Поиск Кабинет

Изучение биосовместимости трансплантатов клапанов сердца, девитализированных антикальцинозным способом

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 36-41

 

Авторы

Акатов В.С., Муратов Р.М., Фадеева И.С., Сачков А.С., Бритиков Д.В., Фесенко Н.И., Соловьев В.В., Чеканов А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Ранее нами был предложен способ антикальцинозной де-витализации трансплантатов клапанов сердца, который вызывает полную гибель клеток, но не удаляет их из матрикса.

Используя известную модель подкожной имплантации крысам для изучения кальцификации материалов, было показано, что предложенный способ модификации трансплантатов полностью подавляет их кальциноз. В настоящей работе исследовали биосовместимость алло- и ксенотрансплантатов, девитализированных антикальцинозным способом, используя модель ортотопической имплантации аортально-клапанных комплексов в системный кровоток собаки. Установлено, что живые и девитализированные антикальцинозным способом аллографты аорты становятся бесклеточными после 4 мес. имплантации. Антикальцинозная девитализация аллографтов аорты подавляет иммунную реакцию, предотвращает дегенерацию тканевого матрикса и подавляет кальциноз при имплантации в аорту собакам. Ксенографты, обработанные методом антикальцинозной девитализации, при имплантации вызывают сильный иммунный ответ, который приводит к реорганизации матрикса в неупорядоченную соединительную ткань и общему повреждению матрикса. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что аллографты клапанов сердца, обработанные антикальцинозным способом могут быть рекомендованы для клинических испытаний.

Криосохраненные аллографты клапанов сердца используются в сердечно-сосудистой хирургии для замещения аортального или легочного клапанов сердца. Однако такие протезы обладают ограниченной долговечностью, особенно при имплантации молодым пациентам[1]. Этот недостаток обусловлен кальцинозом и структурной дегенерацией имплантированной ткани. В качестве основной причины этих изменений рассматриваются клетки донора, в частности, иммунный ответ на HLA антигены этих клеток[2—5], а также участие погибших клеток в инициации кальцификации ткани трансплантатов[6]. Предполагается, что при разрушении клеток в ткани (децеллюларизация) можно снизить иммунный ответ на трансплантат, подавить кальциноз и, таким образом, увеличить срок службы биопротеза. На основании этого предположения разными авторами предлагаются различные способы де-целлюларизации трансплантатов клапанов сердца и сосудов[7—*15], Однако предлагаемые способы не обеспечивают в полной мере подавление патологических изменений в трансплантатах[16]. Ранее нами был предложен способ антикальцинозной девитализации, и было показано полное подавление минерализации ткани после такой девитализации в модели подкожной имплантации крысам.

В данной работе мы исследовали биосовместимость алло- и ксенотрансплантатов клапанов сердца, подвергнутых антикальцинозной девитализации, в модели ортотопической имплантации крупным лабораторным животным.

Материал и методы

Животные. Эксперименты выполнялись на беспородных собаках в возрасте около 2 лет и весом 20^25 кг. Некоронарный синус аорты со створкой, имплантировался в дефект стенки нисходящей аорты. Было выполнено 3 серии хронических экспериментов по 5 экспериментов в каждой серии. Длительность наблюдения составила 4 мес. Исследовали жизнеспособные (группа 1) и девитализированнные (группа 2) аллографты, а также девитализированные ксенограф-ты (группа 3). Все животные содержались в условиях гуманного обращения в соответствии с Европейской Конвенцией о содержании животных. Цель исследования и экспериментальный протокол работы с животными были одобрены этическими комитетами Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН и Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Получение и антикальцинозная девитализация ал-лографтов и ксенографтов клапанов сердца. Донорские клапаны сердца собак были получены в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН после выполнения острых экспериментов. Клапаны сердца свиньи были получены непосредственно после забоя животных на мясокомбинате. Жизнеспособные аллографты (группа 1) стерилизовали в смеси антибиотиков в течение 24 ч при 4°С и замораживали в присутствии криопротектора (10% раствора диметилсульфоксида) со скоростью 1°С/мин до -170°С.

Девитализацию трансплантатов (группы 2 и 3) осуществляли путем инкубации в 0,9% растворе хлористого натрия (буфер HEPES 10 мМ, pH 6,0), содержащем дигитонин (0,02%) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЗДТА (10 мМ)) при 20°С в течение 2 сут. при непрерывном перемешивании раствора. Ткани после девитализации трижды отмывались стерильным физиологическим раствором[17]. Далее производились стерилизация и криосохранение так же, как в группе 1.

Техника операции. В условиях нейролептанальге-зии и эндотрахеальной интубации выполняли левостороннюю торакотомию в пятом межреберье. Грудную аорту мобилизовали от брахиоцефальных сосудов до третьей пары межреберных артерий. Затем аорту ка-нюлировали двумя Г-образными канюлями French-18, которые затем соединяли, и таким образом создавали временный шунт. Аорту на канюлях пережимали, и в её стенке создавали дефект, в который вшивали некоронарный синус аллографта со створкой (пролен 5-0).

Гистологический анализ. Фрагменты ткани аорты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и делали криосрезы толщиной 10 /jm при ^18°С. Для световой микроскопии криосрезы окрашивали гематоксилином (Г) и эозином (3). Для флуоресцентной микроскопии криосрезы окрашивали ядерным красителем Hoechst 33342 (Н33342) или этидиум бромидом (ЗБ). Микроскопический анализ выполняли на микроскопе Leica DM 4000 или на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5C (Германия).

Анализ жизнеспособности клеток в ткани. Экспресс-анализ жизнеспособности клеток в тканях определяли методом прижизненной флуоресцентной микроскопии с использованием одновременной окраски ткани ядерными красителями ЗБ и Hoechst 33342, описанным ранее[18]. После окрашивания этими красителями ядра живых клеток флуоресцировали синим или зеленым цветом (в зависимости от выбранного светофильтра), а ядра погибших клеток флуоресцировали желтым или оранжевым цветами. Все реагенты и красители, использованные в работе, были закуплены в Sigma (США).

Определение минерализованного кальция. Минерализованный кальций во фрагментах ткани определяли методом атомной абсорбционной спектроскопии. Фрагменты ткани после эксплантации отмывали в течение 4 ч в дистиллированной воде, высушивали в течение 2 ч при 100°С, измеряли сухой вес образцов, растворяли минерализованный кальций в 0,1 Н HCI и затем проводили измерение количества минерализованного кальция в них, используя прибор AAS-5100/Zeeman фирмы Perkin-Elmer. Количество минерализованного кальция оценивали как среднее по образцам, имплантированным разным крысам, М±т, где т — стандартная ошибка. Достоверность отличия средних значений для разных групп оценивали по критерию Стьюдента (Р<0,05)

Результаты

Все животные после операции выживали. В течение трех дней после операции проводилась антибактериальная терапия. Ни одного случая инфекции не было зарегистрировано. Через 4 мес. после операции граф-ты были эксплантированы для анализа.

Прижизненный и гистологический анализ аллографтов клапанов собаки до и после антикальцинозной девитализации Флуоресцентная микроскопия тканевых фрагментов, окрашенных прижизненно ядерными красителями Н33342 и ЗБ, показала, что около 50% клеток в стенках аорты и створках клапанов сердца собаки после криоконсервации оставались живыми. После антикальцинозной девитализации графтов все клетки в них погибали (желто-оранжевая флуоресценция ядер), аналогично тому, что наблюдалось нами ранее после девитализации трансплантатов клапанов сердца свиньи. Тканевая структура нативных аллографтов после криоконсервации не изменялась. Слоистая структура ме-дии аорты была без признаков повреждений.

Антикальцинозная девитализация не изменяла структуру матрикса, количество и морфологию ядер клеток в трансплантатах, в частности, в стенках аорты собаки (рис. 1). В целом гистологическая структура нативных и девитализированных створок клапанов и аорты собаки была аналогична структуре нативных и девитализированных ксенографтов клапанов сердца свиньи (группа 3).

Изучение алло- и ксенографтов после имплантации. Макроскопический анализ графтов после эксплантации показал, что створки были приклеены к аортальной стенке непосредственно (группа 2), либо через фибриновый сгусток (группы 1 и 3). По этой причине мы не смогли адекватно оценить структурные изменения в створках, и анализ проводили только для аортальной стенки графтов. Зксплантированные алло- и ксенографты были эластичными, без существенных отличий от аутогенной ткани.

Гистологический анализ нативных аллографтов (группа 1) после имплантации.

После четырех месяцев имплантации на внутренней поверхности стенок аорты формировалась слабо выраженная неоинтима, а также фибриновые отложения разной степени организации. Иммунный ответ выражался в накоплении иммунных клеток в области интимы (рис. 2А). Выявлялись также процессы деградации около поверхности интимы, в частности диссоциация коллагеновых фибрилл. Медия нативных имплантатов была полностью бесклеточной и, в основном, без видимых изменений структуры тканевого матрикса (рис. 2Б). Вблизи адвентиции выявлялись немногочисленные структурные изменения, включающие замещение ламинарной структуры небольшими фиброзными образованиями. Также отмечались участки инфильтрации лейкоцитами и небольшие разрывы тканевого матрикса вблизи адвентиции (рис. 2В).

Гистологический анализ девитализированных аллографтов (группа 2] после имплантации Через 4 мес. после имплантации наблюдалась хорошо организованная неоинтима по всей поверхности девитализированного аллографта (рис. ЗА). Толщина неоинтимы в девитализированных аллографтах, в сравнении с нативными образцами, была существенно больше. Фибриновых отложений не отмечалось. Интима и медия были бесклеточными, инфильтрация макрофагами не обнаруживалась, и слоистая структура была компактно организована подобно нативным тканям (рис. ЗБ). Признаков повреждения и разрыва матрикса не отмечалось. В зоне адвентиции наблюдалась незначительная инфильтрация фибробластами (рис. ЗВ). Морфологическая картина в области шва была не столь благополучна: наблюдались признаки кальциноза и фиброза, что в целом является типичным для области анастомоза.

Гистологический анализ девитализированных ксенографтов (группа 3) после имплантации Стенки аортально-клапанного комплекса ксенографтов после 4 мес. имплантации в аорту собакам претерпевали значительные структурные изменения в матриксе интимы (рис. 4 А, Б), медии (рис. 4 В, Г) и адвентиции (рис. 4 Д, Е). Слоистая структура коллагеновых волокон, характерная для стенок аорты, практически полностью исчезала. Структура матрикса выглядела аморфной и имела вид фиброзной ткани. Это выявлялось как при окраске гематоксилином и эозином, так и при флуоресцентном анализе криосрезов. Структурная перестройка матрикса указывает на миграцию фибробластов вглубь ткани, они выявлялись во всех участках, как и их неоднородное распределение (рис. 4 А—Е). Эти результаты свидетельствуют о ярко выраженной иммунной реакции на девитализированный ксенотрансплантат. В этой группе также обнаруживалось расслоение стенок аорты (рис. 4 Д—Е). В области шва матрикс имел вид, характерный для раневой области. Структура матрикса была нарушена, области слоистой структуры заменены аморфной соединительной тканью, распределение клеток было неоднородным, встречались области инфильтрации лейкоцитами.

Минерализация алло- и ксенографтов после анти-кальцинозной девитапизации. Оценка минерализованного кальция в эксплантированных алло- и ксе-нотрансплантатах показала значительное отличие между нативными (группа 1) и девитализированны-ми (группа 2 и 3) тканями. Содержание минерализованного кальция в группе нативных аллографтов составляло 0,4+0,3 мг/г сухого веса перед имплантацией и 5,2+0,9 мг/г после имплантации (отличие от девитализированных тканей достоверно, р<0,05), для группы девитализированных аллографтов — 0,7+0,4 мг/г и 1,1+0,6 мг/г соответственно (отличие недостоверно), и для группы девитализирован ответственно (отличие недостоверно). Результаты свидетельствуют об эффективном подавлении минерализации стенок аорты, обработанных методом предымплантационной антикальцинозной девитализации.

Обсуждение

Большинство исследователей, предлагая способы девитализации трансплантатов клапанов сердца, полагают, что эта процедура будет препятствовать кальцинозу и дегенерации, однако часто при этом не приводится убедительных доказательств такого эффекта. Поэтому не удивительно, что даже такие известные способы децеллюларизации, как энзиматическая обработка, гипотонический шок, обработка детергентом додецилсульфатом натрия совершенно не подавляют кальцификацию[16]. Кроме того, отмечается, что предлагаемые способы децеллюларизации могут вызвать повреждение структурных белков тканевого матрикса, что способно приводить к ранней дисфункции трансплантатов[19—22]. Для того, чтобы снизить возможные повреждения тканевого матрикса, мы разработали способ, который основан на использовании ЭДТА и дигитонина. Этот способ индуцирует быструю гибель клеток донора в трансплантатах, но не удаляет погибшие клетки из матрикса[17]. Дигитонин является неполярным детергентом и, связываясь с холестерином плазматической мембраны, нарушает ее целостность. ЭДТА является хелатором кальция, магния и ряда других ионов металлов и использовался нами для подавления накопления кальция и фосфатов в митохондриях в процессе клеточной гибели. Ранее мы предположили, что аккумуляция кальция и фосфатов в митохондриях погибающих клеток играет важную роль в инициации кальцификации[23]. При использовании модели подкожной имплантации крысам с целью изучения кальцификации материалов, была продемонстрирована высокая эффективность предложенного метода для подавления минерализации трансплантатов стенки аорты. В аллотрансплантатах аортально-клапанных комплексов собаки предлагаемая антикальцинозная девитализация также вызывала тотальную гибель клеток без их полного разрушения и удаления. Кроме того, необходимо отметить, что антикальцинозная девитализация аллографтов подавляла их кальцификацию в модели ортотопической имплантации собакам, и это полностью согласуется с результатами, полученными в модели подкожной имплантации крысам.

К сожалению, применение нашей экспериментальной модели не позволяет адекватно оценить изменение створок после имплантации, поскольку в условиях отсутствия пульсирующей разнонаправленной нагрузки они прилипают к стенке аорты. Поэтому мы анализировали аортальную стенку трансплантатов в тех участках, где она не слипалась со створкой. Это позволило сравнить иммунную реакцию на девитали-зированную и нативную ткань стенки аорты алло- и ксенографтов. В результате этих исследований мы установили умеренную иммунную реакцию на аортальную стенку нативного аллографта, содержащего живые клетки. Вблизи поверхности интимы и границы раздела медии и адвентиции наблюдалась значительная инфильтрация лейкоцитов со структурными изменениями матрикса. Обнаруживалось также умеренное формирование неоинтимы на всей поверхности синуса, и фибриновых сгустков — в средней части необработанного аллографта. Интересно, что область медии была бесклеточной, но слоистая структура матрикса при этом выглядела неповрежденной. В целом, эти наблюдения совпадают с результатами работы, в которой отмечается почти полное отсутствие клеточных элементов в эксплантированных у детей и взрослых аллографтах, а также наличие в них Т-лимфоцитов, макрофагов и клеток Лангерганса (дендритных клеток)[24]. Эти данные не согласуются с мнением о том, что жизнеспособность донорских клеток увеличивает длительность функционирования аллографтов[25]. Элиминация клеток в живых аллографтах была обнаружена также и другими исследователями[26].

Девитализированные аортальные аллографты (группа 2) также имели после эксплантации полностью бес-клеточную Т. intima и Т. media. Незначительная инфильтрация фибробластами наблюдалась вблизи границы между центральной зоной аорты — Т. media, и внешней зоной — адвентицией. Неоинтима девитализированных аллографтов была более выражена, чем у живых ал-логенных имплантатов. Структура тканевого матрикса выглядела неповрежденной, без признаков инфильтрации лейкоцитами. Все это указывает на улучшение биосовместимости и уменьшение иммуногенности девитализированных аллографтов в сравнении с живыми аллоимплантатами. Бесклеточная Т. media и нативный тканевый матрикс в имплантированных живых и девитализированных аллографтах указывает на селективное по отношению к матриксу разрушение клеток донора и на отсутствие репопуляции неповрежденного матрикса. Механизм такого разрушения клеток, по-видимому, связан с протеолитической активностью в плазме, тканевой жидкости, и для его понимания требуются дальнейшие исследования. Отсутствие клеток в аллографтах противоречит данным некоторых работ, в которых отмечается успешная репопуляция бескле-точных трансплантатов клетками хозяина[1, 11]. Инициирующая причина такой активной репопуляции остается непонятной. Есть также работы, в которых репопуляция бесклеточных аллографтов не обнаружена[27] и эти результаты совпадают с нашими данными.

В девитализированных ксенографтах аорты после 4 мес. имплантации наблюдалась реорганизация матрикса. Слоистая структура матрикса замещалась аморфной соединительной тканью. В этой ткани обнаруживались клетки, включая скопления лейкоцитов и расположенные поодиночке фибробласты. В центральной зоне и вблизи адвентиции обнаруживались участки расслоения аорты. Эти результаты указывают на сильную иммунную реакцию на трансплантат. Остается неясным, в какой степени эта реакция связана с клетками донора, и какое влияние в этой реакции оказывают элементы тканевого матрикса ксенотрансплан-тата. Тот факт, что девитализированные аллографты не вызывают иммунной реакции, указывает на то, что процедура антикальцинозной двитализации не вызывает имуногенной перестройки матрикса.

Необходимо отметить, что антикальцинозная девитализация подавляла кальциноз не только в аллографтах аорты, но и в ксенографтах. Скорость минерализации в данном случае была намного меньше, чем в модели подкожной имплантации, однако эффект подавления кальциноза после девитализации был достоверным.

Заключение

1. Живые и девитализированные антикальцинозным способом аллографты аорты становятся бесклеточны-ми после 4 мес. имплантации в аорту собаки.

2. Девитализированные антикальцинозным способом аллографты аорты в сравнении с живыми имеют следующие преимущества после 4 мес. имплантации собакам:

— полное отсутствие иммунной реакции;

— отсутствие признаков дегенерации тканевого матрикса;

— подавление кальцификации.

3. Ксенографты аорты после антикальцинозной девитализации вызывают сильный иммунный ответ, который приводит к реорганизации матрикса в неупорядоченную соединительную ткань и общему повреждению матрикса.

4. Аллографты, обработанные антикальцинозным способом, могут быть рекомендованы для клинических испытаний.

Подняться вверх сайта