматривает возможность долговре менной транспортировки плацент (несколько часов) с места получения до места, где производится выделение и(или) банкирование.

Следует отметить, что использование педложенной нами методики криоконсервирования позволяет порционно использовать материал, обеспечивает лучшее проникновение криопротекторов и не требует использования высоких концентраций криопротекторов, которые являются токсичными для клеток. Результаты наших исследований продемонстрировали, что ММСК, выделенные из криоконсервованной плаценты, характеризуются следующим иммунофенотипом: CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/ CD45–/CD34–/CD133–/CD14–, что согласуется с данными других авторов [17, 18].

Культура стромальных клеток плаценты в присутствии индукторов адипогенеза и остеогенеза дифференцируется в целевых направлениях, хотя нужно отметить ее относительно низкий остеогенный потенциал in vitro, что также описано в работе G.A. Pilz с соавт. (2011).

Все представленные выше данные доказывают, что плацента человека является важным органом гемопоэза и может служить еще одним перспективным источником как ГПК, так и ММСК для нужд регенеративной медицины.

Таким образом, разработка научно и экономически обоснованной технологии получения ГСК и ММСК из криоконсервированной ткани плаценты, а также внедрение широкомасштабной программы по организации криобанка таких клеток является актуальным направлением в области практической медицины, включая онкогематологию.

Выводы

1. Разработанный метод криоконсервирования дает возможность выделить из размороженной ткани плаценты функционально активные ГПК и ММСК.

2. В ткани нативной и криоконсервированной плаценты присутствуют популяции клеток CD34low/ CD45low и CD34hi/CD45low .

3. Относительное содержание клеток SSClow в популяции CD34+/CD45low, полученных из криоконсервированной плаценты, достоверно выше, чем из нативной.

4. Выделенные из ткани плаценты ГПК с фенотипом CD34+/CD45low/SSClow характеризуются более высоким уровнем экспрессии маркеров CD90 и CD31 по сравнению с ГПК пуповинной крови.

5. Из криоконсервованной ткани плаценты может быть получена культура стромальных клеток с иммунофенотипом CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/ CD45–/CD34–/CD133–/CD14– и способностью к направленной дифференцировке in vitro в адипогенном и остеогенном направлениях.

Подняться вверх сайта