Поиск Кабинет

К вопросу о фибробластоподобных клетках в периферической крови человека

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 72-78

 

Авторы

Хлусов И.А., Нечаев КА, Шевцова Н.М., Хлусова М.Ю., Дворниченко М.В., Зайцев К.В., Колокольцова Т.Д., Больбасо Е.Н., Шаркеев Ю.П., Легостаева Е.В., Сабурина И.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Проведена оценка in vitro клеточных и молекулярных процессов в многоклеточной системе мононуклеарных клеток крови 4 здоровых добровольцев при кратковременном (52 ч) контакте с искусственными материалами, in vivo индуцирующими остеогенную дифференцировку мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. В качестве раздражителей использованы титановые диски (диаметр 10 мм) с композитным (полимерно-кальцийфос-фатным) и кальцийфосфатным покрытиями в остеогенной культуральной среде. Установлено с помощью цитологических, цитохимических методов и иммуноферментного анализа, что во фракции мононуклеарных лейкоцитов крови здорового человека может циркулировать до 18—29% стромальных, в том числе клоногенных клеток, индуцируемых in vitro к фибробластоподобной трансформации искусственным материалом с полимерно-кальцийфосфатной поверхностью. TNF— является одним из факторов, способствующих фиброб-ластоидной морфофункциональной активности мононуклеарных клеток крови при сокультивировании с полимерно-кальцийфосфатным материалом. Разработанная методология может оказаться полезной в приложении к задачам клеточной терапии и тканевой инженерии.

По данным ряда авторов, в периферической крови человека обнаружена очень малая популяция прилипающих к пластику клеток, несущих морфологические и фенотипические характеристики мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [1, 2]. Вероятность выделения колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-Ф) из фракции мононуклеарных лейкоцитов человека варьирует от нуля у здоровых доноров[3] до 73% при мобилизации крови[4].

Количество стромальных стволовых клеток увеличивается при иммуноселекции, а также заболеваниях или методиках, способствующих их выходу из костного мозга[5—7]. В частности, ранее нам удалось определить фибробластоподобные клетки в периферической крови больных несовершенным остеогенезом. При этом их доля в краткосрочной культуре увеличивалась по мере роста тяжести заболевания с 4 до 14%[8].

Необходимо подчеркнуть, что циркуляция в крови КОЕ-Ф, содержащих в составе колоний ММСК и стро-мальные предшественники[3, 6], была установлена ранее[9].

Следует отметить, что в свете активного поиска источника клеток для терапии, кровь человека более доступна по сравнению с другими источниками стволовых клеток. Однако, колониеобразующая эффективность КОЕ-Ф в крови здоровых доноров низкая, их труднее выявлять. Оценка данной популяции клеток, особенно у человека, представляет трудную задачу вследствие несовершенства методологических подходов к их выделению и культивированию. В конечном итоге это препятствует их дальнейшей характеристике и созданию клеточных препаратов, пригодных для клинического применения, тканевой инженерии и клеточной терапии[3].

Важным остается вопрос о количестве стромальных клеток различной степени зрелости, способных циркулировать в периферической крови здоровых людей[3, 6]. Поиск технологических приемов, направленных на решение данной задачи, представляет несомненный научно-практический интерес.

В связи с этим, была проведена оценка in vitro клеточных и молекулярных процессов, протекающих в многоклеточной системе мононуклеаров крови человека при кратковременном контакте с искусственными материалами, способными in vivo индуцировать остеогенную дифференцировку ММСК костного мозга[10, 11].

Материал и методы

В работе в качестве подложек для культивирования клеток применялись титановые диски ВТ1.0 (диаметр 10 мм, толщина 1 мм) с двусторонними биоактивными покрытиями.

В качестве связующего компонента для изготовления композитов на титановых подложках был выбран биоинертный сополимер тетрафторэтилена с ви-нилиденфторидом. Неорганической составляющей композитных покрытий служил синтетический гидро-ксилапатит (ГАП), фазовый состав которого доказан методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 6000. Раствор композита (соотношение органического и минерального компонентов 50:50 масс.%) наносили методом пневматического распыления на предварительно подготовленные и нагретые до 70°С титановые диски.

Кальцийфосфатные покрытия наносили на титановую подложку с помощью модификации способа анодно-искрового (микродугового) оксидирования в растворе 10% фосфорной кислоты, содержащей взвесь наноразмерных частиц ГАП синтетического происхождения[12]. Механохимический синтез на-норазмерного (диаметр частиц 10^40 нм) ГАП осуществляли, как описано ранее[13].

Растровую электронную микроскопию (РЗМ) рельефа искусственных поверхностей проводили на установке Philips SEM 515 в материаловедческом центре коллективного пользования при Томском государственном университете.

Исследования выполняли с согласия локального этического комитета (протокол №4 от 01.10.2009) и ученого совета Томского филиала ФГУ РНЦ ВТО им. академика Г.А. Илизарова (протокол №7 от 27.10.2009). Использовали фракцию мононуклеар-ных лейкоцитов 4 доноров в возрасте 28^35 лет, не страдавших острыми и хроническими заболеваниями, подписавших информированное согласие на диагностическую процедуру. Периферическую кровь получали из локтевой вены, собирали в пробирки типа «Vacuette» для выделения мононуклеаров (BD Diagnostics, США). Кровь в стерильных условиях центрифугировали в течение 10 мин при 500 g на градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia, Швеция) (р = 1,077 г/см3) с последующим двукратным отмыванием клеточного материала от реактива.

Взвесь мононуклеаров, жизнеспособность которых составляла не менее 95%, культивировали в 12-лу-ночных планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в течение 52 ч при температуре 36°С в концентрации 3x108 ядросодержащих клеток в 1 мл полной культуральной среды, содержащей 80% среды DMEM/F12 (GIBKO, Великобритания), 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma, США), 280 мг/л L-глутамина («Биолот», РФ), 50 мг/л гентамицина сульфат («Дар-ница», Украина), 10 мМ бета-глицерофосфата (Sigma-Aldrich, США), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты («Дальхимфарм», РФ), 10 8 М дексаметазона (КРКА, Словения).

Мононуклеарную фракцию лейкоцитов культивировали в лунках (площадь поверхности 346 мм2) с добавлением стерильного диска с кальцийфос-фатным или композитным (полимерно-кальций фосфатным) покрытием. Контролем служил рост клеток на пластике. В каждом случае использовали по 3 диска.

После культивирования супернатанты (кондиционные жидкости) получали путем забора надосадочной части клеточных культур, их центрифугирования в течение 10 мин при 500 д. В кондиционных средах методом ИФА реактивами Nordic Bioscience Diagnostics (Дания) оценивали маркеры костного ремоделирования (концентрацию остеокальцина, С-кон-цевых фрагментов молекул коллагена I типа (CrossLaps)), как описано ранее[14]. Кальций и неорганический фосфор измеряли колориметрическим стандартным методом[15]. Концентрацию фактора некроза опухоли-альфа TNF— в супернатантах определяли с помощью наборов для ИФА («Вектор Бест», Россия) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов проводили по калибровочной кривой с использованием фотометра «Multiscan ЕХ» (США).

Мононуклеары крови, прилипшие к пластику, фиксировали 30 с в парах формалина, окрашивали на неспецифическую эстеразу по способу Леффлера, щелочную фосфатазу методом азосочетания по G. Gomori в модификации А.Г. Михеева (1972) или кислую фосфатазу методом азосочетания по A. Goldberg, Т. Вагка (1962)[16]. Применяли реактивы нафтол-AS-BI фосфат, а-нафтилацетат эстераза, прочный синий РР соль фирмы Lachema (Чехия). Кроме того, для исследования морфологии клеток препараты докрашивали гематоксилином в течение 5 мин.

В каждом поле зрения (увеличение 400) считали долю окрашенных и неокрашенных клеток с округлой или фибробластоподобной морфологией, а также число кластерообразующих единиц фибробластов (КлОЕ-Ф), содержащих менее 50 клеток. Определяли площадь поля зрения (0,244 мм2) с использованием объект-микрометра 0М0, соответствующего ГОСТ 7513-75.

Результаты обрабатывали согласно методам компьютерной морфометрии[17, 18]. Секреторную реакцию мононуклеаров крови здоровых добровольцев на контакт с искусственными материалами оценивали в процентном выражении от соответствующей реакции клеток на пластик.

Статистическую обработку данных выполняли с применением программы «STATISTICA 6.0 for Windows». Для описания изменчивости количественных признаков использовали общепринятые статистические процедуры, включая расчет параметров распределений (средние значения X, статистическую девиацию SD). Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова — Смирнова. Для оценки статистической значимости различий применяли t-критерий Стьюдента, непараметрические критерии Вилкоксона (Т-тест) и Манна — Уитни (U-тест). Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

Существует прямое (свойства поверхности) и опосредованное через продукты деградации влияние имплантатов на жизнедеятельность клеток и тканей[19]. Использованные в работе имплантаты с обоими типами покрытий индуцируют остеогенную диф-ференцировку клеток костного мозга мышей в тесте эктопического костеобразования[10, 11], что подчеркивает их влияние на пул ММСК.

Постановка текущего эксперимента in vitro позволила выяснить морфофункциональное состояние клеток, прикрепляющихся к пластику вне зоны непосредственного контакта с искусственным материалом, находящимся в культуральной среде. В подобном случае реакция клеточной культуры связана с суммарным воздействием, опосредованным через их секреторную активность и продукты деградации изделий.

Проведенные исследования показали, что в остеогенной культуральной среде без дисков (контроль) морфология фибробластов отмечалась менее чем у 2,5% мононуклеарных лейкоцитов, прилипающих к пластику (рис.1). В то же время, в присутствии искусственных спутников (дисков) с композитным покрытием до 18^29% мононуклеаров периферической крови человека проявляли в культуре фиб-робластоподобную морфологию (табл.1, рис.1). При этом они демонстрировали положительную цитохимическую окраску на кислую фосфатазу и неспецифическую эстеразу (рис. 2, 3). Согласно обзору Q. Не с соавт. (2007), это соответствует ферментативному профилю ММСК в периферической крови человека.

Меньшая доля клеток (см. табл.1) проявляла слабую активность (в виде отдельных гранул) щелочной фосфатазы (рис. 4). При этом инициация активности ЩФ в культуре связана с продуктами деградации имплантатов, несущих КФ покрытие[20], в том числе с выходом в раствор ионов кальция и фосфора (табл. 2), и может свидетельствовать в пользу остеогенной дифференцировки стромальных клеток[21].

Возрастающая более чем в 2 раза концентрация CrossLaps в супернатантах культур мононуклеаров крови требует дальнейшего изучения. Однако, по существующим представлениям[21], этот факт предполагает формирование и ремоделирование коллагенового матрикса. Тем более, что стромальные клетки, окрашивающиеся на кислую фосфатазу, считаются фиброкластами[22] и остеокластами[21], ремоделирующими межклеточный матрикс соединительной ткани и ее производных.

По-видимому, присутствие в культуральной среде искусственных материалов, несущих фосфаты кальция, способствует усилению остеогенной диф-ференцировки клеточной культуры мононуклеаров крови. Циркуляция в крови взрослых людей фракции остеобластоподобных клеток, составляющей при длительном культивировании в остеогенной среде 1^2% мононуклеарных лейкоцитов и возрастающей при усилении костеобразования, показана в работе G.Z. Eghbali-Fatourechi с соавт. (2005)[23].

Одним из предполагаемых механизмов морфофункциональной трансформации клеток является выход из покрытий кальция, способного влиять на цитоскелет клеток[24]. Действительно, использованные нами в экспериментах диски с кальцийфосфатным покрытием активно растворяются в модельных биологических жидкостях[25]. При этом существуют кальций-зависимые и кальций-независимые пути выживания остеобластов[26].

Реакция клеток in vitro на контакт с искусственными поверхностями активно изучается[27]. Ответ мононуклеаров крови, включая цитокиновый профиль, различается в зависимости от свойств искусственных материалов[28].

Структура использованного нами композитного покрытия (рис. 5) представляет собой многоуровневую макропористую (линейный размер пор в пределах 100 мкм) систему, в которой частицы ГАП связаны между собой полимерным компонентом. Мезорельеф композита во многом напоминает структуру губчатой кости.

РЗМ исследование поверхности кальцийфосфат-ных покрытий, полученных с помощью микродугового оксидирования, показало выраженную микрошероховатость, образованную сферолитами с линейным размером до 30 мкм с единичными или многочисленными порами 5^20 мкм в диаметре (рис. 6).

При сокультивировании с мононуклеарными лейкоцитами шероховатые диски с кальцийфосфатным покрытием не меняли их морфологию и не влияли на секрецию TNF-— (40,98 пг/мл с ошибкой среднего (т] 1,25 пг/мл при 41,74+0,60 пг/мл в культуре на пластике). С другой стороны, композитные (полимерно-кальцийфосфатные) пористые поверхности способствовали более чем 16-кратному повышению концентрации цитокина в кондиционных средах (табл. 2) и увеличению до 18^29% доли фибробластоподобных клеток (см. табл. 1). По-видимому, TNF— является одним из факторов, способных индуцировать фиброб-ластоидную трансформацию мононуклеаров крови в условиях их сокультивирования с материалом, несущим искусственное композитное покрытие.

Так, композитные имплантаты активируют моноциты/макрофаги[19], основные клетки-продуценты TNF—[19, 29] в периферической крови. В свою очередь, TNF-— является аутокринным фактором регуляции ММСК[6], тормозящим их дифференцировку в остеобласты[30], стимулирующим пролиферацию фибробластов[31], их ферментативную и секреторную активности[29, 32].

Изучение клоногенной активности краткосрочной культуры мононуклеаров крови показало, что количество КлОЕ-Ф варьировало в пределах 0^3 кластера в каждом поле зрения (0,244 мм2). При этом, в случае использования искусственного раздражителя с композитным покрытием на 1 мм2 площади пластиковой поверхности наблюдалась плотность КлОЕ-Ф в среднем около 7 кластеров, состоящих из 4^16 клеток (табл. 3, см. рис. 2). В среднем 56% клеток в составе кластеров окрашивались на кислую фос-фатазу, 29% — на неспецифическую эстеразу.

В присутствии дисков, несущих кальцийфосфат-ное покрытие, плотность КлОЕ-Ф составляла в среднем немного более 1 кластера, включающего 5^8 клеток (см. табл. 3), на 1 мм2 площади пластиковой поверхности.

В контрольной культуре мононуклеаров, не контактирующих с дисками, был отмечен только 1 кластер, содержащий 19 округлых клеток, из которых 16 (84%) были окрашены на неспецифическую эстеразу, что может соответствовать морфофункциональному профилю моноцитов/макрофагов[1, 33].

Известно, что незначительная (до 0,5%) субпопуляция мононуклеарных клеток периферической крови, получивших название «фиброциты»[1], проявляет в культуре адгезирующую активность и фибробласто-подобную морфологию, промежуточный между гемо-поэтическими и стромальными стволовыми клетками иммунофенотип, экспрессирует антигены коллагенов I и III типов[34, 35], способна дифференцироваться в том числе в производные мезенхимы[36].

Экспериментальные и клинические наблюдения свидетельствуют, что концентрация этих клеток может значительно повышаться при патологических реакциях и восстановлении повреждений[7, 36, 37], служить маркером стабилизации или обострения процесса[38].

Согласно обзору Q. Не с соавт. (2007), колониеобразующая эффективность (число колоний на 10е культивируемых мононуклеарных клеток) интактных стромальных стволовых клеток в крови здоровых добровольцев очень невелика и варьирует в пределах 0^0,27 КОЕ-Ф. Ранее удалось обнаружить только 2 колонии фибробластоподобных клеток на 10 образцов крови здоровых доноров[39], что связывают с недостатком факторов роста в первичной культуре мононуклеаров крови[3].

В сравнении, количество ММСК в костномозговом трансплантате составляет в среднем 2^5 на 108 мононуклеарных клеток и может оказаться недостаточным для его успешного приживления[6]. В связи с этим, для регенеративной медицины и биоинженерии необходимы адекватные с точки зрения физиологии методы, повышающие концентрацию активных стволовых клеток человека. Представленная нами методология может оказаться полезной для повышения in vitro концентрации стромальных, в том числе стволовых, клеток человека до уровня, пригодного для клеточных технологий.

Расчеты показывают, что искусственные матрицы (площадь 1-й искусственной поверхности составляет 78,5 мм2) способны in vitro индуцировать кластерообразующую активность стромальных клеток в остеогенной среде. Даже с учетом того факта, что в лунке под диском клетки не растут, в короткие сроки эффективность выхода КлОЕ-Ф на пластике может достигать значительных величин. При этом поверхности, несущие полимерную составляющую, в сравнении с кальцифосфатным покрытием, являются более сильным индуктором для культуры мононуклеарных лейкоцитов крови (см. табл. 3).

С одной стороны, представленная методология позволяет задуматься над вопросом, действительно ли в крови человека циркулирует незначительное число клеток из пула ММСК. Тем более, что полученные результаты во многом согласуются с данными других исследователей[23].

С другой стороны, вследствие краткосрочности культивирования (52 ч) мишенью могут быть более зрелые клетки крови. В частности, CD14+ моноциты периферической крови могут трансформироваться in vivo в фибробластоподобные клетки, названные фиброцитами, в течение нескольких дней. При этом выход таких клеток in vitro занимает до 2-х недель и зависит от многих условий культивирования[40].

В связи с этим, разработанную модель краткосрочного культивирования следует развивать как вариант «биореактора in vitro», позволяющего выделять и наращивать биомассу индуцированных фибробластоподобных клеток, пригодных для проведения научных исследований или практического применения в терапии заболеваний человека.

Выводы

1. Искусственные материалы с полимерно-каль-цийфосфатной остеогенной поверхностью индуцируют in vitro фибробластоподобную трансформацию мононуклеарных, в том числе клоногенных, клеток крови здорового человека.

2. TNF— может быть одним из факторов, способствующих фибробластоидной морфофункциональной активности мононуклеаров крови человека при их кратковременном контакте с полимерно-кальцийфос-фатным материалом.

3. Разработанные условия индукции дифферен-цировки мононуклеарных клеток могут быть использованы при создании новых клеточных технологий, препаратов для тканевой инженерии и регенеративной медицины.

Подняться вверх сайта