Поиск Кабинет

Коррекция ориентировочно–исследовательского дефицита у крыс с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 65-72

 

Авторы

Соколова И.Б., Федотова О.Р., Гилерович Е.Г., Билибина А.А., Павличенко Н.Н., Кругляков П.В., Полынцев Д.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучена возможность коррекции нарушений двигательного и исследовательского поведения у крыс после минимальной травмы сенсомоторной коры головного мозга. Показано, что поведение животных из группы клеточной терапии в тесте «открытое поле» полностью восстановилось к 4 нед., тогда как спонтанного повышения двигательной и исследовательской функций у животных контрольной группы не произошло. После трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в пограничной с повреждением зоне увеличилось, по сравнению с контрольной группой, количество микрососудов и морфологически неповрежденных нейронов, что уменьшает объем ткани, затронутой отсроченной дегенерацией. Введение ММСК предотвратило дегенерацию проводящих путей в хвостатом ядре.

Введение

Повреждение сенсомоторной коры головного мозга неизбежно приводит к нарушению поведенческого и неврологического статуса. Высокая степень инвалиди-зации после черепно-мозговых травм, особенно среди мужчин моложе 35 лет, требует интенсивной разработки новых методов лечения и реабилитации. Ранее было показано, что клеточная терапия ишемического инсульта головного мозга с помощью мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) приводила к практически полному восстановлению поведения животных примерно через 4 нед. [1] и к частичному улучшению неврологического статуса к этому же сроку после травмы [2, 3]. Трансплантация ММСК после инсульта стимулировала ангиогенез в ткани, пограничной с областью ишемии, оказывала нейропротекторное воздействие, активировала эндогенные репаративные процессы, уменьшала объем повреждения [4].

Цель исследования — изучить влияние внутривенной трансплантации аллогенных ММСК на ориентировочноисследовательское поведение крыс после повреждения сенсомоторной коры.

Материал и методы

Эксперименты проведены на нелинейных половозрелых крысах — самках (п = 110) массой 250^300 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище; исследования проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986).

Выделение ММСК. Костный мозг (КМ) выделяли из диафизов бедренных костей животных сразу после де-капитации. Для этого диафизы промывали средой (—MEM (Hyclone, Новая Зеландия), 20% сыворотка крови плодов коров (Gibco, США), 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Gibco, США)). КМ высевали на пластиковые чашки Петри (Sarstedt, Германия) и, отмыв через 48 ч после эксплантации от форменных элементов крови с помощью раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), культивировали ММСК в монослое при 37°С и 5% С02 в течение 6^7 сут. Для пересева культуры ММСК крыс использовали раствор трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток.

Фенотипирование ММСК крыс проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуо-риметре Epics XL (Beckman Coulter, США). ММСК инкубировали с антителами против маркера CD45 (Beckton Dickinson, США) и антителами против маркеров CD90, CD106 (Beckton Dickinson, США). Для этого клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия), дважды промывали раствором PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), на 1 ч переносили в раствор моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромом, в разведении 1:20. Затем клетки дважды промывали раствором PBS и оценивали интенсивность свечения. Фенотипирование проводили после первого, второго и третьего пересева культуры.

Окрашивание ММСК флуорохромом РКН26 проводили после третьего пересева культуры. Для этого клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия), дважды промывали раствором PBS, на 4 мин. помещали в раствор РКН26 (из расчета 33 мкл на 10 млн клеток), блокировали дальнейшее окрашивание сывороткой крови плодов коров (Gibco, США). Окрашенные клетки суспендировали в питательной среде без сыворотки (—MEM +100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина) с финальной концентрацией 5x108 клеток в 100 мкл. Эффективность окрашивания ММСК оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRX (Leica, Германия).

Повреждение сенсомоторной коры головного мозга. Крыс наркотизировали золетилом (Zoletil 100, Франция) (30 мкл раствора) интраперитонеально. С помощью бормашины в теменной кости высверливали отверстие диаметром 3 мм, удаляли твердую мозговую оболочку и специальной ложечкой отбирали 1 мм3 ткани головного мозга в задне-лобной области сенсомоторной коры (от брегмы -1,0—1,5). Кожную рану ушивали.

Группы экспериментальных животных:

1) интактные животные — 30 шт.;

2) контрольные животные (проведено повреждение головного мозга без каких-либо дополнительных воздействий) — 30 шт.;

3) клеточная терапия (непосредственно после повреждения головного мозга в хвостовую вену было введено 5 млн ММСК в 100 мкл культуральной среды) — 50 шт.

Поведенческое тестирование. Поведение животных в тесте «открытое поле» изучали за несколько дней до нанесения мозговой травмы и через 2 и 4 нед. после операции.

«Открытое поле» представляло собой округлую площадку диаметром 80 см, ограниченную непрозрачными бортами высотой 30 см, с 16 равномерно расположенными отверстиями — «норками» диаметром 3 см каждое. Животное помещали в центр поля и регистрировали длительность и последовательность поведенческих актов. Идентификацию отдельных поведенческих актов в «открытом поле» проводили на основании классификации индивидуального поведения, предложенного В.П. Пошиваловым, с поправками Е.С. Петрова и В.В. Шабаева [5, 6]. Ориентировочно-исследовательскую активность оценивали по актам «норки», «локомоция», «вертикальные стойки», «стойки с упором», «обнюхивание». Эмоциональное состояние — по актам «гру-минг», «движение на месте», «вертикальные стойки». Локомоторное поведение — по актам «локомоция», «сидит», «движение на месте». Для регистрации длительности и последовательности всех актов поведения, демонстрируемых животными, использовали оригинальную программу «open field» для IBM PC, разработанную сотрудниками Физиологического отдела им. И.П. Павлова НИИ Экспериментальной медицины Е.С. Петровым и В.В. Шабаевым [6]. При статистической обработке достоверность различий двух выборок оценивали при помощи непараметрического критерия U Вилкоксона — Манна — Уитни (программа Statistica V. 6.0) с уровнем достоверности (р < 0.05).

Выведение животных из эксперимента было проведена через 1, 2 и 4 нед. после нанесения травмы. Под наркозом по 11 крыс из каждой группы подвергли па-равитальной фиксации — перфузии через левый желудочек сердца 4% раствором параформальдегида в PBS со скоростью 3 мл/мин. Животных декапитировали, извлекали головной мозг и вырезали сегмент, включающий видимую зону повреждения и интактные краевые зоны. 8 образцов мозга из каждой группы фиксировали по стандартной методике в параформальдегиде, а 3 -криофиксировали. Перед криофиксацией фиксированные сегменты ткани мозга помещали в раствор криопротектора (сахарозы) на 1 сут. Затем их охлаждали в парах азота в течение 10 с, погружали в жидкий азот на 1 ч и помещали в холодильную камеру с температурой ^70°С.

Структуры мозга идентифицировали по атласу [7].

Детекцию флуресцентно меченных ММСК в головном мозге проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRX (Leica, Германия) на гистологических срезах толщиной 7 мкм (криофиксация), изготовленных на криостате Leica СМ 1510 (Leica, Германия).

С помощью иммуногистохимического анализа изучали пролиферацию клеток в субэпендимной зоне боковых желудочков головного мозга, жизнеспособность нейронов в пограничной с повреждением области; активацию ангиогенеза в нервной ткани. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием первичных антител к PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) (Abeam, Великобритания), NeuN (маркерный белок ядер нейронов) (Chemicon, США), vWF (фактор фон Вил-лебрандта, тромбоцитарно-эндотелиальный фактор свертывания крови, синтезирующийся в эндотелиоцитах и тромбоцитах) (Abeam, Великобритания).

Для проведения реакции срезы головного мозга де-парафинизировали в трех порциях орто-ксилола, затем регидратировали в спиртах понижающейся концентрации по стандартной методике. Промывали в дистиллированной воде и переносили в 3% перекись водорода для блокировки эндогенной пероксидазы. Срезы промывали в PBS и наносили на них первичные антитела. После инкубации во влажных камерах двукратно промывали в PBS. Дальнейшую обработку производили при помощи наборов LSAB2/HRP-rat (Dako, Дания) или Envision + System-HRP (Dako, Дания). При использовании набора LSAB2/HRP-rat после инкубации с вторичными антителами из набора и двукратной промывки PBS наносили конъюгат стрептавидина и пероксидазы из того же набора. Инкубировали во влажных камерах при комнатной температуре. При использовании Envision + после инкубации с первичными антителами и двукратной промывки PBS наносили раствор из набора. Инкубировали во влажных камерах при комнатной температуре.

Затем (при использовании любого набора) после двукратной промывки наносили рабочий раствор хромогена DAB (DAB + , Dako, Дания). Образование окрашенного продукта реакции контролировали под микроскопом. Препараты докрашивали астровым синим, толуидиновым синим или гематоксилином, дегидратацию и заключение в пермаунт проводили по стандартной методике.

При проведении реакции с антителами к vWF перед нанесением первичных антител проводили процедуру теплового демаскирования антигена. Для этого срезы помещали в раствор для демаскирования антигенов (Dako, Дания) и инкубировали на водяной бане при температуре +95°С в течение 20 мин. Затем срезы промывали PBS и проводили все вышеописанные процедуры. При окраске каждым антителом проводили положительный и отрицательный контроль окрашивания.

Количество жизнеспособных нейронов подсчитывали на препаратах после окраски антителами против NeuN в ипсилатеральном полушарии в неокортексе в пограничной с повреждением зоне через 4 нед. после нанесения травмы.

Количество микрососудов подсчитывали на препаратах после окраски антителами против vWF в ипсилатеральном полушарии в неокортексе (первичная соматосенсорная кора) по границе повреждения ткани в пределах 30 мкм под микроскопом Leica DM 10ОО (Leica, Германия) через 4 нед. после нанесения травмы.

Количество пролиферирующих клеток определяли на препаратах после окраски антителами против PCNA через 1 нед. после операции в субэпендимной зоне боковых желудочков; в глубокой части хвостатого ядра ипсилатерального полушария — через 1 и 2 нед. после повреждения сенсомоторной коры.

Полученные количественные данные были обработаны с помощью непараметрических критериев пакета программ Statistica v. 6 (Stat Soft Inc) с уровнем достоверности р < 0,05.

Результаты

Анализ культуры ММСК беспородных крыс методом проточной цитофлуориметрии показал, что она состояла из CD 45+-клеток (клеток гемопоэтического ряда) — 3% и С090+-клеток (собственно ММСК) — 97%, среди которых было 15% CD 106+-клеток (рис. 1). Полученные клетки были способны дифференцироваться в остеогенном, адипоцитарном, хондрогенном и в нейрональном направлении.

Поведенческое тестирование. Результаты тестирования животных в «открытом поле» представлены на рис. 2, 3. При первичном тестировании все животные продемонстрировали выраженную локомоторную и поисковую активность. Травмирование головного мозга привело к изменению индивидуального поведения животных. Через 2 нед. после травмы контрольные животные были заторможены, и исследовательская активность была значительно снижена. Применение клеточной терапии существенно улучшало поведение животных. Так, через 2 нед. количество актов «локомоция» у контрольных животных было в 2 раза ниже, чем в группе ММСК (35 и 70 актов соответственно); «обнюхивание» — в 1,8 раза ниже (39 и 71 актов соответственно); «стойка с упором» — в 1,6 раза меньше (5 и 8 актов соответственно); «исследование норок» — в 1,6 раза меньше (3 и 5 актов соответственно); продолжительность гру-минга - в 2 раза дольше (12 и 6 с соответственно); движения на месте - вЗ раза дольше (15 и 5 с соответственно). При этом большинство показателей у животных в группе клеточной терапии соответствовало аналогичным показателям у интактных животных. Через 4 нед. после операции соотношение количества ключевых актов поведения между животными контрольной группы и группы клеточной терапии было примерно таким же. Кроме того, контрольные животные большую часть времени находились на одном месте (акты «движение на месте» и «сидит») или занимались грумингом, что в совокупности можно расценить как значительное снижение двигательной активности.

Распределение ММСК в головном мозге. Исследования криосрезов мозга животных из групп клеточной терапии с помощью флуоресцентного микроскопа показало, что меченые ММСК, трансплантированные внутривенно в день нанесения травмы, распределялись непосредственно в ткани, пограничной с зоной повреждения. Флуоресцентно меченных клеток не было выявлено ни в контрлатеральном полушарии, ни в областях ипсилатерально полушария, удаленных от мозгового дефекта (рис. 4).

Морфологический анализ головного мозга. Нанесенная минимальная травма локализовалась в неокортексе, не затрагивая другие структуры мозга.

Группа контроля. Через 1 нед. отмечена отсроченная дегенерация прилежащих к хирургической травме и не поврежденных механически глубоких слоев коры.

При иммуногистохимическом исследовании на PCNA в субэпендимной зоне ипсилатерального и контралатерального боковых желудочков обнаружены пролиферирующие клетки (рис. 5А, Б; рис. 6).

Единичные пролиферирующие клетки выявлены в проводящих путях глубокой части хвостатого ядра ипсилатерального полушария (рис. 7А; рис. 8).

Через 2 нед. в ткани по границе повреждения и в глубоких слоях поврежденной коры был выявлен воспалительный инфильтрат. В проводящих путях ипсилатераль-ного хвостатого ядра также выявлены пролиферирующие клетки (рис. 7Б).

К 4 нед. значительная часть нервных клеток в пограничной зоне дегенерировала (рис. 9А, В). Количество микрососудов в этой же области представлено на рис. 10А, В. Травматическая полость снаружи мозга закрыта разрастанием менингоцитов, астроцитов, фибробластов. Наружная глиальная мембрана не определялась. В поврежденной тканевой области сформировались кисты, в которых выявлено незначительное число клеток фибробластов.

Группа клеточной терапии. Через 1 нед. в погибших участках неокортекса выявлены лейкоциты и небольшое количество макрофагов. Непосредственно в зоне некроза видны полости, что свидетельствует о начале распада ткани.

В субэпендимной зоне боковых желудочков выявлены пролиферирующие клетки (рис. 5В, Г; рис. 6). Отдельные пролиферирующие клетки были обнаружены в хвостатом ядре (рис. 7В; рис. 8).

Через 2 нед. в пограничной с повреждением области наблюдались, в основном, глиальные клетки (астроци-ты и микроглия), а также большое число мелких сосудов. В хвостатом ядре выявлены единичные пролиферирующие клетки (рис. 7Г; рис. 8).

Через 4 нед. в коре головного мозга образовался рубец из 1—2 рядов клеток, среди которых определялись астроциты и фибробласты. В пограничной области практически все нейроны были морфологически сохранны (рис. 9Б, В). Выявлено большое количество сосудов (рис. 10Б, В).

Травматическая полость снаружи мозга закрыта разрастанием менингоцитов, астроцитов, фибробластов. Наружная глиальная мембрана не определялась. В полости кист видны зернистые шары и незначительное число клеток, преимущественно фибробластов.

Обсуждение

Удаление минимального участка сенсоматорной коры головного мозга приводило к значительному нарушению ориентировочно-исследовательского поведения животных. Примерно в 2 раза уменьшалось количество перемещений по установке «открытое поле» и исследовательских актов (обнюхивание, стойки с упором, вертикальные стойки, обследование норок). При этом значительно возрастало время, проведенное животным на одном месте — движение на месте, груминг, сидение (см. рис. 2). В течение 4 нед. не произошло спонтанного восстановления поведения, наоборот, еще более значительную часть времени животные стали проводить сидя на одном месте (см. рис. 3).

Применение ММСК кардинальным образом изменило картину восстановления поведения животных после травмы.

Следует отметить, что беспородным крысам, которые были использованы в представленном эксперименте, мы трансплантировали аллогенные клетки. Животные в группе клеточной терапии восстановили свое двигательное и исследовательское поведение гораздо быстрее, чем в контрольной группе. Уже через 2 нед. после повреждения головного мозга у животных, которым была проведена трансплантация ММСК, количество основных актов в тесте «открытое поле» было в 1,5—1,7 раза больше, чем у контрольных. Через 4 нед. поведение крыс из группы клеточной терапии полностью восстановилось до уровня интактных животных, а контрольные животные оставались малоподвижными и заторможенными.

Каким образом внутривенная трансплантация ММСК могла повлиять на восстановление ориентировочно-исследовательского поведения животных?

Минимальное механическое повреждение коры головного мозга разрушает гематоэнцефалический барьер. Для ММСК, введенных в хвостовую вену сразу после операции, нет препятствий для проникновения в мозг. Действительно, мы выявили флуоресцентно меченые клетки непосредственно в ткани, окружающей место повреждения. В других участках мозга флуоресцентно меченых клеток не обнаружено. Такое же распределение ММСК, трансплантированных в вену, было зарегистрировано и в ранее проведенных работах [8, 9].

ММСК, как было показано в исследованиях in vitro, выделяют большое количество факторов, стимулирующих (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, GM - CSF - granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, TNF — tumor necrosis factor), регулирующих (IL-11) и ингибирующих (IL-4, IL-10, bTGF — transforming growth factor) воспалительные процессы [10, 11], активирующих ангиогенез и предотвращающих апоптоз: VEGF (vascular endothelial growth factor), BDNF (brain — derived neurotrophic factor), NGF (nerve growth factor), EGF (epidermal growth factor) и bFGF (basic fibroblast growth factor) [12]. Вполне вероятно, что паракринная функция ММСК имеет место и in vivo, когда клетки находятся в пограничной с повреждением зоне или в ткани пораженного органа. Действительно, мы выявили, что в самом месте тканевого дефекта быстрее протекали процессы воспаления и образования рубцовой ткани. В группе клеточной терапии к 4 нед. в пограничной с повреждением области головного мозга количество микрососудов и жизнеспособных нейронов было больше, чем в контроле в 1,6 и 1,7 раза соответственно. Следовательно, внутривенная трансплантация ММСК привела к уменьшению площади отсроченной дегенерации клеток в неокортексе. Ранее было показано, что травмирование коры головного мозга активирует пролиферацию клеток в субэпендимной зоне боковых желудочков [10]. В наших экспериментах мы также выявили пролиферирующие клетки в этой области мозга.

На модели ишемического инсульта у крыс было показано, что эндогенные клетки, пролиферирующие в субэпендимной зоне, затем мигрировали в направлении места повреждения головного мозга [13]. Эти клетки окрашивались антителами против нейрональных маркеров, таких как NeuN, Dcx, Tuj 1, что свидетельствует об их дифференцировке в нейрональном направлении [14]. Вероятно, пролиферация эндогенных стволовых клеток в субэпендимной зоне, их миграция к месту повреждения и дифференцировка в нейрональном направлении представляют собой ограниченную регенерацию во взрослом головном мозге. Предполагают, что экзогенные ММСК, трансплантированные животному с ишемическим повреждением головного мозга, стимулируют пролиферацию эндогенных стволовых клеток в субэпендимной зоне посредством выделения ряда ней-трофинов (BDNF, NGF, bFGF, EGF, NT3, NT4 -neurotrophin 3, 4) и ростовых факторов, таких как PDGF (platelet-derived growth factor), SCF (stem cell factor), LIF (leukaemia inhibitory factor) (12, 15).

Трансплантация ММСК после минимального повреждения сенсомоторной коры не привела к стимуляции данного процесса, как это происходило при ишемическом инсульте [8]: количество пролиферирующих клеток в субэпендимной зоне у животных контрольной группы и группы клеточной терапии было примерно одинаковым. Возможно, при столь незначительной травме не происходит стимуляции эндогенных ММСК к выделению вышеназванных нейтрофинов и ростовых факторов, а, следовательно, пролиферация клеток в субэпендимной зоне обусловлена только повреждением головного мозга.

В данном исследовании был выявлен еще один очень интересный факт. Через 2 нед. после травмы в области проводящих путей глубокой части хвостатого ядра у животных контрольной группы были обнаружены пролиферирующие клетки. У животных из группы клеточной терапии пролиферации в этой зоне мы не выявили. Хвостатое ядро получает нисходящие пути от неокор-текса через подмозолистый пучок [16]. Повреждение нейронов сенсомоторной коры вызывает дегенерацию нижележащих проводящих путей, проходящих через глубокую часть хвостатого ядра. В месте гибели нейронов или их отростков значительно увеличивается количество пролиферирующих астроцитов [17]. Вероятно, мы выявляем пролиферацию именно этих клеток. Предположение о том, что трансплантация ММСК ускоряла процессы дегенерации поврежденных проводящих путей и пролиферация астроцитов могла пройти в более ранние сроки, оказалось несостоятельным. Окраска антителами против PCNA срезов головного мозга животных, зафиксированных через 1 нед. после травмы, позволила выявить только единичные пролиферирующие клетки в хвостатом ядре в обеих группах. Следовательно, наиболее правдоподобно предположение, что внутривенная трансплантация предотвращала разрушение проводящих путей. Каким образом? Во-первых, мы показали, что после трансплантации сохраняется жизнеспособность нейронов в пограничной с повреждением зоне, следовательно, сохраняются и аксоны, идущие от этих нервных клеток. Во-вторых, аксоны от нейронов сенсомоторной коры могут идти как непосредственно в хвостатое ядро, так и к вставочным нейронам неокортекса. Вероятно, что после травмирования погибают и вставочные нейроны в пограничной с повреждением области на уровне от -1 до -1,5 от брегмы, не затронутые механически. Клеточная терапия приводит к сохранению вставочных нейронов и их аксонов. Следовательно, в группе клеточной терапии в проводящих путях хвостатого ядра дегенерируют только волокна, отходящие непосредственно от нейронов, которые механически удаляются из коры. Мы предполагаем, что доля таких волокон относительно общего объема проводящих путей незначительна и, вероятно, их гибель не стимулирует пролиферацию астроцитов.

Сохранение проводящих путей хвостатого ядра, в свою очередь, имеет большое значение для восстановления ориентировочно-исследовательского поведения у крыс. Действительно, аксоны нейронов хвостатого ядра проецируются на нервные клетки черной субстанции и интерпедункулярного ядра. С другой стороны, имеются связи хвостатого ядра с двигательной и премоторной зоной фронтальной коры через корти- ко-спинальный и кортикобульбарный тракты. Известно, что хвостатое ядро, совместно со своими проводящими путями, входят в экстрапирамидную систему мозга, которая осуществляет регуляцию непроизвольных компонентов моторики: мышечного тонуса, координации движений, позы. В случае нарушения морфологической структуры этих проводящих путей следует ожидать негативного изменения в поведении животных, что и было выявлено в наших опытах в тесте «открытое поле».

Итак, внутривенная трансплантация ММСК после удаления минимального участка сенсомоторной коры привела к сохранению микроциркуляции и жизнеспособности части нейронов в пограничной с повреждением зоне, а, следовательно, процессами вторичной дегенерации затронут меньший объема ткани мозга. Сохранение нейронов в сенсомоторной коре позволило минимизировать количество дегенерирующих волокон в проводящих путях экстрапирамидной системы, тем самым сохранив моторику животных, что способствовало полному восстановлению ориентировочно-исследовательского поведения.

Подняться вверх сайта