Поиск Кабинет

Количественный эффект повышения остеоиндуктивности материала за счет включения в него рекомбинантного морфогенетического белка кости rhВМР-2

Гены & Клетки: Том VII, №2, 2012 год, стр.: 75-81

 

Авторы

Чеканов А.В., Фадеева И.С., Акатов В.С., Соловьева М.Е., Вежнина Н.В., Лекишвили М.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время для «регенеративной медицины», травматологии и ортопедии активно разрабатываются остеоиндуктивные материалы с применением рекомбинантных морфогенетических белков кости (rhBMP). Для оценки эффективности включения rhBMP в материалы большое значение имеет изучение их остеоиндуктивных свойств в экспериментальных моделях in vivo. В настоящей работе показано, что включение морфогенетического костного белка rhBMP-2 в блоки деминерализованной губчатой кости обеспечивает выраженное повышение остеоиндуктивности материала в гетеротопической модели подкожной имплантации крысам, что выражается в многократном ускорении минерализации материала и в индукции формирования в нем структурированного неоколлагена. Модель гетеротопической подкожной имплантации крысам является удобной тест-системой для выявления степени остеоиндуктивности материалов, содержащих rhВМР-2, а также для выявления особенностей гетеротопического остеогенеза в таких материалах.

В настоящее время в мире активно проводятся работы, направленные на создание остеоиндуктивных материалов нового поколения, в которых применяются рекомбинантные морфогенетические белки кости (rhBMPs), в первую очередь rhВМР-2 [1–3]. Белки семейства ВМР являются одними из ключевых факторов в ремоделировании и регенерации костной ткани [4, 5]. Эти белки обладают мощным остеоиндуктивным действием и способны стимулировать образование новой костной ткани путем индукции дифференцировки мезенхимальных клеток в функционально активные остеобласты [6]. Указанное свойство белков ВМР послужило основой для их применения в медицине с целью повышения эффективности регенерации костной ткани [3, 6–8]. С 2002 г. в США и Европе началось использование в клинической практике материала, содержащего коллаген и рекомбинантный человеческий белок rhBMP-2 под коммерческим названием «Infuse» (Medtronic, USA) [9, 10]. Однако до сих пор неясно в какой степени эти белки, добавленные к конкретному остеокондуктору, повышают эффективность регенерации костной ткани. Дело в том, что используемые в настоящее время остеокондуктивные материалы обеспечивают миграцию в зону повреждения клеток реципиента, которые секретируют различные цитокины. Эти цитокины, включая BMPs, вызывают, в частности, остеобластическую дифференцировку клеток, и, соответственно, обеспечивают регенерацию костной ткани. Именно поэтому для оценки эффекта применения рекомбинантных морфогенетических костных белков в имплантируемых материалах необходимы экспериментальные исследования in vivo, которые позволили бы ответить на вопрос, в какой степени применение rhBMPs в конкретном материале способно улучшить его остеоиндуктивность [11].

В ИТЭБ РАН разработана технология получения рекомбинантного морфогенетического белка кости rhBMP-2 [12, 13]. В настоящей работе показано, что включение этого белка в деминерализованный костный матрикс позволяет в десятки раз повысить эффективность его минерализации в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам, а также способствует формированию в нем структурированного неоколлагена.

Материал и методы

Получение rhBMP-2. Рекомбинантный человеческий морфогенетический белок rhBMP-2 получали в бактериальной системе экспрессии по технологии, разработанной в ИТЭБ РАН [12, 13].

Материалы. В работе использовали ксеногенную (крупный рогатый скот) деминерализованную губчатую кость (ДГК) в виде стерилизованных гамма облучением (доза 25 кГр) фрагментов размером 7×5×4 мм, предоставленных тканевым банком Центрального института травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. Фрагменты предварительно трижды отмывали физиологическим раствором (рН 7,4) и высушивали при комнатной температуре в условиях вакуума (1 мм рт. ст.) (группа 1, контроль 1). Часть фрагментов группы 1 обрабатывали 6М раствором гуанидин хлорида в деионизованной воде, отмывали и высушивали, как описано выше. Затем, часть обработанных гуанидин хлоридом фрагментов ДГК заполняли в условиях вакуума (1 мм рт. ст.) раствором альгината натрия (1%) с 30 mM HEPES, pH 7,4, содержащим 0,5 мкг/мл rhBMP-2 и 400 мкг/мл гентамицина. После этого фрагменты переносили в раствор хлористого кальция (100 мМ) на 1 ч для формирования геля альгината натрия, отмывали их в фосфатно-солевом буфере рН 7,4 и хранили при +4°С (группа 2, опыт). Такая процедура позволяла полностью заполнять все пустоты ДГК, включая межтрабекулярное пространство, альгинатным гелем. Об этом можно было судить, в частности, по прозрачности полученного композитного материала. Часть фрагментов группы 1 также заполняли по описанной выше методике альгинатным гелем, но без rhBMP-2 (группа 3, контроль 2). Часть фрагментов, обработанных раствором гуанидин хлорида, также заполняли альгинатным гелем без rhBMP-2 (группа 4, контроль 3). Все операции проводили в стерильных условиях, используя стерильные растворы. Гель альгината натрия применяли для удержания белка в матриксе [14].

Модель гетеротопической имплантации под кожу крысам. Для изучения кальцификации материалов in vivo применяли известный метод подкожной имплантации крысам [15–17]. Фрагменты ДГК имплантировали крысам линии Wistar под кожу в область спины, используя тиопенталовый наркоз (3 мг/100 г веса). Опытные и контрольные группы животных состояли из молодых самцов весом 180±10 г. и содержались в стандартных условиях вивария. Через 6 нед. после имплантации материалы эксплантировали и использовали для количественного определения минерализованного кальция и гистологического анализа. Цель исследования и экспериментальный протокол работы с животными были одобрены этическим комитетом Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Количественное определение степени минерализации имплантатов. Фрагменты ткани после эксплантации отмывали в течение 4 ч в дистиллированной воде, высушивали в течение 2 ч при 100°С и измеряли сухой вес образцов. Затем фрагменты помещали в 0,1М HCl на 24 ч для растворения минерализованного кальция, после чего проводили измерение количества минерализованного кальция, используя тест истему AS FS Arsenazo III (DiaSys, Германия). Удельное количество минерализованного кальция (мг/г сухого веса материала) определяли для каждого фрагмента, затем усредняли полученные значения по всем образцам группы, имплантированным разным крысам, и определяли стандартную ошибку.

Гистологический анализ. После 6 нед. имплантации контрольные и опытные образцы материалов извлекали из крыс, фиксировали в 10% нейтральном формалине 18 ч при 4°С, отмывали от фиксатора в фосфатно-солевом буфере без кальция и магния в течение 24 ч, помещали в заливочную среду TissueTek O.С.T. Compound (Sakura), инкубировали 12 ч и делали криосрезы толщиной 11 мкм при -16°С, используя криотом Shandon E620 (Thermo). Для выявления изменений в структуре имплантированной ткани наряду со стандартными гистологическими окрасками использовали флуоресцентные красители. Для световой микроскопии применяли окраску криосрезов трихром по Касону для выявления клеток и коллагена, либо ализариновым красным S для выявления минерализованного кальция [18, 19]. Для флуоресцентной микроскопии криосрезы окрашивали ядерным красителем этидия бромидом. Ядра клеток флуоресцировали красным цветом, коллаген синим, гель альгината натрия – однородным синим цветом. Гистологический анализ выполняли на микроскопе Leica DM3000, флуоресцентный анализ – на конфокальном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5 (Германия).

Статистика. Статистическую значимость различий средних значений для разных групп оценивали с использованием U-критерия Манна – Уитни (р < 0,05).

Результаты

Гистологический анализ материалов после имплантации

На рис. 1 представлена микрофотография криосреза фрагмента ДГК, обработанного гуанидин хлоридом и заполненного гелем альгината натрия с rhBMP-2, извлеченного после 6 нед. имплантации под кожу крысам. Видно (рис. 1А), что в имплантированный материал мигрировали клетки реципиента (до имплантации клетки в материале отсутствовали), и эти мигрировавшие клетки не проникали в альгинатный гель (равномерно окрашенные участки темно-сиреневого или темно-синего цвета). Фотографии препарата при большем увеличении показывают, что по всему материалу выявляется резорбция коллагена ДГК. Следует отметить, что резорбция коллагена была лишь частичной (области 2, рис. 1Б). Практически по всему материалу наряду с деградацией «старого» коллагена ДГК выявлено формирование «нового» структурированного коллагена, расположенного слоем (рис. 1А, Б) вблизи поверхности альгинатного геля, содержащего rhBMP-2, причем клетки локализованы, в основном, именно в этих слоях «нового» коллагена. То, что в областях частично резорбированного коллагена ДГК отсутствовали клетки реципиента, подтверждается также данными флуоресцентной микроскопии. На рис. 1В видно, что клетки (ядра клеток флуоресцируют красным цветом) отсутствовали и в альгинатном геле (равномерно флуоресцирующие синим цветом области препарата) и в области резорбируемого коллагена ДГК, однако в большом количестве обнаруживались в структурированом неоколлагене, обращенном к альгинатному гелю. Это хорошо заметно при большом увеличении на микрофотографии криосреза, окрашенного этидиум бромидом (рис. 1Г). На рисунке определяются волокна неоколлагена (синий цвет), располагающиеся параллельно поверхности альгинатного геля (однородная синяя флуоресценция), в которых локализованы клетки реципиента (рис. 1Г). При этом в частично разрушенном коллагене ДГК практически не наблюдалось ядер клеток (рис. 1В, Г). На препарате, окрашенном трехцветным методом Касона, слой структурированного неоколлагена достаточно регулярно находится на некотором удалении от альгинатного геля (рис. 1А, Б), однако во многих местах он плотно прилегает к гелю. Флуоресцентная микроскопия также показывает, что есть участки препарата, где структурированный неоколлаген плотно прилегает к альгинатному гелю, но есть области между неоколлагеном и альгинатным гелем свободные от клеток и коллагенового матрикса (рис. 1В, Г).

В контрольных фрагментах ДГК, обработанных гуанидин хлоридом и заполненных гелем альгината натрия без rhBMP-2, после 6 нед. имплантации наблюдается принципиально иная картина (рис. 2). В этом случае клетки также, как в опыте, мигрировали в материал и не проникали в альгинатный гель. Однако, в отличие от группы опыта, клетки при этом формировали неорганизованный фиброзный коллагеновый матрикс (рубец). Наблюдаются областипустоты (рис. 2А, Б, В) рядом с фиброзным матриксом, в которых отсутствует коллаген, но имеются продолговатые структуры. При этом не обнаружены бесклеточные области полуразрушенного коллагенового матрикса, подобные тем, что выявлены в материале, содержащем rhВМР-2 (рис. 2А, Б).

Анализ локализации кальциевых депозитов во фрагментах ДГК, заполненных альгинатным гелем с rhBMP-2, показал активную минерализацию краевой зоны фрагментов (не более 1–1,5 мм) после 6 нед. имплантации (рис. 3А). Внутренняя область фрагментов не подвергалась минерализации, хотя, как было отмечено выше, в нее активно мигрировали клетки реципиента, наблюдалась резорбция коллагена ДГК и активное формирование структурированного неоколлагена. Другая особенность минерализации опытных фрагментов под кожей у крыс состояла в том, что отложение депозитов кальция в значительной части материала было солокализовано с альгинатным гелем (рис. 3А, Б), куда не мигрировали клетки реципиента (рис. 1А, Б). Минерализация наблюдалась также вблизи и вдали от альгинатного геля (рис. 3А, Б). Большие участки минерализации, локализованные вне альгинатного геля, были приближены к поверхности имплантированных фрагментов и имели характерную зернистую структуру (рис. 3А). В контроле мы практически не обнаружили депозитов кальция. Редким исключением были небольшие участки, окрашенные ализариновым красным и солокализованные с альгинатным гелем на краях фрагментов (рис. 3В). Отсутствие депозитов кальция в контроле показывает, что отложение кальция в альгинатном геле в опыте определяется не гелеобразующим материалом, а содержащимся в нем белком rhBMP-2.

Количественная оценка минерализации имплантированных материалов

Определение степени минерализации материалов после 6 нед. имплантации крысам под кожу показало, что содержание минерализованного кальция во фрагментах ДГК, не заполненных альгинатом натрия (контроль 1), составляло 5±3 мг/г сухого веса материала. Содержание минерализованного кальция во фрагментах ДГК, заполненных альгинатным гелем (контроль 2), составляло 8±3 мг/г сухого веса фрагмента. Если фрагменты ДГК перед заполнением альгинатным гелем без rhBMP-2 были предварительно обработаны 6М раствором гуанидин хлорида (контроль 3), то минерализованного кальция в них после 6 нед. имплантации не обнаруживалось (0,5±0,5 мг/г сухого веса). Это может объясняться тем, что удаление гуанидин хлоридом собственных морфогенетических белков ДГК способно полностью предотвратить их кальцификацию в модели подкожной имплантации крысам. Если фрагменты обрабатывали 6М раствором гуанидин хлорида и затем заполняли альгинатным гелем с белком rhBMP-2 (опыт), то содержание минерализованного кальция в них после 6 нед. имплантации составляло 191±22 мг/г сухого веса материала (рис. 4). Отличие в количестве минерализованного кальция в материалах, содержащих и не содержащих rhBMP-2, статистически значимо (р<0,01). До имплантации минерализованный кальций не обнаруживался во всех имплантированных материалах (1,2±0,9 мг/г сухого веса). Полученные результаты убедительно показали, что включение в композитный материал рекомбинантных морфогенетических белков rhBMP-2 радикально увеличивало их минерализацию в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам.

Обсуждение

Присутствие rhBMP-2 в альгинатном геле существенно изменяло характер реорганизации коллагенового матрикса в имплантированном материале. В материалах, содержащих rhBMP-2, клетки реципиента располагаются в слое неоколлагена, формируемого вблизи альгинатного геля, то есть вблизи области, в которую включен рекомбинантный белок. Слой разрушающегося коллагена в этом случае отделен от альгинатного геля слоем структурированного неоколлагена и в нем не содержатся клетки. Возникает вопрос, почему в области разрушающегося коллагена выявляются только единичные клетки? Почему клетки располагаются только в структурированном слое неоколлагена и не мигрируют в расположенные рядом области разрушения коллагена? По всей видимости, это связано с локализацией rhBMP-2 в альгинатном геле, с дифференцировкой клеток в зоне, прилегающей к гелю. Разрушение коллагенового матрикса вдали от геля может быть связано с секрецией клетками протеаз и сопровождаться снижением адгезивности полуразрушенного матрикса для клеток. Возможно, именно высокая адгезивность для клеток структурированного неоколлагена и низкая адгезивность разрушаемого коллагена были одной из причин обнаруженного распределения клеток в композитном материале.

В материалах без rhВМР-2 область ремоделирования коллагенового матрикса, содержащая клетки, располагается как вблизи альгинатного геля, так и вдали от него. При этом структура коллагенового матрикса характерна для фиброзной ткани. Таким образом, добавление rhBMP в материал изменило реорганизацию коллагенового матрикса ДГК с фиброзного на структурированный тип, и локализация структурированного неоколлагена по всей видимости связана с локализацией рекомбинантного белка в материале.

Радикальное ускорение кальцификации материалов во фрагментах, содержащих rhBMP-2, прямо указывает на исключительную роль рекомбинантного белка в этом процессе в тестируемых материалах. Вместе с тем имеются вопросы относительно локализации депозитов кальция.

Обращает внимание солокализация отложений минерализованного кальция в значительной части материала с альгинатным гелем, в который не мигрировали клетки реципиента. Эта минерализация не связана с самим альгинатным гелем, поскольку в материале без rhBMP-2 не происходит отложение кальция. Следовательно, есть основание предполагать, что солоколизация отложений кальция с альгинатным гелем определяется присутствием в нем rhBMP-2 и остеобластической дифференцировкой клеток вблизи геля. Можно предположить, что эти остеобласты секретируют везикулы с фософолипидами, фосфопротеинами и щелочной фосфатазой в альгинатный гель, после чего происходит формирование в везикулах частиц гидроксиаппатита, их высвобождение из везикул под воздействием протеаз и фосфолипаз, как это происходит при эндесмальном остеогенезе, осуществляется диффузия везикул и частиц гидроксиаппатита в альгинатный гель и фиксация частиц гидроксиаппатита в геле. Возможны и другие механизмы, но в любом случае солокализация депозитов кальция с альгинатным гелем указывает на высокое сродство альгината к частицам гидроксиаппатита, формируемым в результате функциональной активности остеобластов вблизи геля. В результате этого после 6 нед. имплантации мы видим фиксацию минерализованного кальция в геле альгината натрия, в которые клетки не проникают.

Возникает также вопрос, почему минерализация осуществлялась только в зоне около 1 мм вблизи края имплантированных фрагментов, а участки минерализации вне альгинатного геля локализованы еще ближе к поверхности фрагментов? Почему в центральной области материалов не наблюдалось отложения депозитов кальция? Этот феномен нельзя объяснить неблагоприятными условиями для клеток в областях, удаленных от края фрагментов, поскольку клетки мигрировали в центр фрагментов, перестраивали коллагеновый матрикс, формировали структурированный неоколлаген. Все это указывает на благоприятные условия для жизнедеятельности клеток и на высокую функциональную активность клеток во всем объеме материала. Возможно, отмеченная локализация кальциевых депозитов в имплантатах отражает тот факт, что миграция клеток в материал начинается с края имплантатов. В соответствии с этим, остеогенная дифференцировка и ремоделирование матрикса будет начинаться на краю имплантата и захватывать внутренние области по мере миграции клеток. По этой же причине условия, необходимые для минерализации, также должны раньше формироваться на краях материала, и, в первую очередь, вблизи локализации повышенной активности индуктора остеогенной дифференцировки (rhBMP-2), то есть вблизи альгинатного геля.

Представленные результаты показывают, что гетеротопическая модель имплантации под кожу крысам может служить хорошим тестом для оценки остеоиндуктивности материалов при включении в них морфогенетических белков кости. Время, необходимое для тестирования (6 нед.), превышает характерные времена дифференцировки клеток in vitro, которые составляют в среднем, по данным различных авторов, 1–3 нед. [21–23]. Однако оценка остеоиндуктивности материалов, содержащих белки rhВМРs, в модели гетеротопической имплантации в большей степени приближена к условиям in vivo и дает больше возможностей прогнозировать его применение в ортотопической имплантации, чем тестирование на культурах клеток. Значимость результатов, полученных в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам, определяется тем, что они позволяют оценить остеоиндуктивность материала в целом. Такая оценка важна для выяснения перспективы применения материала, поскольку учитывает влияние на остеогенез не только активности самого белка, но и роль остокондуктивного материала, способа фиксации белка в материале и ряда других факторов.

Заключение

Суммируя полученные результаты можно сделать вывод, что введение морфогенетического костного белка в составе альгинатного геля в ДГК обеспечивает выраженное повышение остеоиндуктивности композитного материала в гетеротопической модели подкожной имплантации крысам, что проявляется в формировании структурированного коллагена и в активации отложения депозитов кальция. Гетеротопическая модель подкожной имплантации крысам является удобной тест системой для выявления степени остеоиндуктивности материалов, содержащих rhВМР-2, а также для оценки особенностей остеогенеза в таких материалах.

Подняться вверх сайта