Поиск Кабинет

Клинические возможности применения аутогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани при лечении пациентов с трофическими язвами нижних конечностей

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 79-84

 

Авторы

Баранов Е.В., Третьяк С.И., Василевич И.Б., Лобанок Е.С., Волотовский И.Д.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены клинические данные о лечении пациен тов с трофическими язвами нижних конечностей с при менением локальной трансплантации аутогенных муль типотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) жировой ткани, приводящей к полному закрытию раневых дефектов и восстановлению кожных покровов. Отработаны методы по забору жировой ткани, определены подходы к выделению клеток, оптимизации их культивирования и на коплению нужного количества с фенотипированием клеток, разработаны методы трансплантации в язвенные дефекты (количество клеток, кратность и способы введения).

Реабилитация пациентов с трофическими язвами (ТЯ) является важной и сложной медико-социальной проблемой. По данным ВОЗ в индустриально раз витых странах в среднем 1,3–2 % взрослого насе ления и 4-5 % лиц пожилого возраста страдают ТЯ [1–3].

Чаще ТЯ возникают как результат нарушения ло кальной гемо- и лимфодинамики и, как следствие, трофики тканей. Кроме того, их причиной могут быть травмы кожи и мягких тканей, повреждение спинного мозга и периферических нервов, а также эндокринные заболевания[1, 2, 4]. Как правило, ТЯ длительно не заживают, многократно рецидивируют и существенно ухудшают качество жизни вплоть до получения инвалидности в 10–30 % наблюдений[1, 4, 5].

Лечение ТЯ комплексное – включает устранение причинного патогенетического фактора (основного заболевания), приводящего к трофическим нару шениям в коже, а также методы воздействия не посредственно на язвенный дефект, направленные на стимуляцию репаративного процесса. Однако результаты лечения ТЯ, несмотря на большое количество предложенных ранее методов, сочетающих системную фармакотерапию и местное воздействие, являются недостаточно эффективными. Так, из 446 пациентов с ТЯ различной этиологии, проходивших стационарное лечение в последние 6 лет в гнойносептическом отделении 9-й ГКБ г. Минска, в 64% случаев язвенный анамнез составил 2 и более года, заболевание имело рецидивирующий характер и резистентность к проводимым терапевтическим мероприятиям. В большинстве случаев при консервативном лечении процесс заживления язвы занимает многие месяцы и даже годы, особенно в случаях, когда оперативное лечение основного заболевания, приведшего к формированию ТЯ, противопоказано, например, из-за сопутствующей патологии. В последние годы все более широкое распространение получают прикладные биомедицинские исследования в рамках клеточных технологий, в частности, связанных с использованием мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК).

Большая часть работ находится на уровне докли нических исследований, которые свидетельствуют об эффективности использования ММСК на раз личных моделях, в том числе кардиоваскулярных, неврологических заболеваний, сахарного диабета, повреждений опорно-двигательного аппарата и др.[2, 6–10]. В связи с успешными результатами экс периментальных исследований, растет число кли нических, возрастают мировые объемы финанси рования на развитие данного направления, а также количество частных компаний, деятельность кото рых связана с исследованиями и разработками в об ласти клеточных технологий, коммерциализацией их результатов[11, 12].

Прогнозируется, что в последующие 10 лет при оритетными направлениями медицины в лечении с применением клеточных препаратов и тканеинже нерных медицинских изделий станут «регенератив ная хирургия», терапевтическая кардиология, невро логия, эндокринология[13, 14]. Особенно быстро развиваются клеточные технологии, объединенные с генетическими, физиологическими и клинически ми подходами[15, 16]. Расширяется использование клеточных технологий при лечении повреждений кожных покровов[17]. В клеточной дерматопласти ке чаще всего используются культивированные ал логенные фибробласты и кератиноциты, ММСК как в виде суспензий (без носителей), так и дермаль ных эквивалентов, изготовленных с использованием различных матриксов (из коллагенового, фибринового гелей и д.р.)[18–21].

ММСК содержатся во многих тканях человече ского организма. К наиболее перспективным в ка честве источников ММСК тканям в постнатальном периоде онтогенеза относятся костный мозг, жиро вая ткань и ткани последа. В сравнении с другими типами прогениторных клеток взрослого организ ма ММСК жировой ткани более доступны и могут быть получены в большем количестве, достаточном для последующего использования при клеточной терапии. Иными словами, ММСК жировой ткани с меньшими ограничениями могут быть получены в наиболее безопасном и эффективном – аутогенном варианте. Использование аутогенных клеток нивели рует риски, связанные с возможным отторжением трансплантата и переносом инфекций от донора к реципиенту.

В настоящем исследовании аутогенные ММСК жировой ткани были использованы для лечения пациентов с трофическими язвами нижних конеч ностей различной этиологии. Данной работе пред шествовали доклинические исследования, прове денные на крысах: была показана эффективность локального применения ММСК жировой ткани при лечении экспериментально созданных раневых дефектов кожных покровов[22].

Материал и методы

Клиническое исследование было одобрено ко митетом по этике УЗ 9 ГКБ г. Минска (протокол № 11 от 03 ноября 2010 г.) и проводилось в рамках республиканской ГНТП «Лечебные и диагностические технологии».

Дизайн исследования

Исследование состояло из ряда последователь ных этапов: включение пациентов с ТЯ в исследование, эксплантация жировой ткани, клеточный про цессинг с получением культур аутогенных ММСК; подготовка ТЯ реципиента к трансплантации клеток (продолжительность предтрансплантационного пе риода зависела от стадии раневого процесса у боль ного); локальное введение ММСК в область ТЯ; посттрансплантационное наблюдение за динамикой раневого процесса.

Выделение и транспортировка жировой ткани Эксплантацию жировой ткани проводили под местной и (или) с применением внутривенной ане стезии путём липэктомии (иссечения) участка под кожной жировой клетчатки объёмом 5–10 мл в ус ловиях операционной с соблюдением всех правил асептики. После забора фрагментированную жи ровую ткань помещали во флакон с забуференным физиологическим раствором, содержащим антибио тик (цефазолин).

В специальном контейнере биоматериал до ставляли с учётом международных требований GTP (Good Tissue Practice) при температуре не ниже 4°С в течение не более 2 ч от времени эксплантации в лабораторию Института биофизики и клеточной ин женерии НАН Беларуси.

Подготовка ММСК жировой ткани для трансплантации

Извлеченную из контейнера для перевозки жиро вую ткань гомогенизировали в слабо притертом го могенизаторе и в течение не менее 30 мин при 37°С проводили ферментативную обработку в 0,1% рас творе коллагеназы I типа (Sigma, США) в фосфатном буфере. Полученную клеточную суспензию фильтро вали через капроновый фильтр, центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. После удаления супернатанта, осадок заливали питательной средой, содержащей 10% эмбриональную телячью сыворот ку, 2 мМ L-глютамина, 0,01мл базового раствора комплексного антибиотика-антимикотика. Клетки высевали в количестве 8×104 кл/мл на адгезионные пластиковые чашки Петри. Культивирование образ цов проводили в СО2-инкубаторе при 37°С во влаж ной атмосфере при постоянном давлении 5% СО2. Полную смену ростовой среды проводили каждые 72 ч. Качество клеточного монослоя оценивали с по мощью фазово-контрастной микроскопии при увели чении в 100 и более раз.

После достижения необходимого количества клеток на 2–4 пассажах их снимали со дна культу ральных флаконов и переводили в суспензию обра боткой смесью растворов трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) (Gibсo, США). Клетки смывали со стенок сосуда легким пипетированием, что способствова ло образованию гомогенной клеточной взвеси. Для оценки выхода жизнеспособных клеток использова ли тест на исключение красителя. Количество живых и мертвых клеток подсчитывали в камере Горяева. Контроль стерильности клеточной суспензии на от сутствие бактерий, грибов и микоплазм проводили с применением микробиологических питательных сред в стерильных условиях. Суспензия клеток считалась стерильной, если ни в одной из засеянных проби рок не наблюдалось роста. При обнаружении хотя бы в одной пробирке микрофлоры, независимо от ее характера, суспензию признавали нестерильной и отбраковывали.

Для того, чтобы установить принадлежность клеточной культуры к ММСК и их ближайшим де риватам, оценить ее гомогенность, проводили им мунофенотипический анализ с моноклональными антителами к антигенам СD44, CD90, CD105, CD29, CD45 и CD34.

Готовые клеточные препараты размещали в сте рильных пенициллиновых флаконах и маркировали с указанием донора ММСК, названия культуры, ха рактеристики (посевная доза), даты изготовления, условий хранения и срока годности. В специальном контейнере, поддерживающем температуру не ме нее 25°С, клеточные препараты транспортировали в специализированную клинику для проведения трансплантации.

Клиническое исследование

В настоящее исследование были включены 5 пациентов. У трех пациенток с трофическими яз вами нижних конечностей венозной этиологии на блюдалось стойкое прогрессирование симптомов хронической венозной недостаточности (ХВН) с изменением мягких тканей голеней (индурация, ги перпигментация) и наличием трофических язв (VI клинический класс классификации). Два пациента имели нейротрофические язвы нижних конечностей (табл. 1).

Критериями включения пациентов в клиническое исследование являлись:

– длительность существования трофической язвы более 3 мес.;

– неэффективность стационарного и амбулатор ного лечения в течение 6 мес.,

– рецидив язвы более 1 раза в год.

Критерии исключения:

– возраст более 73 лет;

– липодермосклероз нижних конечностей 2–3 степени;

– беременность;

– наличие онкологических, системных заболева ний соединительной ткани, грыж, рубцов, дефектов кожи в области живота;

– психические заболевания, алкогольная, нарко тическая зависимость.

Окончательное решение о целесообразности включения пациента в исследование принимал вра чебный консилиум. Все пациенты после полного объяснения им целей оперативного вмешательства и возможных осложнений подписывали информиро ванное согласие.

Подготовка к трансплантации ММСК

Предтрансплантационный период включал в себя многокомпонентную подготовку больного, направ ленную на купирование явлений острого воспале ния в области язвенного дефекта с использовани ем физического (лаваж, сорбционные покрытия, лазеротерапия, фотодинамическая терапия и др.), ферментативного и аутолитического воздействий. Мероприятия были направлены на достижение фаз регенерации и ремоделирования. С этой целью ис пользовались современные раневые покрытия разной направленности (в зависимости от стадии раневого процесса) и методы антибактериальной фотодинамической терапии.

Клиническими критериями готовности язвы к вве дению клеток являлись: отсутствие налёта фибрина, гнойного отделяемого, кровотечения и экссудации; уменьшение бактериальной обсеменённости язвы до уровня менее 103 микроорганизмов на 1 мм3 тка ни; уменьшение воспалительных изменений в ткани; активация репаративных процессов в тканях в зоне язвы (появление грануляций).

Подготовка ТЯ к клеточной трансплантации и клеточный процессинг in vitro осуществлялись па раллельно. Между специалистами по клеточным технологиям и хирургами поддерживалась посто янная связь, что позволяло тем и другим получать информацию как о состоянии язв, так и о степени готовности клеточной культуры к трансплантации.

Трансплантация ММСК

Клеточные культуры, подготовленные для введе ния, в обязательном порядке подвергались типоло гическому, микробиологическому и вирусологическому тестированию[23].

Введение ММСК проводилось в асептических условиях с наложением специальной каркасной за щитной повязки над дефектом. Трансплантация за ключалась в локальном введении аутогенных ММСК в область трофического дефекта в виде суспензии, содержащей клетки в различном количестве, в зави симости от площади язвенного дефекта (см. табл. 1). Клеточный препарат вводился инъекционно по пери ферии язвенного дефекта (из 4 точек на расстоянии 1 см от края раневого дефекта). В некоторых слу чаях процедура выполнялась повторно с интервалом 7–10 сут. Трансплантация осуществлялась как в фазе пролиферации, так и ремоделирования. После выполнения процедуры накладывалась асептическая повязка, которая представляла собой прозрачную плёнку на основе полиуретана, закреплённую на впи тывающем каркасе, и обладала некоторыми важными свойствами: обеспечение адекватного влаго- и газо обмена раневой поверхности и в то же время непро ницаемость для бактерий и вирусов. Поэтому такая повязка обеспечивала защиту раны и пересаженной культуры от инфицирования. Прозрачность покрытия позволяла визуально следить за ходом заживления раны в первый период после трансплантации.

Посттрансплантационное ведение

В течение 4–6 ч после трансплантации больные соблюдали строгий постельный режим. Первые 3–5 сут. перевязки не проводились. Периодичность за мены повязок в дальнейшем периоде определялась количеством экссудата. При смене повязок локальную обработку язв не проводили. Кроме того, в комплексном лечении пациентов применялась системная фармакологическая терапия, направленная на улучшение микроциркуляции, реологических свойств крови и тканевого обмена. Всем пациентам подбиралась при необходимости адекватная компрессионная терапия (2–3 тип компрессии).

Эффективность лечения оценивалась по состоя нию язвенного дефекта и динамике течения раневого процесса. При этом оценивались характер грануля ционной ткани на дне язвы и площадь трофического дефекта с помощью планиметрии и цифровой фото графии с последующей компьютерной планиметри ей с использованием программы Universal Desktop Ruler v2.6.1007. Учитывалось также состояние окружающих тканей (отёк, гиперемия, мацерация). Критериями эффективности служили сроки и ско рость эпителизации.

Результаты и обсуждение

Характеристика клеточных культур

Для трансплантации использовались ММСК 3–4 пассажей. Количество трансплантируемых клеток было различным (от 8×105 до 11×106), определя лось потребностью – площадью язвенного дефекта (см. табл. 1).

При иммунофенотипировaнии клеток к маркерам, специфичным для ММСК, с помощью проточного цитофлуориметра получены следующие данные. Ко личество клеток, экспрессирующих СD44 состави лоо 93–95%, CD90 – 98–99%, CD105 – 97–98%, CD29 – 96–97%. Доля клеток, экспрессирующих гемопоэтические маркеры CD34 и CD45, не превы шала 2%.

Результаты клеточной терапии

При применении ММСК не наблюдалось неже лательных и серьезных нежелательных явлений, что подтвердило безопасность технологии. У всех 5 включенных в исследование пациентов лечение с применением аутогенных ММСК завершилось стойким положительным эффектом. В результате проведенного лечения с применением клеточной те рапии, кроме заживления раневого дефекта и пол ного восстановления кожных покровов, отмечалось увеличение всех показателей качества жизни, а именно существенное снижение болевых ощущений, увеличение физической активности в повседневной жизнедеятельности, снятие эмоционального дис комфорта.

Детально динамику клинического течения репара тивного процесса и результаты лечения целесообраз но проиллюстрировать на клиническом примере. Пациентка Г. 56 лет находилась на лечении в гнойно-септическом отделении 9ГКБ с клиническим диагнозом: варикозная болезнь вен обоих ног в ста дии декомпенсации, хроническая венозная недо статочность 3 стадии (С6 класс по международной классификации CEAP), трофические язвы обеих го леней, поливалентная аллергия (рис. А). Длитель ность существования язв: 4 года на левой голени и 8 мес. – на правой. Безуспешный период лечения (период за который язвы не закрывались) составил около 2 лет и 8 мес., соответственно. В нижней тре ти левой голени на наружной и медиальной поверх ностях имелись 3 язвы общей площадью 41,21 см2, в нижней трети правой голени – 3 трофических де фекта общей площадью 13,74 см2.

С учётом выраженных гемодинамических и тро фических нарушений на левой нижней конечно сти после предварительного купирования явлений острого воспаления и уменьшения микробной об семененности была выполнена флебэктомия ком бинированным способом с целью ликвидации как вертикального, так и горизонтального патологиче ского сбросов в венозной системе. Эксплантация жировой ткани для получения клеточного матери ала была выполнена одновременно. Оперативное лечение на правой ноге было запланировано по сле заживлений имеющихся трёх трофических дефектов.

Уровень бактериальной обсеменённости трофи ческих дефектов у этой пациентки находился на уровне 105–107 микробных тел на 1 г ткани.

Для более качественной санации ран помимо стандартной локальной терапии применялась анти бактериальная фотодинамическая терапия с ис пользованием фотосенсибилизатора «Фотолон» и светодиодных излучателей повышенной мощности и современных раневых повязок.

Через 2 нед. после купирования острого воспале ния и уменьшения микробного обсеменения сначала была проведена трансплантация ММСК в область трофических язв левой голени.

На 9-е сут. была выполнена повторная трансплан тация ММСК в область язв левой голени, а также введение клеток в дефекты правой голени, находящиеся в стадии эпителизации.

Посттрансплантационный период протекал без осложнений. Уже через 4 сут. после первичной пересадки отмечалась активация репаративных про цессов, в дальнейшем в течение 3–4 сут. – видимая перестройка грануляций. Пациентка отметила сни жение зуда и интенсивности болевого синдрома на 2-е сут. после трансплантации до полного исчез новения к 4 сут. На протяжении 2-недельного пе риода наблюдения отмечалась умеренная экссуда ция, с прекращением к 12-м сут. (рис. Б). После прекращения экссудации в основном применяли современные раневые покрытия. В последующем в дне ТЯ формировалась грануляционная ткань розового цвета, мелкозернистая, с высоко адгезив ной поверхностью, без патологических налётов. При динамическом наблюдении были выявлены и изменения в околоязвенных тканях, которые проявлялись в уменьшении индурации и отёка, изменение цвета кожных покровов (от тёмно коричневого до более светлых оттенков). Новооб разованная грануляционная ткань была достаточна для распространения эпителия, в результате чего отмечалась активация процесса эпителизации (рис. В, табл. 2).

С учётом полной эпителизации язв, которые ло кализовались на правой голени, через 1,5 мес. па циентке была выполнена операция на правой ноге: комбинированная флебэктомия с целью коррекции венозной гемодинамики. Результаты лечения были прослежены через 1 и 4 мес. после проведения лечения (рис. Г, Д).

Таким образом, на основании клинических данных, полученных при лечении пациентов с трофическими язвами нижних конечностей с использованием куль тивированных аутогенных ММСК, можно сделать вывод, что локальное введение ММСК жировой тка ни является безопасным и эффективным методом при незаживающих трофических язвах, способству ет полному закрытию ран и восстановлению кожных покровов. Трансплантация оказалась эффективной при отсутствии положительных результатов от пред шествовавшей стандартной терапии.

Подняться вверх сайта