Поиск Кабинет

Клеточные матриксы из резорбируемых полигидроксиалканоатов

Гены & Клетки: Том II, №2, 2007 год, стр.: 68-75

 

Авторы

Шишацкая Е.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлен обзор результатов исследования пригодности резорбируемых полигидроксиалканоатов [ПГА] - линейных полиэфиров микробиологического происхождения - для разработки клеточных матриксов различного типа. Использованы высокоочищенные образцы ПГА, полученные в Институте биофизики СО РАН, синтезированные бактериями Raistonia eutropha В5786 по технологии, обеспечивающей получение ПГА различной химической структуры, С использованием ПГА в различных фазовых состояниях [растворы, эмульсии, порошки) получены и изучены структура и свойства дву- и трехмерных матриксов в виде гибких прозрачных пленок, мембран, ультратонких волокон, микрочастиц, губок, объемных плотных и пористых конструкций. Показана возможность использования общепринятых методов для стерилизации матриксов без изменения структуры, потери прочности и ухудшения адгезионных свойств поверхности и пригодность для выращивания клеток in vitro. На культурах фибробластов, гепатоцитов, клеток эндотелия и остеобластов исследована биосовместимость матриксов in vitro. С использованием микроскопии, прижизненного окрашивания клеток трипановым синим, определения синтеза белка и ДНК культивируемыми клетками, а также в тесте ММТ показано отсутствие цитотоксичности матриксов из ПГА при прямом контакте со всеми исследуемыми клетками. Полученные результаты позволяют рекомендовать ПГА - новый класс термостабильных, механически прочных, биосовместимых и резорбируемых полиэфиров, - для создания тканеинженерных конструкций различных типов, необходимых для клеточной и тканевой инженерии.

Введение

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирова ния клеток, в том числе клеток предшественников специа лизированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий и подходов для реконструктивной хирур гии. Используемый в тканевой инженерии междисциплинар ный подход направлен в первую очередь на создание новых композиционных материалов для восстановления утраченных функций отдельных тканей или органов в целом. Основные принципы данного подхода заключаются в разработке и применении при имплантации в поврежденный орган или ткань носителей из биодеградируемых материалов, которые используются в сочетании с донорскими клетками и/или с биоактивными веществами. Трансплантация клеток в зону повреждения является наиболее ответственным этапом. Для успешной индукции гистогенеза в месте имплантации необ ходимо создать высокую начальную концентрацию клеток (до 107 108 клеток), при этом простое введение суспензии кле ток может оказаться малоэффективным. Эффект трансплан тации и последующего репаративного гистогенеза зависят от того, какая часть клеток попадет в зону дефекта, адгезиру ются ли культивированные клетки ктканям и сохранят ли при этом активное функциональное состояние [1]. Одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для клеток, так как для реализации своих функциональных по тенций культивируемые клетки должны определенное вре мя находиться в фиксированном к носителю состоянии. Это может быть связано с гистогенетическим свойством дан ных клеток проявлять свои свойства, будучи организо ванными в сложные трехмерные структуры. Быстрая дегра дация носителя подложки способствует вымыванию клеток вместе с транссудатом из раны. Поэтому биорезорбируе мые имплантаты должны иметь пролонгированный срок биодеградации [2].

Среди биоматериалов, применяемых в медицине и ак тивно изучаемых для конструирования матриксов функци онирующих клеток - альгинаты, коллаген, алифатические полиэфиры, полиамиды, сегментированные полиэфируре таны, силикон, полиэтилентерефталат, полимеры гликоле вой и молочной кислот [3, 4] и с недавних пор новый класс природных полимеров, синтезируемых микроорганизмами.

Это термопластичные линейные полиэфиры гидроксипро изводных алкановых кислот (полигидроксиалканоаты, ПГА; в англоязычной литературе РИА), которые представляют большой интерес для медицины в связи с их высокой био совместимостью и механической прочностью. В отличие от полилактидов и полигликолидов, ПГА не подвержены гидролитической деградации в водных средах, поэтому они характеризуются медленной (месяцы и годы) кинетикой био резорбции, при этом их деструкция в биологических средах не сопровождается изменением активной реакции среды (5, 6). Сферы применения этих полимеров в медицине по тенциально широки и могут включать изготовление медицин ского инструментария и вспомогательных средств (нетканые и одноразовые изделия, шовные и перевязочные материа лы), фармакологию (контролируемые системы доставки ле карственных средств), восстановительную хирургию и трансплантологию (7). Особо перспективным считается ис пользование ПГА в сердечно сосудистой хирургии (8, 9), для создания матриц для биоискусственных органов (10 12), для реконструкции «мягких», костной и хрящевой тканей (13, 14).

В настоящее время ПГА активно исследуются за рубе жом. Среди малотоннажных производителей ПГА Монсан то К°, Metabolix Inc., Тepha, Proctor S. Gambel, Berlin Packaging Corp., Bioscience Ltd., BioVentures Alberta Inc., Merk, выпус кающие эти полимеры под марками Biopol®, Biopol™, TephaFLEX™, DegraPol/btc®, Nodax ™. Такие производства в настоящее время осваивают или планируют осваивать практически все развитые страны. Следует отметить, что медико биологические исследования ПГА до последних лет выполнялись исключительно за рубежом с применением фирменных образцов.

В России целенаправленные исследования отечествен ных ПГА проводятся Институтом биофизики СО РАН. Комп лексные исследования включают биотехнологические ас пекты синтеза полимеров различного химического состава, изучение структуры и физико химических свойств, отработ ку способов получения специализированных полимерных изделий и медико биологические исследования. Резуль таты этих исследований защищены серией охранных до кументов (15 20), включая зарегистрированную торговую марку Биопластотан™ (21), широко опубликованы в цент ральных российских и зарубежных журналах, а также в се рии монографических изданий (22 25).

В данной работе представлен обзор результатов иссле дования ПГА с целью разработки матриксов различного типа для культивирования клеток.

Материал и методы

Исследованы образцы полигидроксиалканоатов, полу ченные в Институте биофизики СО РАН. Полимеры синте зированы бактериями Raistonia eutropha В5786 по техно логии, обеспечивающей синтез ПГА различной химической структуры (15, 16). Исследованы два типа полимеров: поли мер р гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутират ПГБ), молекулярная масса 340 кДа, кристалличность 72%, температура плавления 170°С) и сополимеры гидроксибу тирата и гидроксивалерата с включением гидроксивалера та (от 5 до 30 мол%), молекулярная масса 120 240 кДа, кристалличность 56 64%, температура плавления 152 160°С. Экстракцию полимера из бактериальной биомассы проводили хлороформом (или дихлорметаном), осаждение -гексаном. Использовали оптимизированную процедуру эк стракции, позволяющую получать образцы высокой степени чистоты, свободные от органических примесей белковой, уг леводной и липидной природы, включая жирные кислоты (ЖК) (25). Химическую структуру образцов и наличие микопределяли после предварительного метанолиза проб по метиловым эфирам ЖК на хроматомасс спектрометре GCD plus (Hewlett Packard, США).

Двумерные матриксы в виде пленок получали методом полива разогретого до 35°С раствора ПГА на обезжирен ную поверхность предварительно нагретых до такой же тем пературы чашек Петри. Высушивали пленки в беспылевом боксе при комнатной температуре в течение нескольких су ток. Пористые пленки (мембраны) получали с использовани ем техники выщелачивания. Для этого в раствор полимера добавляли хлорид натрия; высушенные пленки для вымы вания соли помещали на 48 ч. в воду. Толщину пленок и мем бран измеряли микрометром; характеристики поверхности рассчитывали на базе измерения контактного краевого угла смачивания водой (9, град): вычисляли свободную поверх ностную энергию (ys), свободную энергию межфазовой по верхности (ySL) и величину сил сцепления [WSL) (эрг/см2)

Микроструктуру матриксов в виде пленок, а также других типов (мембран, волокон, микрочастиц и др.) анализиро вали с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (микроскоп JEM 100С с растровой приставкой ЕМ ASID 4, Япония).

Ультратонкие волокна получали методом электростати ческого формования. Принцип метода заключается в обра зовании филаментов в сильном электрическом поле, воз никающем между двумя электродами противоположной зарядности, при этом один электрод был помещен в раствор полимера, второй размещен на приемном металлическом коллекторе (матрице). Источник высокого напряжения обес печивал постоянное напряжение до 30 кВ. В ходе отработки условий формования волокон варьировали концентрацию полимера в растворе, напряжение, расстояние между иглой и мишенью, диаметр иглы.

Микросферы получали методом испарения растворителя из эмульсии (растворы полимера в дихлорметане с добав лением поливинилового спирта и/или желатина). Дисперги рование эмульсии осуществляли мешалкой, оборудованной трехлопастным пропеллером. После испарения растворите ля микросферы собирали центрифугированием и высушивали под вакуумом. Микроструктуру микросфер анализировали СЭМ, распределение частиц по размерам с использовани ем оптической автоматизированной системы счета частиц (Casy®, Германия).

Объемные матриксы конструировали из композитов ПГА и гидроксиапатита, а также коллагена. Первый тип матрик сов получали из полигидроксибутирата и биологического гидроксиапатита (ГАП) (ЗАО «Полистом», Москва). Исполь зованы образцы ПГБ со значением молекулярной массы (Мв) 220 кДа и степени кристалличности (Сх) 70±3%, имеющие температуру плавления и деградации, соответственно, 163±2 и 210±10°С. Для создания гибридного композита ПГБ/ГАП применяли механо физический метод. Выделен ный из бактериальной биомассы хлопьевидно волокнистый полимер измельчали; полученный гранулят полимера сме шивали с ГАП; далее из смеси прямым холодным прессова нием под давлением 127,2 кгс/сма формовали объемные цилиндрические компакты с различным содержанием ГАП в полимере, от 10 до 50% (по массе). Для получение пористых объемных матриксов к смеси ПГБ/ГАП перед формовани ем добавляли хлорид натрия, который далее вымывали из полученных изделий кипячением в воде.

Объемные пористые матриксы в виде губок получали пу тем модификации коллагеновой гемостатической губки (ОАО «Лужский завод Белкозин»), Губки пропитывали ра створом полимера определенной плотности и далее высу шивали. Для удаления из матрикса волокон коллагена, не пропитанных полимером, образцы инкубировали в 0,1 % растворе коллагеназы (ICN), приготовленном на среде RPMI 1640 (ICN), при 37°С в течение 24 ч„ далее высушивали.

Оценку биосовместимости матриксов проводили с ис пользованием стандарта ИСО 10993 [26]. Цитотоксичность матриксов из ПГА исследовали in vitro на животных клетках разного происхождения мезенхимального (фибробласты и клетки эндотелия) и энтодермального (гепатоциты). Были взяты культивируемые фибробласты мыши линии NIH ЗТЗ, относящиеся к минимально трансформированным клеточ ным линиям, первичные культуры паренхимных (гепатоци ты) и непаренхимных (главным образом, эндотелиальных) клеток печени мыши, а также первичная культура остеоб ластических клеток, выделенных из мезенхимальных кле ток костного мозга (МОК) крыс линии Вистар. Фибробласты NIH ЗТЗ культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТО, НПО «Вектор», Новосибирск), 1,0 мМ L глютамина, 10 мМ HEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата (BDSL, UK). Гепатоци ты культивировали в смеси сред DMEM+NCTC 135 (1:1) (BDSL, UK), содержащей 5% инактивированной при 56°С ЭТО, 0,1% глюкозы; О, 2% сывороточного альбумина для клеточных культур; 0,5 мкг/мл инсулина; 50 нг/мл декса метазона; 0,2 мкг/мл глюкагона (Sigma, США); 0,02 мМ р меркаптоэтанола; 10 мМ HEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата. Эндотелиальные клетки культивиро вали в среде Hamrs F12 (BDSL, Великобритания) с добав лением 10% ЭТО, проводя 2 3 пассажа. Клетки снимали с помощью 0,2% раствора коллагеназы, разбавленного 0,02% раствором версена. Остеобласты культивировали в гумидной среде на полной среде DMEM, содержащей 20% ЭТО, 100 Ед/мл пенициллина, 100 Ед/мл стрептомицина, кислоты, 10 нмоль дексаметазона, с ежедневной сменой среды.

Морфологию клеток, культивируемых на полимерных матриксах, анализировали общепринятыми методами све товой микроскопии; жизнеспособность окрашиванием трипановым синим. Пролиферативную активность клеток в сравнении с контролем (стекло или полистерин) изучали в реакции с ММТ (3 (4,5 диметилтиазол 2 ил) 2,5 дифенил тетразол бромидом], (тест МТТ, являющийся индикатором NAD(P)H и сохранности функций митохондрий (реактивы фирмы «Sigma») и по включению меченного радионуклеи дами предшественника синтеза ДНК (3Н тимидина). Для этого клетки высевали в пенициллиновые флаконы, содер жащие пленочные матриксы из ПГА в стандартной среде с добавлением метки (37 кБк/мл; 92,5 ГБк/мМ). Куль тивирование проводили в течение 16 ч в гумидной атмос фере с 5% С02 с отбором клеток для счета радиоактивности через 4 ч. Собранные клетки переносили на фильтры GF/с (Whatman), промывали по стандартной методике, высуши вали и просчитывали на счетчике «Бета 1» в толуольном сцинтилляторе включившуюся в ТХУ нерастворимый преци питат радиоактивность. Остеогенный потенциал объемных композитных матриксов полимер/ГАП и полимер/коллаген, засеянных остеобластическими клетками, полученными из МСК, оценивали после 10 суток культивирования, исполь зуя ММТ тест; активность щелочной фосфатазы (ЩФ) маркер дифференцировки остеобластов определяли в реакции с паро нитрофенолфосфатом.

Результаты и обсуждение

Общепринято, что материалы биомедицинского назна чения, предназначенные для контакта со средой живого организма, должны обладать комплексом необходимых био логических свойств и физико механических свойств. Тако выми являются биологическая совместимость на уровне культивируемых клеток, а также тканей макроорганизма; отсутствие токсичности, включая образуемые продукты дег радации; материал должен обладать поддерживающей для клеток функцией, способствовать пролиферации и диффе ренцировке клеток, обеспечивать свободный доступ субстра тов и отток продуктов метаболизма. Помимо необходимой механической прочности, материал должен подлежать сте рилизации общепринятыми методами, обладать устойчиво стью к воздействию агрессивных биологических средств и перерабатываться в изделия общепринятыми методами [26 29].

Комплексные доклинические исследования ПГА, включа ющие тест системы in vitro, а также острые и хронические эксперименты на лабораторных животных, показали, что образцы ПГА, синтезированные и очищенные по технологии Института биофизики СО РАН, отвечают всем необходимым требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям для медицины. Тестирование полимеров и образцов изделий из них в виде пленочных матриксов и шовных волокон вклю чало общепринятые санитарно химические, токсикологи ческие и медико биологические тесты [26] и было прове дено совместно с центром по исследованию биоматериалов ФГУ НИИТиИО Росздрава (рук. Центра проф. В.И. Севас тьянов ). Результаты исследований показали, что два типа ПГА, синтезированные и очищенные в Институте биофизи ки СО РАН, полимер гидроксимасляной кислоты (ПГБ) и со полимеры гидроксибутирата и гидроксивалерата (ПГБВ), обладают высокой биосовместимостью на уровне клеток, тканей и макроорганизма и пригодны для контакта с кро вью [30 39].

Весьма важным является вопрос о механизме и кинети ке деградации резорбируемых материалов в биологических средах. Биодеградация ПГА исследована в биологических средах in vitro (стабилизированная кровь, сыворотка крови) и in vivo при непосредственном контакте имплантатов (пле нок, шовных нитей, микрочастиц) с тканями животных и с использованием диффузионных камер, которые препятству ют формированию фиброзной капсулы и позволяют иссле довать биосовместимость и биостабильность материала с точки зрения истинной клеточной реакции. Установлено, что биодеградация ПГА протекает в биологических средах с низ кими скоростями (месяцы и годы) и реализуется по гумораль ному и клеточному пути с активным участием макрофагов и гигантских клеток инородных тел, характеризующихся вы сокой активностью кислой фосфатазы. Выявлено, что ско рость биодеградации ПГА зависит от химической структуры полимера, формы полимерного изделия и места импланта ции [40 41 ].

Для выбора адекватных способов стерилизации иссле дованы термостабильность и радиационная устойчивость ПГА [42]. Показано, что пленки, мембраны и шовные нити из ПГА подлежат стерилизации общепринятыми методами без изменения структуры и функциональных свойств, на этой основе показана возможность применения для стерилиза ции ПГА различных общепринятых методов сухо жарочной обработки, автоклавирования, дезинфицирующих растворов и у облучения [39, 41, 43].

Важным свойством ПГА является возможность перера ботки в специальные изделия общепринятыми методами из различных фазовых состояний без применения технологи ческих добавок и пластификаторов [5]. На основе изучен ных закономерностей растворимости и плавления ПГА и физико химических характеристик полимерных растворов, гелей и расплавов получено семейство 2 х и 3 х матриксов различных типов для культивирования клеток: гибкие плен ки и пористые мембраны, моножильные волокна диаметром 0,15 0,40 мм, ультратонкие волокна диаметром 1 5 мкм, микрочастицы, губки, плотные и пористые объемные мат риксы, в том числе в композиции с гидроксиапатитом и коллагеном [35, 43 47].

Из растворов ПГА различной плотности методом полива получены гибкие прозрачные пленки, которые имели следу ющие характеристики: толщина от 0,05 до 0,1 ±0,01 мм, проч ность 4,0±0,28 кг/мма, модуль упругости 130±28 кг/мма, удлинение при разрыве около 4% (рис.1 А). Вычисленные на базе измеренных контактных краевых углов смачивания 9 имели близкие значения поверхностного натяжения (у) 34,66 36,18, свободной энергии межфазовой поверхности 6,35 7,00, величины сил сцепления (WSL) 100,81 102,63 эрг/сма. По изученным характеристикам гидрофобная поверхность пленочных матриксов, полученных из ПГБ и ПГБ/ПГВ, близка к таковым у синтетических полиэфиров (полиэтилентереф талата, полиметилметакрилата, поливинилхлорида и поли этилена).

Общеизвестно, что свойства поверхности матриксов иг рают большую роль для прикрепления и пролиферации кле ток. Для повышения адгезионных свойств поверхности по отношению к клеткам, улучшения газодинамических свойств изделий и повышения их проницаемости для субстратов и продуктов обмена клеток применяют различные подходы, включая обработку изделий физическими факторами или химическими реагентами. Для повышения биосовместимо сти матриксов из ПГА известны положительные примеры иммобилизации на поверхности пленочных матриксов кол лагена [48], прививание хитозана, хитозан/полисахаридов или гиалуроновой кислоты [49].

Для повышения гидрофильное™ и адгезионных свойств матриксов из ПГА в центре по исследованию биоматериа лов ФГУ НИИТиИО Росздрава добавлением к растворам сополимера ПГБ/ПГВ в качестве пластифицирующего на полнителя полиэтиленгликоля получен вариант полимерного матрикса ЭластоПОБ [50]. Исследование ЭластоПОБ по казало, что его основные характеристики (ультраструктура поверхности, краевой угол смачивания и др.) близки к тако вым у матриксов из нативного полигидроксибутирата, одна ко при анализе поверхности ЭластоПОБ на атомно силовом микроскопе оказалось, что данные образцы отличаются по значениям шероховатости поверхности. Шероховатость поверхности ЭластоПОБ составила 53,8 нм, что существен но меньше показателя у исходного сополимера (82,4 нм) [51 52]. Это является позитивным моментом, так как ше роховатость поверхности влияет на адгезию и расплас тывание клеток на матриксах, определяет их двигательную активность и другие функциональные характеристики. Пока зана эффективность применения ЭластоПОБ для культиви рования различных типов клеток и их последующего исполь зования для регенерации поврежденных тканей [53 54].

Один из подходов, применяемых для модификации по верхности матриксов, заключается в обработке газовой плазмой. Так, при обработке пленок из ПГА аммониевой плазмой в течение 10 мин происходило включение в струк туру пленки до 8% азота, что сократило контактные краевые углы на 20 30°, сделав поверхность более гидрофильной [55]. Сравнительно недавно стали появляться работы, в ко торых для улучшения свойств ПГ А применяют лазерную обра ботку. Обработка материалов лазером имеет преимущества в сравнении с другими методами, так как позволяет при цельно модифицировать поверхности без разрушения ма териала и образования токсичных продуктов. Полагают, что в областях, обработанных лазером, увеличивается прочность адгезионного шва между фазами, возрастает гидрофиль ность и, следовательно, повышаются адгезионные свойства поверхности. На кафедре высокоэнергетических процессов политехнического Института Сибирского федерального уни верситета под руководством профессора В.В. Слабко про ведена лазерная обработка пленочных матриксов их ПГА, полученных в нашей лаборатории [56]. В связи с тем, что пленки и мембраны, изготовленные из ПГА, прозрачны в видимой и ближней ИК спектральных областях, для их обра ботки пригодны лазеры, генерирующие излучение с длиной волны, лежащей в дальней ИК области. Был использован С02 лазер, мощность которого варьировала в диапазоне от 3,0 до 30,0 Вт. Получена серия пленок с измененной по верхностью, от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 2А С). Исследована микроструктура и свойства поверхности в зависимости от характера облуче ния и найдены условия, позволяющие снизить контактные краевые углы поверхности до 50% и существенно повысить гидрофильность матрикса без разрушения структуры ма териала. Прикрепляемость фибробластов и остеобластов на таких матриксах была на 18% выше по сравнению с исход ными показателями.

К числу основных требований, предъявляемых к матрик сам для культивирования клеток, относится комбинация ме ханической прочности с высокой объемной пористостью конструкции. Требования к размерам пор специфичны в зависимости от типа культивируемых клеток. От размера пор в матриксе зависят диффузионные свойства конструкции, определяющие отток продуктов обмена клеток и снабжение их питательными компонентами. Один из способов получе ния пористых полимерных матриксов получение раство ров двухкомпонентных смесей, содержащих растворимый и нерастворимый в воде компоненты, и последующее выще лачивание из готового матрикса в растворе одного из ком понентов. При использовании техники выщелачивания, как правило, применяют кристаллы хлорида натрия или сахаро зы, которые обладают высокой растворимостью. Варьируя концентрацию последних, можно задавать общую пористость матриксов и размеры пор. На рис.1В показан в качестве примера образец пористого матрикса из ПГА, полученно го таким способом. Возможно также применение трехком понентных смесей, состоящих из растворов полимеров и осадителей. На базе изучения растворимости полигидрок сибутирата в ряде растворителей (хлороформе, дихлорэ тане, тетрахлорэтане и диоксане), исследованных свойств полимерных растворов, включая поведение растворов при их взаимодействии с другими жидкостями, не являющими ся растворителями для ПГА (тетрагидрофураном (ТГФ), ди метилформамидом (ДМФ), этанол, вода) (57], найдены оп тимальные концентрации каждого осадителя и показана пригодность таких трехкомпонентных систем для получения высокопористых полимерных матриксов с размером пор меньше 5 10 мкм (рис. 10).

Исследования полученных матриксов из ПГА двух типов (ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ с различным включением гидроксивалерата) в виде пленок и мембран показало, что они обладают высокой биосовместимостью по отношению к культивируемым клеткам. Первичная оценка цитотоксич ности матриксов проведена в культурах клеток [30]. Фиб робласты мыши линии NIH ЗТЗ хорошо адгезировали на поверхности полимерных мембран из ПГБ и ПГБ/ПГВ (с включением гидроксивалерата от 4 5 до 30 мол%). Коли чество клеток, адгезированных на поверхности мембран после стерилизации, также было сопоставимо с контролем (стекло, полистерин). Морфология клеток, культивируемых при прямом контакте с поверхностью полученных матрик сов, не отличалась от клеток в контроле, выращиваемых на стекле или полистерине. Оценка жизнеспособности клеток при помощи метода прижизненного окрашивания трипановым синим показала, что 99,8±0,2% клеток при прямом контакте с ПГБ и ПГБ/ПГВ не включали краситель, то есть сохраняли высокую жизнеспособность. В ходе изучения синтеза ДНК клетками, культивируемыми на полимерных матриксах, не обнаружено снижения включения 3Н тимидина ядрами всех типов клеток (фибробластов, гепатоцитов и клеток эндоте лоия) по сравнению с контролем, следовательно, прямой контакт клеток с поверхностью матриксов из ПГА обоих ти пов не приводил к ингибированию синтеза ДНК. Культиви рование фибробластов и гепатоцитов в течение 3 х суток на поверхности данных матриксов не влияло на время гене рации клеток и синтез белка. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной пригодности ПГА в качестве матриксов для культивирования клеток.

К перспективным новым методам получения нетканых материалов (ультратонких волокон, мембран и микрочас тиц), как модели клеточных матриксов, относят методы на нотехнологии, включая технику микроинкапсулирования и электростатического формования (ЭСФ). Принцип метода ЭСФ заключается в образовании филаментов в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электро дами противоположной зарядности, при этом один электрод помещается в раствор или расплав полимера, второй раз мещается на приемном металлическом коллекторе (матри це). В зависимости от разности потенциалов, молекулярной массы полимеров и плотности используемого раствора, а также расстояния между подающим и принимающим ра створ устройствами образуются волокна различного диа метра и различной структуры. Примечательно, что метод ЭСФ позволяет получать ультратонкие волокна и пористые структуры на их основе из растворов и расплавов полиме ров различного строения. Этот метод получил сильное раз витие в настоящее время в связи с потребностями новых биомедицинских технологий клеточной и тканевой инжене рии. К настоящему моменту описаны различные варианты метода для формования ультратонких волокон и мембран из полимеров различного типа. Первый пример использо вания метода ЭСФ для получения ультратонких волокон из ПГА реализован нами на сополимере ПГБ/ПГВ [46]. Иссле довано влияние плотности полимерных растворов и пара метров формования на диаметр и качество получаемых во локон, в результате выявлены оптимальные условия, позволяющие получать волокна хорошего качества димет ром от 1 до 5 мкм (рис. ЗА). Полученные волокна размеща ли на дне 26 луночных планшетов, засевали фибробласта ми мыши линии NIH ЗТЗ и культивировали в С02 инкубаторе в стандартной среде. Результаты показали, что число адге зированных клеток и пролиферативная активность, измерен ная в тесте ММТ, были достоверно выше, чем в контроле.

Активно разрабатываемые в последние годы методы микроинкапсулирования позволяют получать микрочасти цы с микро и наноразмерным диаметром, которые в силу высочайшей развитости поверхности и возможности имп лантирования подкожно, внутримышечно и инфузионно име ют огромные перспективы не только для разработки систем контролируемой доставки лекарственных средств, но и в ка честве матриксов для выращивания клеток. Исследование применимости ПГА для этих целей показало возможность получения микрочастиц хорошего качества и различного диаметра [47]. При этом выявлено влияние техники изготов ления (типа эмульсии и способа диспергирования, темпера туры среды) на выход микросфер, их структуру и размер. С применением технологии испарения растворителя из двух и трехкомпонентной эмульсий на основе ПГА отработана про цедура стабильного получения микросфер (рис. ЗВ). Показа на высокая биосовместимость микрочастиц в культурах клеток, а также при инъекционном введении in vivo [58].

На рис. ЗС показан внешний вид объемных пористых мат риксов, полученных армированием коллагеновой губки по крытием из полигидроксибугирата. В ходе пропитки губки хло роформом коллаген не растворялся и не терял свою исходную форму. Содержание полимера и коллагена в полученной мат рице составило 4:1 (по массе). Влагопоглощение матрицы (использованы СФБ и среда RPM11640) было высоким (со ответственно, 94 и 97%). Композитный матрикс оказался более стабильным в жидких средах по сравнению с исходной губкой, которая, несмотря на то, что коллаген плохо раство ряется в воде, через сутки экспозиции в среде RPM11640 при 37°С теряла форму. Через неделю потеря массы губки составила 25% от исходной. В аналогичных условиях губка, армированная полимером, сохраняла форму и массу изде лия длительное (до 34 суток) время. Исследование получен ных матриксов в культуре фибробластов показало отсутствие токсического действия. Имплантация матриксов подкожно и внутрибрюшинно лабораторным животным показали их ста бильность в течение наблюдаемого периода (60 суток).

Развитие методов клеточной и тканевой инженерии со здали предпосылки для разработки новых технологий для реконструктивной ортопедии. Основную часть биоматериа лов для восстановления костных дефектов до недавнего вре мени получали из хрящевой и/или костной тканей человека и животных. В настоящее время для реконструкции костных дефектов наиболее распространенным материалом с четко выраженной опорной функцией являются искусственные и натуральные кальций фосфатные материалы. Одним из под ходов, направленных на улучшение механических свойств гидроксиапатита (уменьшение жесткости, повышение элас тичности), стало получение композитов гидроксиапатита с синтетическими полимерами. Новым решением проблемы является создание гибридных материалов на основе гидро ксиапатита и полимеров, способных к биодеградации. В связи с тем, что скорости биорезорбции ПГ A in vivo в несколько раз ниже, чем у других известных биоразрушаемых биоматериа лов (полилактида, полигликолида), имеется принципиальная возможность использования этих полиэфиров для долговре менной регенерации крупных костных дефектов [59 61].

Механо физическим методом нами получены объемные плотные и пористые матриксы из полигидроксибутирата и гидроксиапатита (ПГБ/ГАП) (рис. 4А.В) и исследованы структура и физико химические свойства [45]. Композитные матриксы засевали остеобластическими клетками. Био совместимость и функциональные свойства матриксов подтверждены in vitro в тесте ММТ и по определению ак тивности щелочной фосфатазы (маркер дифференцировки остеобластов), а также in vivo (тест эктопического костеоб разования) [44]. Показано, что сконструированные гибрид ные объемные матриксы из ПГБ/ГАП обладают остеогенным потенциалом, способствуют образованию костной ткани из МСК и могут быть использованы для дальнейших исследо ваний в качестве биоактивных конструкций для регенерации дефектов костей.

Таким образом, в настоящей обзорной работе представ лены результаты использования полигидроксиалканоатов резорбируемых полиэфиров микробиологического происхож дения, для конструирования клеточных матриксов. Показа на возможность получения дву и трехмерных матриксов разных типов и их пригодность для выращивания клеток in vitro. Полученные результаты позволяют заключить, что этот класс термостабильных и механически прочных полимеров перспективен для создания тканеинженерных конструкций различных типов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Програм мы Президиума РАН «Фундаментальные науки медицине» (проект 12,5), Программы междисциплинарных интеграци онных проектов СО РАН (проект № 14), Программы Прези дента РФ для поддержки молодых кандидатов наук (грант №. МК 4149.2006), Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) и Министерства образо вания и науки РФ (грант № ВРМ002).

Подняться вверх сайта