Поиск Кабинет

Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития

Гены & Клетки: Том II, №4, 2007 год, стр.: 18-30

 

Авторы

Деев Р.В., Исаев АА., Кочиш А.Ю., Тихилов Р.М.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В обзоре обобщены современные данные по теоретическим общебиологическим основам, экспериментальным исследованиям и клиническим испытаниям различных методов клеточных технологий, разрабатываемых в интересах пациентов травматолого-ортопедического профиля. По мнению авторов, данная область медицины является одной из наиболее перспективных для отработки различных способов клеточной трансплантологии и тканевой инженерии, что позволяет рассчитывать на скорейшее внедрение в практику наиболее действенных из них.

Медицина конца XX - начала XXI веков ознаменовалась кристаллизацией такого направления, как клеточные техно логии, общебиологические основы которых были заложены столетие назад трудами выдающихся отечественных, евро пейских и американских исследователей - А.А. Максимова, Ж. Леба, Р. Гаррисона (Репин B.C., 2007). Сегодня уже слож но представить область медицины, в которой не происходила бы отработка экспериментальных и клинических подходов к клеточной трансплантологии и тканевой инженерии для ле чения пациентов при тех или иных патологических состояни ях (Берсенев А.В., 2005; Волков А.В., 2005). Травматология и ортопедия в этом смысле находится на передовых пози циях, уступая лишь онкогематологии (Дулаев А.К., Гололо бов В.Г., Деев Р.В. и др., 2003; Деев Р.В., 2006).

Практикующие травматологи ортопеды не раз сталки вались с тем, что, создавая новые высокотехнологичные способы лечения, доходили до некоего непреодолимого максимума возможностей. Конструирование новых систем компрессионно дистракционных аппаратов, изделий для функционально стабильного остеосинтеза, тотального эн допротезирования и др. неизбежно имеет пределы, обуслов ленные биологическими свойствами тех тканей, обеспечить оптимальную регенерацию которых они призваны. Клини ческие наблюдения свидетельствуют, что перспективы улуч шения результатов лечения патологии костей только за счет совершенствования соединения и удержания отломков в основном исчерпаны (Карпцов В.И., Анисимов А.И., Емелья нов В.Г., 1993). Количество создаваемых технологий, на со временном этапе уже не столь заметно переходит в качество лечения. Именно поэтому «биологическое» направление, как дополнительный метод лечения пациентов травматолого ортопедического профиля, основанное на использовании клеточных технологий и биоимплантологии приковывает столь пристальное внимание ведущих специалистов во всем мире (Денисов Никольский Ю.И., Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В., 2005; Миронов С.П., 2007; Bianco Р., Kuznetsov S.A., Riminucci М., Robey P.G., 2006; Eberli D„ Atala A., 2006; Liu W„ Cui L„ Cao Y„ 2006; Marion N.W., Mao J.J., 2006).

Клеточные технологии представляют собой совокупность методов, включающих в себя различные варианты клеточ ной трансплантации, тканевой инженерии, генотерапии и цитокиновой терапии. Современный научно клинический этап развития клеточных технологий (клеточной трансплан тологии) продолжается всего несколько десятилетий (Бер сенев А.В., 2005). Со времени пионерских трансплантаций остеогенных клеток, впервые выполненных именно в нашей стране (Осепян И.А., Чайлахян Р.К., Гарибян Е.С., 1982), про шло уже около трех десятилетий - срок достаточный для того, чтобы предварительно оценивать оправдались ли надежды, возлагавшиеся на эти методы. Это тем более актуально, что отработка подобных технологий перешагнула порог иссле довательских лабораторий и входит в повседневную клини ческую практику. Новые данные клинических апробаций, однако, вызывают противоречивые суждения и требуют бо лее пристального рассмотрения.

Немаловажным является тот факт, что создаваемые тех нологии a priori относятся к категории высокотехнологичных методов лечения, которые могут предоставляться на коммер ческой основе, следовательно, их результаты должны быть прогнозируемы и гарантированы, кроме того, по ряду пара метров выгодно (качественно) превосходить традиционные методы лечения пациентов с наиболее проблемными патоло гическими состояниями - ложными суставами, дефектами костей, дегенеративно дистрофическими заболеваниями су ставов и др.

Для удобства рассмотрения данных экспериментальных и клинических исследований целесообразно условно раз делить области применения клеточных технологий в трав матологии и ортопедии на «хирургию костей», «хирургию суставов», «хирургию сухожилий и связок».

Использование клеточных технологий в «хирургии костей»

Воспроизведение остеогенеза in vitro как модели ес тественного процесса и основы для получения остеоген ных клеточных элементов - клеток, имеющих естествен ные гистогенетические потенции дифференцироваться по остеобластическому пути и осуществлять формирование ко стной ткани задача в основном решенная (Фриденштейн

А.Я., 1987; Owen М.Е., Friedenstein A.J., 1988; Horwitz Е„ Le Blanc K„ Dominici M. et al„ 2005; Bianco P., Kuznetsov S.A., Riminucci M„ Robey P.G., 2006). Первоначально, в первом десятилетии XX столетия, в качестве источника этих клеток изучали потенции надкостницы (периоста) (Doljanski L., 1929; Studitsky A.N., 1933), эмбриональных закладок костей (Fell Н.В., 1928; Fell Н.В., 1931). В условиях несовершенной куль туральной техники авторам удавалось получить в органных культурах рост клеточной популяции, которая дифференци ровалась преимущественно по хондрогенному пути. Следую щим относительно простым методическим подходом стало культивирование фрагментов костей, с получением остео генных клеток, самостоятельно выселяющихся из костного эксплантата (Ecarot Charrier В., Glorieux F.H., van der Rest М., Pereira G„ 1983; Гололобов В.Г., Деев Р.В., Николаенко Н.С. и др., 2004). Однако только ферментативная диссоциа ция костной ткани позволила получать гарантированное вы деление большего количества детерминированных остео генных клеточных элементов (Peck W.A., Birge S.J. Jr, Fedak S.A., 1964; Binderman I., Duksin D„ Harell A. et al„ 1974; Sudo H„ Kodama H.A., Amagai Y. et al„ 1983). Данный метод не мог быть полностью экстраполирован на человека, посколь ку получение костных фрагментов чаще всего является кли нически неоправданной хирургической агрессией, поэтому исследователи обратили внимание на остеогенные потен ции стромальных клеток костного мозга, тем более, что в некоторых исследованиях была показана возможность диф ференцировки части из них in vitro и in vivo с образованием костной ткани (Лурия Е.А., Кузнецов С.А., Генкина Е.Н., Фри денштейн А.Я., 1989; Studitsky A.N., 1933; Schoeters G.E., de Saint Georges L, van den Heuvel R., Vanderborght 0., 1988). Качественным прорывом в этой области стала селекция кле ток костного мозга по способности адгезироваться к повер хности культуральной посуды, что позволило выделять от носительно чистые популяции клеток (Лурия Е.А., Кузнецов С.А., Генкина Е.Н., 1987; Фриденштейн А.Я., 1987, 1991; Owen М.Е., Friedenstein A.J., 1988). Однако оставалась не решенной задача экспансии в культуре - получения необ ходимого (большого) количества детерминированных в сто рону остеогенеза клеток из изначально малого объема тканевого материала. По мере расшифровки молекулярных механизмов остеогенеза и внедрению клеточных культур, дифференцировкой этих клеток in vitro удалось управлять путем добавления в культуральную среду различных веществ (глицерофосфат, дексаметазон и др.). Индукция направлен ной дифференцировки по остеогенному, хондрогенному и адипоцитарному направлениям, а также характеристика иммунофенотипа полученных клеток дала возможность со здать стандартные протоколы их процессинга (Nefussi J.R., Boy Lefevre M.L, Boulekbache H„ Forest N.. 1985; Turksen K, Grigoriadis A.E., Heersche J.N., Aubin J.E., 1990; Larson B.L., Y^stalo J., Prockop D.J., 2007). В последнее время для изоляции остеогенных клеток ко стного мозга стало возможным применять моноклональные антитела, например STR0 1 (Oyajobi В.О., Lomri A., Hott М.,

1999). Авторы изолировали человеческие клоногенные ос теогенные клетки из стромы фетального костного мозга при помощи моноклональных антител STR0 1. На сегодняшний день у этих клеток обнаружены и другие молекулярные мар керы, которые имеют значение при сочетанном определе нии - CD 73, CD 90, CD 105, при одновременном отсутствии CD 14, CD 34, CD 45, CD 79a, HLA DR (Dominici М., Le Blanc K, Mueller I. et al„ 2006). Данные признаки используются не только для их селективного выделения, но и для верификации иммунофенотипа клеток. Перечень данных молекулярных маркеров и порядок их определения для этой категории кле ток в настоящее время принят международным сообществом (Horwitz Е„ Le Blanc К, Dominici М. et al„ 2005; Dominici М., Le Blanc К., Mueller I. et al„ 2006).

Как уже было сказано, стромальные клетки костного мозга обладают свойством полипотентности, т.е. в зависимости от условий микроокружения in vitro и in vivo (состав культураль ной среды, напряжение кислорода, межклеточные взаимо действия, рецепторные контакты с компонентами межкле точного матрикса и др.) способны дифференцироваться по нескольким направлениям - фибробластическому, остеоб ластическому, хондроцитарному, адипоцитарному (Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al„ 1999; Pittenger M.F., Mosca J.D., McIntosh K.R., 2000; Caplan A.I., Bruder S.P., 2001; Peister A., Mellad J.A., Larson B.L. et al„ 2004). В связи со способностью к дивергентной дифференцировке, клоноген ному росту в культуре и, исходя из морфофункциональных особенностей, они были названы клетками, образующими ко лонии фибробластов (КОКф колониеобразующие фиброб ластические клетки, CFU F colony forming unit fibroblast) (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С., 1973; Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А., 1980; Фриденштейн А.Я., 1991). В литературе КОКф обозначаются по разному, исторически сложившим ся названием следует считать «стволовые стромальные клетки» (Owen М.Е., Friedenstein A.J., 1988), кроме этого, в качестве синонимов используют термины «стволовые ме ханоциты» (Лаврищева Г.И., Оноприенко Г.А., 1996), лока лизованные в костном мозге «стволовые мезенхимальные клетки» и др. (Reddi А.Н., 1995; Wakitani S., Saito Т., Caplan

A.I., 1995). На Консенсусе специалистов по клеточным тех нологиям было принято решение называть данную популя цию клеток «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (ММСК) (multipotent mesenchymal stromal cells) (Horwitz E„ Le Blanc K, Dominici M. et al. 2005).

Как правило, потребность в клеточной трансплантации воз никает в случае развития состояния так называемой «остео генной недостаточности», когда собственный камбиальный резерв скелетных тканей организма не в состоянии обес печить надлежащий процесс остеорепарации (Гололобов B.Г., Дулаев А.К., Деев Р.В. и др., 2003). Такими проблемны ми повреждениями являются протяженные дефекты костей, возникшие в результате многооскольчатых переломов, за медленной консолидации, ложных суставах, при постостеоми елитических дефектах, резекциях костей по онкологическим показаниям и др. Сложными для костной пластики являются дефекты костей мозгового черепа. С одной стороны, они характеризуются биологической особенностью, заключаю щейся в порочном протекании третьего периода раневого процесса - функциональной адаптации, суть которого сво дится к тому, что в отсутствии постоянной механической тяги костный регенерат в области повреждения резорбируется (Шевцов В.И., Чиркова A.M., Дьячков A.H., 2000; Деев Р.В., 2006, 2007). С другой стороны, использование синтетичес ких имплантатов для пластики дефектов мозгового черепа приводит к спаечному процессу в мозговых оболочках и раз витию выраженной неврологической симптоматики, что делает актуальным поиск биотехнологических способов решения этой проблемы.

Эволюция взглядов на клеточную трансплантологию в «ко стной хирургии» прошла несколько этапов - от пересадок сус пензии фетальных скелетогенных предшественников (Чобану П.И., Лаврищева Г.И., Козлюк А.С., 1989) к использованию аутогенных детерминированных остеогенных клеток. К на стоящему времени «золотым стандартом» в этой сфере яв ляется использование остеогенных клеток, полученных из различных тканевых источников (костного мозга, жировой клетчатки, пульпы зуба, надкостницы, стромы кроветворных органов, периферической крови и др.) от самого пациента, размноженных в культуре и пересаженных в реципиентную область (Kuznetsov S.A., Mankani М.Н., Gronthos S. et al„ 2001; Krebsbach P.H., Robey P.G., 2002; Tholpady S.S., Katz A.J., Ogle R.C., 2003; Grayson W.L., Ma T„ Bunnell B„ 2004; Logeart Avramoglou D„ Anagnostou F„ Bizios R., Petite H„ 2005; Mankani M.H., Kuznetsov S.A., Wolfe R.M. et al„ 2006; Krampera M„ Marconi S., Pasini A., 2007; Kuznetsov S.A., Mankani M.H., Leet A.I. et al„ 2007; Sonoyama W„ Yamaza T„ Gronthos S., Shi S., 2007). Отказ от использования алло генного фетального материала связан с несколькими при чинами, среди которых необходимо назвать этические проблемы получения качественного клеточного материала, сложность соблюдения правил биобезопасности и, что нема ловажно, недостаточная изученность механизмов воздей ствия чужеродных клеток на организм реципиента вообще и на остеогенез в частности.

Несмотря на обнадеживающие результаты эксперимен тальных трансплантаций клеточной взвеси в область нару шенной консолидации (Саргсян А.А., 1990; Денисов Ни кольский Ю.И., Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В., 2005; Деев Р.В., 2006), уже с первых клинических на блюдений стало очевидно, что для того, чтобы данный метод занял достойное место в спектре способов лечения костной патологии, он должен обладать превосходящей эффектив ностью по отношению к традиционным методам (костная ал лопластика, несвободная костная пластика по Г.А. Илиза рову и др.). Подобное качественное превосходство могло обеспечить только соблюдение канонов тканевой инженерии. Под тканевой инженерией в настоящее время понимают раздел биотехнологии, подразумевающий трансплантацию культивированных клеток на биосовместимом носителе с целью восстановления поврежденной ткани, органа или создания их de novo (Волков А.В. 2005; Langer R„ Vacanti J.P, 1993; Vacanti J.P, 2007).

Таким образом, в приложении к «костной хирургии» иде ология тканевой инженерии подразумевает сочетанное ис пользование культивированных остеогенных клеток и материала носителя, обеспечивающего мобилизацию куль тивированных клеток, адресную их доставку, стабильное нахождение в реципиентном ложе и гистотипическую диф ференцировку (рис.). Выбор оптимального носителя для культуры остеогенных клеток является одним из ключевых этапов создания тканеинженерного эквивалента костной ткани (Иванов С.Ю., Кузнецов Г.В., Чайлахян Р.К. и др., 2001). Параллельно оптимизации методов культивирования идут поиски оптимального носителя для них.

Требования, предъявляемые к материалам, из которых могут быть изготовлены носители, достаточно стандартны: это должен быть нетоксичный биодеградируемый матери ал, который обладал бы способностью к остеокондукции, остеоиндукции, остеопротекции, а заселение его клетками наделяло бы его и свойством остеогенности.

Показано, что для реализации своих остеогенных потен ций культивированные клетки должны определенное время находиться в фиксированном к носителю состоянии (Kuznetsov S.A., Robey P.G., 2000), что может быть связано с цитогенетическим свойством данных клеток проявлять свои остеогенные потенции, будучи организованными в сложные трехмерные структуры (Деев Р.В., Николаенко Н.С., Цупки на Н.В. и др., 2004; de Bruijn J.D., van den Brink I., Mendes S. et al„ 1999; Bancroft G.N., Sikavitsas V.I., van den Dolder J. et al„ 2002; Riminucci M„ Bianco P., 2003; Grayson W.L., Ma T„ Bunnell B„ 2004; Qi X., Liu J„ Chang Y„ Xu X., 2004; Mauney J.R., Sjostrom S., Blumberg J„ 2004). Механизм индукции ос теогенной дифференцировки в этом случае реализуется че рез усиление экспрессии остеобласт специфичных белков, представляя, таким образом, классический вариант меха нотрансдукции при дифференцировке клеток остеогенной линии, воспроизведенный в культуре (Bancroft G.N., Sikavitsas V.I., van den Dolder J. et al„ 2002; Mauney J.R., Blumberg J„ Pirun M. et al. et al„ 2004; Mauney J.R., Sjostrom S., Blumberg J., 2004; Mauney J.R., Jaquie C., Volloch V., 2005).

Спектр материалов для изготовления носителей доста точно широк и на сегодняшний день выделить какой либо один, наиболее оптимальный не представляется возможным, что, прежде всего, свидетельствует об их несовершенстве. Для интересов тканевой инженерии костей могут использоваться остеопластические материалы - деминерализованный кост ный матрикс (ДКМ), трехмерные матрицы из полимолочных и полигликолевых кислот, коллагеновые криогели, стеклокри сталлические материалы - биоситаллы, аналоги костного минерала гидроксиапатит, трикальций фосфат, а также по лисахариды природного происхождения - хитозан, полигид роксиалканоаты (Шишацкая Е.И., 2007), альгинаты и др.

Каждый из перечисленных материалов обладает переч нем своих достоинств и недостатков вплоть до фатальных. Так, для получения ДКМ требуется наличие специализиро ванной лаборатории, а сам процесс должен иметь надле жащее юридическое сопровождение. Кроме того, изготов ление таких материалов, а именно обработка агрессивными жидкостями - концентрированными кислотами, пергидролем, делает поверхность материала существенно ограничивающей адгезию культивированных клеток (Деев Р.В., Тихилов P.M., Кочиш А.Ю. и др., 2007), что в свою очередь заставляет предлагать способы преодоления этого обстоятельства при помощи дополнительных обработок (Чайлахян Р.К., 2000). Это существенно снижает саму «технологичность» процесса изготовления тканеинженерного эквивалента. Вместе с тем, наличие в ДКМ биологически активных веществ - костных морфогенетических белков, сохранение естественной ос теоархитектоники делает этот материал весьма привлека тельным для костной пластики и целей тканевой инженерии костей, что подтверждено в многочисленных эксперимен тах (Савельев В.И., Калинин А.В., 2001; Савельев В.И., Ка линин А.В., 2004; Li Z„ Li Z. В., 2005; Mauney J.R., Jaquie С., Volloch V., 2005). При тестировании такого материала на совместимость с культурой ММСК в присутствии остеоген ной культуральной среды, показаны приобретение клетками типичной для остеобластов кубоидальной формы, синтез щелочной фосфатазы, остеокальцина и костного сиалопро теина (Mauney J.R., Blumberg J„ Pirun M. et al„ 2004).

Полимеры органических кислот (полимолочной и поли гликолевой) и родственные им соединения лишены отмечен ных недостатков, вместе с тем имеют другие - быстрый срок резорбции в случае изготовления тонкостенных губчатых матриц, не всегда соответствующий биологическим особен ностям регенерации костной ткани, локальное понижение pH в области имплантата (Волков А.В., 2005), однако, возмож ность создавать такие материалы с регулированием сроков резорбции оставляет их в категории наиболее перспектив ных. В мире проведен ряд экспериментальных исследований по трансплантации остеогенных клеток на носителях из этих соединений. Так, выполнялись пересадки скаффолдов, за селенных остеобластами, выделенными из надкостницы у крыс. Результаты показали формирование в зоне пересад ки костной и хрящевой тканей в сроки 6 9 недель (Kim W.S., Kim Н.К., 2005). В сочетании с ММСК этот материал демон стрировал индукцию остеогенеза в культуре (Yao J„ Radin S., Leboy P.S., Ducheyne P., 2005). Более того, изделия из дан ного материала уже используются в клинической практике в рамках клинических испытаний фиксаторов для остеосин теза в челюстно лицевой хирургии (Aimetti М, Pigella Е, Romano F., 2007). Вместе с тем показано, что сам он не обладает остеоиндуктивной активностью (Eppley B.L, Morales L, Wood R„ 2004; Minenna L„ Herrero F„ Sanz M„ Trombelli L, 2005).

Стеклокристаллические материалы (биоситаллы) хоро шо совместимы с клетками остеогенной линии (Николаенко Н.С., Кухарева Л.В., Воронкина И.В. и др., 1999; Николаенко Н.С., Цупкина Н.В., Деев Р.В.и др. 2004; Деев Р.В., Цупкина Н.В., Николаенко Н.С., Пинаев Г.П., 2007; Livingston Т., Ducheyne P., Garino J., 2002). Однако они, напротив, обладают слиш ком длительным сроком резорбции. Поэтому на сегодняшнем технологическом этапе совмещение с клетками биоситал лов, изделий из гидроксиапатита, трикальций фосфата и подобных им, а также металлов, скорее, решает задачу оп тимизации остеоинтеграции имплантата (Песин Р.С., Докто ров А.А., Воложин А.И. и др., 2001; Григорян А.С., Филонов М.Р., Штанский Д.В. и др., 2007; Мальгинов Н.Н., Фролова Е.Н., 2007; Сергеева Н.С., Свиридова И.К, Решетов И.В. и др., 2007).

Перспективными соединениями для целей тканевой ин женерии являются криогели на основе коллагена или дру гих полимеров (Lozinsky V.I., Galaev I.Y., Plieva F.M., 2003). Технология их изготовления позволяет регулировать размер и количество макропор, срок биодеградации в организме реципиента. Получены первые положительные результаты тестирования криогелей с живыми клетками в условиях in vitro (Bloch К., Lozinsky V.I., Galaev I.Y., 2005).

На сегодняшний день среди специалистов нет единого мнения относительно «идеального» матрикса для тканевой инженерии костей, что приводит некоторых авторов к ис пользованию весьма экстравагантных материалов, например, кораллов и др. (Сергеева Н.С., Свиридова И.К, Решетов И.В. и др., 2007; Chen F„ Chen S., Тао К. et al„ 2004).

Большое количество экспериментальных исследований было посвящено оптимизации процесса остеорепарации с применением методов клеточных технологий на модели де фектов костей черепа. Самые простые способы, отработан ные на кроликах, подразумевают инъекционное введение клеток в область дефекта (Саргсян А.А., 1990) или введе ние в коллагеновом формообразующем геле (Деев Р.В., 2006; Деев Р.В., Цупкина Н.В., Гололобов В.Г. и др., 2007). В эксперименте на крысах показано положительное влия ние ДКМ с иммобилизированными аутогенными ММСК на за живление костного дефекта теменных костей (Кругляков П.В., Соколова И.Б., Зинькова Н.Н. и др., 2005). Также использо вание ДКМ оказалось эффективным при трансплантации ММСК на этом носителе у крупных животных собак в пол послойный дефект площадью 2 сма. Через 12 месяцев по данным компьютерно томографического и гистологического исследований структура и целостность кости были восстанов лены, в отличие от контроля, где регенерации кости не на блюдалось, а область дефекта была заполнена плотной во локнистой соединительной тканью (Liu W„ Cui L„ Cao Y„

2006). Также на собаках установлено, что пересадка ММСК на мелкодисперсном носителе из гидроксиапатита и три кальций фосфата в дефект 35 мм диаметром у собак весьма эффективна. Результаты были прослежены ультразвуковым методом и при помощи биопсий в сроки от 2 до 20 недель показано формирование органотипической костной ткани у животных экспериментальной группы (Mankani М.Н., Kuznetsov S.A., Shannon В. et al„ 2006).

В другом исследовании полнослойный дефект теменных костей диаметром 20 мм у овец был замещен ММСК, адге зированными на альгинатном носителе. Выявлено, что де фект полностью замещался собственной костной тканью через 18 недель, что существенно превосходило контроль (Shang Q„ Wang Z„ Liu W. et al„ 2001).

Bidic S.M.S. и соавт. (2003) сообщили о результатах за мещения дефекта теменных костей у кроликов материалом Caprolit® витализированным ММСК, представляющим со бой сополимер из полимолочной и полигликолевой кислот. Установлено, что иммобилизация клеток на поверхности ма териала сопряжена с низким процентом адгезии. Авторы считают, что разработанный метод уступает аутопластике, но превосходит по эффективности индуцированного остео генеза имплантацию носителя без клеток и самостоятель ное заживление костной раны (Bidic S.M.S., Calvert J.W., Marra К. et al„ 2003).

Hong L. и Mao J.J. (2004) предприняли сложное иссле дование по воспроизведению аналогов швов костей че репа, что важно при пластике обширных дефектов у детей, чьи кости после восстановления целостности должны ра сти. Авторы пересаживали кроликам аутогенные фиброб ласты, полученные из подкожной соединительной ткани, иммобилизированные на желатиновом губчатом скаффол де, изолированном с двух сторон коллагеновыми мембрана ми, пропитанными рекомбинантным человеческим BMP 2. Рентгенологический и гистологический методы оценки свиде тельствовали о том, что через 4 недели со стороны коллагено вых мембран, пропитанных BMP, формировалась кость, в то время как в центральном участке была волокнистая соедини тельная ткань, сохраняя, таким образом потенциал для роста костей черепа в целом (Hong L, Мао J.J., 2004).

В связи с тем, что методические подходы к получению in vitro необходимого количества клеточного материала в ос новном определены, а многочисленные экспериментальные работы подтвердили безопасность и эффективность подоб ных технологий, данное направление шагнуло в клиничес кую практику. В мире выполнены несколько операций по трансплантации в область повреждений тканеинженерных эквивалентов костной ткани у человека. Так, описан случай восстановления обширного дефекта костей мозгового от дела черепа площадью 120 сма, сформировавшийся в ре зультате травмы и развившегося остеомиелита. Врачи про демонстрировали комплексный подход к реализации биомедицины: использовали аутогенные клетки костного мозга и аутогенные ММСК подобные клетки, выделенные из жировой клетчатки. Полученные клетки при помощи фиб ринового клея, изготовленного из аутоплазмы, наносили на коммерчески доступный носитель Palacos®, представляю щий собой костный цемент. Проведенные через 3 месяца компьютерно томографические исследования показали полное восстановление кости (Lendeckel S., J4dicke А., Christophis P. et al„ 2004).

He так давно начаты ограниченные клинические испыта ния лечения дефектов костей мозгового черепа и челюстно лицевой области на основе использования аутогенных, ММСК иммобилизованных на ДКМ. Результаты, прослежен ные через 3 года от момента операции, свидетельствуют не только о реституции кости, воссоздания остеоархитектони ки, но и о восстановлении их сложной геометрии (Liu W„ Cui L, Cao Y„ 2006).

Показаниями к замещению дефектов длинных костей конечностей является протяженное нарушение их целост ности и различные варианты осложнений переломов - за медленная консолидация, ложные суставы, дефекты костей. Применение клеточных технологий в этой области требует более сдержанного подхода в связи с тем, что кости данной локализации имеют все клеточные источники для регене рации - периост, эндост, строму костного мозга и клетки первиваскулярного окружения, поэтому те условия, в кото рых собственный камбиальные резерв не смог реализовать свои пролиферативные и дифференцировочные потенции, будут являться и противопоказаниями к имплантации (граф тингу) тканеинженерных эквивалентов костной ткани. Пожалуй, одними из наиболее частых случаев, при которых мо гут оказаться востребованными тканеинженерные конструк ции - это пострезекционные дефекты, сформированные по онкологическим показаниям, а также постостеомиелитичес кие дефекты. Подобные операции подразумевают пересадку вторым этапом трансплантатов значительной протяженности вплоть до целой кости. Процесс остеоинтеграции таких боль ших фрагментов костной ткани еще не изучен, однако совме щения костных трансплантатов с клеточным материалом пред ставляется весьма целесообразным.

В эксперименте подтвержден положительный эффект на течение репаративного процесса ММСК в модели дефекта на крысах (Фатхудинов Т.Х., Гольдштейн Д.В., Пулин А.А. и др., 2005), ММСК иммобилизированными на аллокости у кошек (Зорин В. П., Крашенинников М.Е., Фролов В.И. и др., 2004), ММСК в коллагеновом геле на модели дефекта большеберцовой кости у кроликов (Деев Р.В., Цупкина Н.В., Иванов Д.Е., и др. 2007). Проведенные доклинические иссле дования позволили перейти к ограниченным клиническим испытаниям данного метода. Так, группа отечественных ав торов осуществляла лечение пациентов с ложными сустава ми и дефектами длинных трубчатых костей пересадкой ДКМ, витализированного мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками. Несмотря на объективные трудно сти в достоверной трактовке полученных результатов, в целом отмечен положительный эффект на остеорепарацию (Щеп кина Е.А., Кругликов П.В., Соломин Л.Н. и др., 2007; Щепкина Е.А., Кругликов П.В., Соломин Л.Н. и др., 2007).

Первые клинические исследования, позволили усом ниться в «технологичности» разрабатываемых методов. Так, при погружении в реципиентное ложе больших по протяжен ности тканеинженерных эквивалентов костной ткани одной из основных проблем является обеспечение надлежащей трофики пересаженных клеток это критический этап всей технологии. Поскольку в область костной раны вносятся жизнеспособные клетки, непосредственно и продуктивно участвующие в процессах остеогенеза, то без надлежаще го кровоснабжения рассчитывать на успех их приживления не приходится. Графты больших размеров в условиях in vivo испытывают дефицит кровоснабжения: клетки, находящие ся на периферии графта, получают большее количество кис лорода и нутриентов, чем клеточный пул центральной части, в результате его численность быстро снижается. Доказано, что клетки, отдалённые от гемомикроциркуляторного русла более чем на 200 500 мкм, неизбежно погибают в ходе эк сперимента (Folkman J„ Hochberg М., 1973; Polykandriotis Е„ Arkudas A., Horch R. et al. 2007), а матрикс замещается волокнистой соединительной тканью. В этой связи, во мно гих исследованиях, в которых использовались большие трансплантаты, результаты применения носителей с клетка ми и без них существенно не отличались.

Чтобы повысить выживаемость клеток, входящих в состав трансплантата, проводятся разработки дополнительных ме тодов индукции ангиогенеза. В частности, используются модуляторы роста сосудов, являющиеся естественными ци токинами, индуцирующими эндотелиальную дифференци ровку и рост сосудов - эндотелиальный сосудистый фактор роста и основной фактор роста фибробластов. Альтерна тивным направлением является метод префабрикации, основанный на временном помещении носителя в богато кровоснабжаемую ткань для формирования в нём собствен ной сосудистой сети, которую на этапе основной трансплан тации соединяют с кровеносным руслом реципиента (Ahrendt G„ Chickering D.E., Ranieri J.P., 1998; Khouri R.K., Upton J„ Shaw W.W., 1991), причем данный метод может быть использован в сочетании с цитокиновой поддержкой тканей реципиентного ложа и самого графта (Terheyden Н„ Warnke P., Dunsche A. et al., 2001).

В последнее время всё большее внимание уделяется мо дели артериовенозной петли (arteriovenous loop), состоящей из артериального и венозного сосудов, искусственно анас томозированных аутовеной с помощью микрохирургической техники (Lokmic Z„ Stillaert F„ Morrison W. et al., 2007; Arkudas A., Beier J„ Heidner K. et al., 2007; Kneser U., Polykandriotis E„ Ohnolz J. et al., 2006). Артериовенозная петля, помещённая в центральную часть трансплантата, является источником «осевой васкуляризации», давая начало новой капиллярной сети изнутри («внутренняя васкуляризация») (Folkman J., Hochberg М., 1973), что в сочетании с ангиогенезом с пери ферии («внешняя васкуляризация») обеспечивает адекватное кровоснабжение и, таким образом, открывает значительные перспективы в решении проблемы повышения выживаемо сти клеток, входящих в состав графтов.

Предшественниками этих технологий стало формирова ние собственной сосудистой сети при пересадке искусствен ных материалов без клеток, но с образованными сосудами (Bernard S.L., Picha G.J., 1991). В 1998 году F. Casabona с соавт. опубликовал и материалы исследования, в котором матрикс из гидроксиапатита, населённый остеогенными клет ками костного мозга, трансплантировали в широчайшую мышцу спины. Спустя восемь недель извлечённый материал по гистологическому строению соответствовал губчатому веществу кости (Casabona F„ Martin I., Muraglia A. et al„ 1998). Успешные результаты работы во многом обуслов лены оптимальной адгезией клеток в условиях in vitro.

Похожий эксперимент был выполнен Т. Nakasa с соавт. (2005). В качестве графта был применен пористый гидрокси апатит. Сосудистую ножку формировали из подкожных сосу дов бедра. В экспериментальной группе материал насыщали фактором роста фибробластов 2. Материал был помещен подкожно в среднюю треть бедра. Васкулогенез от сосудистой ножки оценивали через 2 недели, остеогенез - через 4 неде ли. Остеогенез зарегистрирован только в экспериментальной группе (Nakasa Т., Ishida О., Sunagawa Т. et al„ 2005).

Недавно для подтверждения значимости модели артери овенозной петли как пути решения проблемы кровоснабже ния трансплантатов A. Arkudas с соавт. (2007) опубликовали результаты научной работы, в которой исследователи транс плантировали крысам бычий ДКМ (Arkudas A., Beier J., Heidner К. et al„ 2007). Животным первой группы (п=34) носитель, имеющий форму диска (9x5 мм), трансплантиро вали в зону артериовенозной петли, созданной между бед ренными артерией и веной. Через 6 недель инъецировали в рохромом. Животным контрольной группы (п = 32) костный графт на основе того же носителя с теми же клетками вво дили подкожно. Полученные материалы были подвергнуты гистологическому, морфометрическому и молекулярно био логическому анализу через 1, 4, 8, 16 недель для опреде ления доли выживших клеток. Было доказано, что «осевая васкуляризация» в значительной степени увеличивает жиз неспособность клеток, несмотря на одинаково интенсивную воспалительную реакцию в обеих группах. Формирование костной ткани на всём протяжении матрикса было выяв лено лишь в одном случае - в материале, изъятом спустя 16 недель, что связано, возможно, с недостатками мето дики внесения клеток.

В своей работе U. Kneser с соавт. (2006) определяли эф фективность использования артериовенозной петли как ин дуктора «внутренней васкуляризации» матрикса без клеток (Kneser U., Polykandriotis Е, Ohnolz J. et al„ 2006). Исследова тели пришли к выводу, что достаточная плотность капилляров в материале из ДКМ при использовании модели артериове нозной петли определяется лишь к восьмой неделе.

Другим экспериментальным вариантом префабрикации стала трансплантация культуры стромальных клеток костно го мозга в ткани, окружающие крупные сосуды у иммуноде фицитных мышей (сонные артерии, аорту и др.). Остеогенез в этих областях был зарегистрирован уже через 4 недели и прослежен вплоть до двух лет. Сформированные костномоз говые органы авторы рекомендуют для формирования тка невых лоскутов (Mankani М.Н., Krebsbach Р.Н., Satomura К. et al„ 2001).

В исследовании A. Hokugo с соавт. (2004), выполненном на морских свинках в качестве носителя были использованы: губчатая кость, резорбируемая мембрана из полимолочных кислот и костный мозг. Кость и костный мозг были помеще ны вокруг подкожных сосудов и укрыты мембраной. Именно при таком варианте в формируемом графте был обнаружен остеогенез (Hokugo A., Kubo Y„ Takahashi Y„ 2004). Появившиеся в последнее время описания ограничен ных клинических испытаний тканеинженерных конструкций в РФ, к сожалению, не поддаются однозначной трактовке из за относительной закрытости таких испытаний, небе зупречного подбора категорий пациентов и по ряду орга низационных причин. За рубежом, где правовые основы раз работки и клинического внедрения клеточных технологий отработаны, достаточно эффективным и реализованным в клинической практике «костной хирургии» остается челюст но лицевая хирургия. Не так давно мир облетело известие о выполнении замещения резецированной по онкологическим показаниям нижней челюсти 56 летнего мужчины и заме щением ее тканеинженерной конструкцией (Warnke Р.Н., Springer I.N., Wiltfang J., 2004). Следует подчеркнуть, что для успешной реализации биотехнологического подхода разра ботчикам в одной методике пришлось совместить несколько механизмов воздействия - внесение остеогенных клеток, блоков гидроксиапатита, обеспечение собственной сосуди стой сети путем префабрикации в течение двух месяцев и цитокиновую поддержку (Warnke Р.Н., Springer I.N., Wiltfang J., 2004). В течение первых 6 месяцев, пациент сообщил о восстановлении способности употреблять любую пищу, ис чезновении дисфагии, восстановлении способности устного общения. Однако в дальнейшем, в результате преждевре менной активации и повреждения десен развился остеоми елит графта. Через 15 месяцев после операции наступила смерть пациента от сердечной недостаточности. Посмерт ное исследование показало удовлетворительное состояние тканеинженерного эквивалента нижней челюсти (Warnke Р.Н., Wiltfang J., Springer I. et al„ 2006). Снаружи от металличес кого фиксатора наблюдался несколько избыточный рост костной ткани, вместе с тем, никаких признаков злокаче ственного роста обнаружено не было.

Безусловным достижением тканевой инженерии в орто педии следует признать пересадку пациенту биоартифици альной кости (фаланги), выполненной группой С.А. Vacanti (2001). Особенность этой техники состояла в том, что в од ном изделии была совмещена и костная ткань, и хрящевая часть эпифиза полученные в лабораторных условиях. К со жалению, данная методика не только не тиражирована, но даже не воспроизведена (Vacanti С.А., Bonassar L.J., Vacanti М.P., Shufflebarger J., 2001).

В США FDA (Food and Drug Administration) зарегистри рован препарат на основе тканеинженерного эквивалента костной ткани - Osteocel® (Osiris Therapeutics, США), ко торый был заявлен фирмой 22 сентября 2005 года, как из делие, предназначенное для пластики дефектов кости. Osteocel® представляет собой аллогенную костную матрицу, заселенную ММСК. Кроме этого препарата в Европе разра ботан и проходит расширенные клинические испытания его аналог для пластики небольших костных дефектов челюст но лицевой области BioSeed Oral Bone® (BioTissue Technologies, EC).

He обошли вниманием исследователи и клиницисты воз можности коррекции системных поражений костной ткани, при которых пациенты обращаются к травматологам уже после наступления осложнений - переломов. В данной си туации предложено внутрисосудистое (системное) введение остеогенных клеток. В экспериментах убедительно показано, что ядросодержащие клетки костного мозга содержат фрак цию предшественников остеобластов, которые способны ко лонизировать костную ткани реципиента (Деев Р.В., Цупкина

Н.В., Сериков В.Б. и др., 2005; Деев Р.В., Цупкина Н.В., Сер геев B.C. и др., 2006). По данным М. Dominici и соавт. (2004), при введении таких клеток 18% остеобластов и остеоцитов реципиента являются их дифференцированными потомка ми, причем в некоторых участках костной ткани их количество достигало 50% (Dominici М., Pritchard С., Garlits J.E. et al„

2004). Эффективность трансплантационного лечения сис темных заболеваний скелетных тканей оценивается не только в экспериментах (Wang L„ Liu Y„ Kalajzic Z. et al„ 2005; Wang X., Li F„ Niyibizi C., 2006), но уже и в ходе лечения пациентов с несовершенным остеогенезом (Horwitz Е.М., Prockop D.J., Gordon P.L. et al„ 2001; Horwitz E.M., Gordon P.L, Koo W.K. et al„ 2002), причем авторов особо привлека ет возможность генетической модификации аутогенной культуры ММСК in vitro с последующей системной трансплан тацией (трансфузией). Вышеизложенные обстоятельства стали предпосылками к санкционированию FDA клинических ис пытаний клеточных технологий при системных поражениях скелета - несовершенном остеогенезе (14 человек, St. Jude Children's Research Hospital, США), других типов клеток при ос теопетрозе (10 пациентов, St. Jude Children's Research Hospital, США; 16 пациентов, университет Миннесоты, США) и др.

Все вышесказанное вынуждает избавиться от завышен ных ожиданий относительно клеточных технологий в «костной хирургии». Очевидно, их достойная клиническая реализация будет возможна лишь при замещении незначительных по объему дефектах костей или протяженных критических де фектов, но при условии выполнения в специализированных высокотехнологичных стационарах, способных реализовать микрохирургическую технику и комплексный биотехнологи ческий подход.

Использование клеточных технологий в «хирургии суставов»

В клинической практике потребность в хрящевых графтах возникает в первую очередь при повреждении суставного хряща, который имеет ряд морфофункциональных особен ностей, снижающих его репаративный потенциал. Отсутствие собственной надхрящницы делает практически невозможной клеточную регенерацию суставного хряща. Только при пе риферических повреждениях, в областях, прилегающих к синовиальной оболочке, наблюдают процесс гистотипичес кого восстановления гиалиновой хрящевой ткани. При глу боких повреждениях, сообщающихся с костномозговым ка налом, обеспечивается миграция в область дефекта ММСК из костного мозга, которые могут служить клеточным источ ником для регенерации. Однако чаще всего разрушенный гиалиновый хрящ если и восстанавливается, то с образова нием фиброзной (волокнистой) хрящевой ткани, существенно отличающейся по архитектонике, биохимическому составу матрикса и по механическим свойствам. Следует отметить, что эта же биологическая особенность ограничивает и ши рокое внедрение разработанных технологий клеточной арт ропластики. Поиск биотехнологических способов решения данной проблемы наталкивается на необходимость решения нескольких вопросов: выбор оптимального источника клеток, выбор способа их доставки в области повреждения, иммоби лизации, выбор адекватного носителя.

Известно, что хрящевая ткань является гистогенетически близкой к костной, но в тоже время проще организованной и более брадитрофной (Павлова В.Н., 1980; Дедух Н.В., Панков Е.Я., 2001). Очевидно, что данные обстоятельства, наряду с другими, привели к более простому воспроизведе нию хондрогенеза in vitro. Как уже было сказано выше, пер вые попытки культивирования скелетных тканей приводили к получению очагов хондрогенеза. Данные методики удалось довести до достаточной воспроизводимости. Современ ные технологии основаны на использовании хондрогенного потенциала ММСК, полученных из костного мозга или из жировой ткани, а также выделении и культивировании собственно хондроцитов, полученных из хрящевой ткани ре ципиента. Исходя из положений теории дивергентной дифферен цировки тканей Н.Г. Хлопина (1946), допустимо считать, что ММСК служат источником не только клеток остеобласти ческой линии, но и клеток хондроцитарного дифферона. На сегодняшний день разработаны стандартные протоколы выделения, экспансии in vitro и индукции направленной хон дроцитарной дифференцировки, для которой используют ряд веществ, в первую очередь цитокины из семейства транс формирующих факторов роста р (Archer C.W., Old S., Redman S. et al„ 2007).

В эксперименте у крыс на модели дефекта суставного хряща описано получение гипертрофированного гиалино вого хряща через 24 недели после трансплантации ММСК (Oshima Y„ Watanabe N.. Matsuda К. et al. 2004). У кроли ков показано формирование гиалинового хряща через 6 недель, причем преимущественно у животных с ранней ак тивацией движений в суставе после операции (Melamed Е„ Robinson D„ Halperin N.. Nevo Z„ 2004; Wang G„ Liu Y„ Shan Y.X., 2004).

В качестве носителей для культивирования хондроцитов используют вещества, способные поддерживать хондроцитар ную дифференцировку. В частности, такую способность демон стрировали альгинаты (Kavalkovich К., Boynton R„ Murphy М., Barry F„ 2000). Разработаны аналогичные методы клеточных технологий и в нашей стране (Чайлахян Р.К., 1997).

Еще одним источником ММСК является жировая ткань. В интересах экспериментальной и клинической ортопедии оп ределены способы индукции хондрогенной дифференциров ки и этих клеток (Трактуев ДО., Парфенова Е.В., Ткачук В.А., Марч К.Л., 2006; Lin Y„ Luo Е„ Chen X. et al., 2005). Показана потенциальная возможность использования для этих целей си новиоцитов (Shirasawa S., Sekiya I., Sakaquchi Y. et al., 2006).

Применение в интересах клеточной артропластики культуры хондроцитов дало мощный толчок в развитии био технологий в травматологии и ортопедии. Известно, что эксплантация клеток ведет к их фенотипической дедиффе ренцировке. Так, первичная культура хондроцитов утра чивает способность к производству хрящевого матрикса, изменяет профиль экспрессии хондроцитарных маркеров (Reiter I., Tzukerman М., Maor G., 2002; Darling Е.М., Athanasion К.А., 2005), a in vitro выглядит как фибробласто подобные клетки. Вместе с тем, выбор оптимальных условий культивирования, включая использование определенных цитокинов, способствует поддержанию хондроцитарной дифференцировки культуры хондроцитов (Ким И.И., 2006; Reiter I., Tzukerman М., Maor G„ 2002).

Несмотря на большое количество нерешенных проблем, значительная часть медицинских манипуляций с культиви рованными предшественниками механоцитов выполнена именно в артрологической практике. Самый простой, но со мнительный по идеологическому подходу способ - это инъ екционное введение в полость сустава клеточной взвеси культивированных хондроцитов в расчете на их самостоя тельную миграцию и адгезию в области повреждения.

Наиболее часто использующийся алгоритм операции в эксперименте включает следующие этапы. Аутогенный хрящ обрабатывают протеолитическими ферментами, изолируют хондробласты и хондроциты, культивируют в течение 3 х не дель, затем путем инъекции вводят в полость сустава. В ходе осмотра через 1 год после операции установлено, что функ ция сустава была не нарушена, боли отсутствовали, конгру энтность суставных поверхностей была восстановлена. В ряде случаев после операции в зоне дефекта определяли гиалиновую хрящевую ткань (Horas U., Schnettler R., Pelinkovic D. et al., 2000; Peterson L, 1995; Robinson D„ Ash H„ Aviezer D. et. al., 2000; Koulalis D„ Schultz W„ Heyden M„ 2002; Wakitani S., Imoto K, Yamamoto T. et al., 2002).

Более «продвинутые» варианты клеточной артропластики подразумевают сочетание клеточных технологии со слож ной хирургической техникой. Таким способом является, на пример, пересадка в область дефекта суставного хряща аутогенных хондроцитов под периостальную заплатку или мембрану из резорбируемого коллагена. Эта технология по лучила название autologous chondrocyte implantation (ACI). Основные этапы, входящие в технологию ACI приведены ниже.

1. Артроскопическая биопсия суставного хряща, с полу чением фрагментов гиалиновой хрящевой ткани с ненагру жаемых участков.

2. Культивирование в условиях GMP лаборатории. В последнее время одним из непременных условий стало использование аутосыворотки или синтетических бессы вороточных сред. Этап культивирования преследует цель увеличения количества клеток для будущей трансплантации.

3. После накопления необходимого количества клеточного материала (12x106 клеток, которые концентрируются в 0,4 мл среды DMEM) его артроскопически пересаживают в область дефекта. Для защиты пересаженных клеток область пересад ки прикрывают подшитым лоскутом аутопериоста (надкостни цей, полученной в соседнем участке конечности). Такой под ход не лишен существенного недостатка - расширения хирургической агрессии для получения периоста. Поэтому было предложено использовать коллагеновые мембраны, что позво лило избежать дополнительного хирургического вмешатель ства и предотвратить гипертрофическое развитие регенери рующего хряща (Haddo О., Mahroof S., Higgs D. et al., 2004).

Одним из первых данную технологию начал отрабаты вать М. Brittberg (1994). Клиническое исследование, в ко торое были включены 23 человека в возрасте от 14 до 48 лет, показало, что перестройка пересаженного клеточного материала продолжается не менее двух трех лет. Через 36 месяцев у 11 из 15 пациентов, подвергшихся операции на суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости, и у 1 из 7 пациентов после операции на суставной поверхности надколенника обнаружено формирование ги алиновой хрящевой ткани (Brittberg М., Lindahl A., Nilsson А., 1994; Brittberg М., 1999). Показана техническая возможность выполнения этой операции при использовании малоинва зивного вмешательства - артроскопической трансплантации (Ochi М., Adachi N.. Nobuto Н. et al., 2004).

Австрийские авторы представили результаты шестилет них наблюдений за 10 пациентам, которым была выполнена подобная операция (6 на коленном суставе и 4 на голенос топном). Средний возраст пациентов составил 30 лет. У 6 па циентов результаты лечения оценены как хорошие, у 3 удовлетворительные, у 1 — неудовлетворительные (Dorotka R., Kotz R„ Tratting S., Nehrer S., 2004).

В случае нанесения большого остеохондрального дефек та культивированные клетки вносили в коллагеновом или желатиновом геле, чтобы они заполняли объем дефекта (Bogan B.D., Schwartz Z„ 1999; Katsube К, Ochi М., Uchio Y. et al., 2000; Ponticiello M.S., Schinagl R.M., Kadiyala S., Barry F.P., 2000). Однако, при таком варианте у человека через два года в области пересадки обнаруживали фиброзный хрящ (Wakitani S., Mitsuoka Т., Nakamura N. et al., 2004).

Данных об эффективности подобных манипуляций в сравнительном аспекте явно недостаточно как в эксперимен те, так и в клинике. При сопоставлении результатов лечения остеохондральных дефектов коленного сустава у кроликов мозаичной артропластикой и клеточной артропластикой с использованием аутогенных хондроцитов, ММСК и клеток периоста показана значимо большая эффективность кле точной артропластики, причем наиболее целесообразным оказалось применение хондроцитов и ММСК (Hui J.H., Chen F„ Thambyah A., Lee E.H., 2004). При сопоставлении в эксперименте трансплантации ауто хондроцитов и аутогенных ММСК, иммобилизированных на коллагеновых матрицах, по степени экспрессии специфи ческих хондроцитарных маркеров и компонентов межкле точного матрикса более эффективными в опытах на овцах оказывались хондроциты (Dorotka R., Windberger U., Macfelda К. et al., 2004).

Технология ACI на сегодняшний день получила наиболь шее, в том числе, коммерческое развитие в мире (Деев Р.В.,2006). На рынке имеются несколько клеточных препаратов (клеточных сервисов) для лечения данной категории пациен тов. В большинстве случаев, помимо собственно клеточного продукта, услуга подразумевает весь технологический ме дицинский процесс от первичного обследования до после операционной медицинской реабилитации. Лидерами в этом плане являются следующие препараты - Carticel® (Genzyme согр., США), Cartilink 1 ®, Cartilink 2® (Interface Biotech, Да ния), Chondrogen® (Osiris Therapeutics, США), ChondroCelect® (Tigenix NV, Бельгия). Услугами этих сервисов (клеточных препаратов)воспользовались тысячи человек.

Авторы указывают на осложнения, которые могут раз виться в результате выполнения данной техники, к ним отно сятся периостит областей, граничащих с участком получения надкостницы, расслаивание подшитого периостального лос кута, артрофиброз и отторжение пересаженного материала. Следовательно, подобные манипуляции должны выполнять ся (и могут быть выполнены) только в высокотехнологичных ортопедических центрах, имеющих в своем распоряжении высококвалифицированных специалистов и соответствую щее оснащение (Marlovits S., Kutscha Lissberg F„ Aldrian S. et al., 2004).

Существенным недостатком предлагаемых технологий, является трудность обеспечения гистотипического форми рования хрящевой ткани, т.е. образования в реципиентном ложе истинно гиалинового хряща, способного противодей ствовать постоянным механическим нагрузкам. Однако пос ледние экспериментальные исследования подтверждают формирование в четырехнедельный срок типичной гиалино вой хрящевой ткани при трансплантации хондроцитов в дефект суставного хряща. Причем в реципиентном ложе вое производились не только состав и зональное расположение клеток хряща, но и биохимические показатели межклеточного вещества (Hayes A.J., Hall A., Brown L. et al., 2007).

Еще одним направлением развития клеточных технологий является попытка отсрочить тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава, связанное с асептическим некро зом головки бедренной кости, что актуально при молодом возрасте пациента. В исследовании группы зарубежных ав торов показано позитивное влияние пересаженной культуры ММСК при этой патологии. Считается, что при надлежащем развитии, данное направление может стать альтернативой имплантации эндопротеза (Gangji V., Hauzeur J. P., Matos С. et al., 2004). Созданы алгоритмы оперативных вмешательств при данной патологии, причем рекомендовано использовать не только стромальную фракцию, а цельный костный мозг, поскольку, по мнению авторов, гемопоэтические элементы будут способствовать неоангиогенезу в дегенеративно из мененной головке бедренной кости (Gangji V., Hauzeur J. P.,2005). Компания Aastrom Biosciences, Inc. (США) уже про водит вторую фазу клинических испытаний по данной тех нологии, в которую включено более 120 пациентов.

Особняком стоит технология клеточной пластики при дегенеративно дистрофических повреждениях межпоз вонковых дисков. Значимость этой проблемы особо подчер кивает создание европейской научно практической програм мы EvroDisk, объединяющей несколько научных центров ЕС. Идеология разрабатываемой технологии включает введение в область измененного межпозвонкового диска культуры аутогенных хондроцитов.

Известно, что триггером разрушения диска является физиологическая инволюция вещества п, pulposus меж позвонкового диска, являющегося во взрослом организме дериватом хорды. По своему гистогенезу хорда не имеет отношения к скелетным тканям и родственна скорее к эпителию (Хлопин Н.Г., 1946). Поэтому нельзя признать дос таточно обоснованным с гистогенетических и морфологи ческих позиций введение хондроцитов в область повреж дения ядра диска.

Наиболее простым представляется выделение культуры клеток студенистого ядра, размножение их in vitro и последу ющее введение. В эксперименте показано, что при этом про цесс дегенерации диска затормаживается, пересаженные клетки синтезируют элементы хрящевого матрикса (Okuma М., Mochida J., Nishimura К. et al„ 2000; Nomura Т., Mochida J., Okuma M. et al„ 2001), что нельзя признать полноценным гистотипическим исходом регенерации в этом случае.

Группа исследователей из Гейдельбергского универси тета поставила цель сравнить клетки студенистого ядра и ММСК в монослойных культурах и трехмерных сфероидах для определения перспектив их дальнейшего использова ния в тканевой инженерии (Steck Е„ Bertram Н„ Abel R. et al„ 2005). ММСК культивировали в стандартной хондрогенной среде. Изучали экспрессию генов хондрогенной дифферен цировки, включая гены аггрекана, декорина, фибромодулина и олигомерного матриксного протеина хряща. Установлено, что в сфероидах экспрессия была существенно выше, чем в монослойных культурах. Кроме того, при культивировании материала студенистого ядра и типичных механоцитов пока заны различия в синтетической активности клетки фиброз ного кольца синтезируют больше коллагена I, клетки ядра -больше аггреканов.

Украинские коллеги исследовали эффективность клеточ ной трансплантации на модели травматического повреждения диска у крыс (Дедух В.Н., Малышкина С.В., Бадраинова И.В., 2004). В качестве клеточного материала использовали скелетогенную мезенхиму из зачатков конечностей 12 13-суточных эмбрионов крыс. После короткого этапа куль тивирования клетки вносили в дефект из расчета 107/мл. При помощи гистохимического и электронномикроскопи ческого анализа установлено, что пересаженные клетки дифференцировались преимущественно в пре и хондроб ласты. Через 90 суток зона дефекта была заполнена хря щевым регенератом. В целом диск после трансплантации характеризовался неизмененной высотой.

Поскольку в условиях in vitro и после трансплантаций in vivo воссоздать ткань студенистого ядра не удается, ряд ав торов предлагают замещать утраченное ядро различными субстанциями с интегрированными в них хондроцитами. В качестве таких носителей предложены альгинаты, препа раты полигликолевой кислоты, производные хитозана (Mizuno М., Roy А.К., Vacanti J. et al„ 2001; Mwale F„ lordanova M„ Demers C.N. et al„ 2005).

Следует отметить, что технология клеточной реконструк ции межпозвонкового диска еще разрабатывается. Види мо, производные хорды, имеющие особое эмбриональное происхождение, не могут быть заменены в функциональном плане трансплантацией механоцитов, они не в состоянии привести к формированию полноценного по химическому составу матрикса студенистого ядра, способного к выпол нению функции амортизации. Напротив, дифференциров ка соединительнотканных предшественников в условиях сниженной трофики может привести к дополнительному склерозу диска, что и без трансплантаций наблюдают ней рохирурги вертебрологи при дискэктомиях. Несмотря на существенные недоработки в идеологии подобных вмешательств в ЕС данные технологии уже выш ли на стадию клинических исследований. В программу EuroDisc включены 140 пациентов в различных лечебных учреждениях Европы. По первичным данным, транспланта ция хондроцитов приводит к купированию болевого синд рома в первые три месяца после операции дискэктомии, способствует гидратации тканей диска, что проявляется уве личением его высоты, а сохранившиеся пересаженные хонд роциты экспрессируют компоненты хрящевого межклеточ ного матрикса (Meisel H.J., Siodla V., Ganey Т. et al„ 2007).

Обсужденные направления развития клеточных техноло гий в «хирургии суставов» далеко не исчерпаны. Пока вне поля зрения исследователей остаются возможности префаб рикации гиалинового хряща для гарантированного получения в реципиентном ложе органотипического варианта хрящевой ткани, не изучены возможности трансплантационного лече ния переломов по типу эпифизиолизов у детей и др.

Использование клеточных технологий в «хирургии сухожилий и связок»

Еще менее разработанной областью являются клеточные технологии при лечении повреждений сухожилий и связок, что, очевидно, в значительной степени связано с клинической не востребованностью. Современные синтетические протезы и аллотрансплантаты в должной степени удовлетворяют кли нические запросы, поэтому данный раздел скорее пред ставляет только научный интерес. Вместе с тем, клеточные технологии считаются перспективными при лечении таких со стояний как, например, разрыв манжеты ротаторов (Dines J.S., Grande D.A., Dines D.M., 2007; Chen J.M., Willers С., Xu J. et al„ 2007).

Считается, что добиться дифференцировки ММСК в ус ловиях культуры и после трансплантации in vivo в сторону тендиноцитов весьма сложно, и формирование сухожилия de novo сопряжено с сообщением культуре значительных механических раздражений (Butler D.L., Juncosa Melvin N.. Boivin G.P. et al„ 2007; Hankemeier S., van Griensven M„ Ezechieli M. et al„ 2007).

Исследованиями in vivo показано, что подбор оптималь ных носителей для данной технологии включает использо вание биодеградируемых полимеров, предотвращающих после операции сращение биоартифициального сухожилия с элементами синовиальных влагалищ и другими мягкими тканями (Curtis A.S., Wilkinson C.D., Crossan J. et al„ 2005), причем последнее обстоятельство может служить одним из основных показаний к внедрению клеточных технологий в этой области. Среди таких носителей могут быть полимеры на основе хитозана и гиалуроновой кислоты, обладающие достаточной механической прочностью и биосовместимос тью (Majima Т., Irie Т., Sawaguchi N.. 2007). Эксперименталь ная отработка этого направления начата с использованием синовиоцитов у кроликов (Zhang Z„ Liu Z„ Zhong S. et al. 2001), фибробластов (TischerT., VogtS., Aryee S. etal., 2007; Whitlock P.W., Smith T.L., Poehling G.G., 2007). Протестиро вав эффективность использования в тендопластике четырех различных типов клеток - ММСК, полученных из костного мозга, ММСК, полученных из жировой клетчатки, фиброб ластов синовиальных влагалищ и собственно тендиноцитов, исследователи не нашли существенных различий и посчи тали, что все клетки могут быть использованы для целей тка невой инженерии (Kryger G.S., Chong А.К., Costa М. et al., 2007). Также немаловажной сферой клеточных техноло гий следует признать и банкирование (криоконсервирова ние) различных клеточных популяций. Не так давно стало возможным индивидуальное сохранение ММСК, получен ных из разных тканевых источников, что, безусловно, открывает новые перспективы в применении данных клеток при коррекции посттравматических состояний.

Таким образом, в настоящее время происходит не толь ко активный поиск и разработка новых биотехнологий в травматологии и ортопедии, но и частичное их внедрение в клиническую практику. Данное обстоятельство требует де тальной проработки организационных основ предоставления пациентам подобных услуг или применения таких методов лечения.

В связи с особенностями создания клеточных технологий, клинические учреждения, как правило, включаются в эту ра боту только на этапе клинической апробации, что нельзя считать оправданным. Без тесной связи с потребностями кли нической практики разработчики могут идти по «ложному еле ду», что ведет к появлению «мертворожденных» технологий.

Как правило, разработка и внедрение клеточных техно логий происходит по двум возможным вариантам взаимо действия разработчиков и практиков. Первый, наиболее развитый в условиях зарубежного здравоохранения, подра зумевает создание клеточных технологий и клеточных про дуктов частными биотехнологическими компаниями, которые берут на себя все этапы от идеи до регистрации результатов (клеточной технологии, клеточного продукта), а в дальней шем, наладив производство, продают готовый продукт заинтересованным сторонам. О сложности реализации такой схемы в нашей стране, в условиях недостаточного пра вового регулирования, известно (Колесников С.И., 2007; Миронов С.П., 2007).

Второй и, возможно, более эффективный путь - это созда ние клиническими учреждениями в своей структуре соответ ствующих научных и лабораторных подразделений, способных на новом технологическом уровне решать актуальные кли нические задачи. Данный подход позволит обеспечить надеж ный контроль и добросовестную реализацию всего процесса лечения от обследования до медицинской реабилитации. По добные удачные примеры разработки и внедрения клеточных технологий мы видим в некоторых государственных учреж дениях Москвы, Новосибирска, Казани и др.

К сегодняшнему дню медицинская наука накопила со лидный опыт экспериментального и клинического изуче ния клеточных технологий в травматологии и ортопедии, романтический период их развития должен оставатся в про шлом. В основном сформировались основные пути их при менения. Разумеется, на множество вопросов ответы еще только предстоит найти, но следует отметить, что врачи и пациенты обоснованно ожидают того момента, когда коли чество этих исследований перейдет в безусловное качество и однозначную эффективность лечения.

Подняться вверх сайта