Поиск Кабинет

Изменения микроструктуры печени после частичной гепатэктомии у крыс

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 101-105

 

Авторы

Газизов И.М., Калигин М.С., Андреева Д.И., Йылмаз Т.С., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Высокая способность печени млекопитающих к реге нерации является одним из излюбленных примеров «ре генеративной медицины». При этом репарация печени не может рассматриваться как обычный процесс гипертро фии органа, а должен иметь определенные закономерные этапы. Знание этих этапов необходимо для правильной интерпретации данных в ходе терапии пациентов с патоло гией печени, в том числе при клеточной терапии. Однако исследования изменений микроструктуры печени в ходе репаративной регенерации крайне малочисленны. Данная работа проведена с целью оценки этих изменений в ходе репаративного процесса после частичной гепатэктомии у крыс. В ходе эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7 сут. после операции оценивали размеры печеночных долек, измеряя межпортальные расстояния, анализировали пролифера цию клеток, участие в регенерации перисинусоидальных клеток, желчных протоков, афферентных и эфферентных сосудов печени, исследуя экспрессию специфических маркеров различных клеточных типов методами иммуно гистохимии. Результаты исследования показали, после ча стичной гепатэктомии изменение микроструктуры печени осуществляется в два этапа: 1) гиперплазия печеночных долек путем пролиферации клеток печени до четвертых суток и 2) деление печеночных долек за счет ветвления желчных протоков, ветвей печеночной артерии, воротной вены и центральных вен с четвертых до седьмых суток.

В течение трехсотлетнего периода изучения пе чени сложились многочисленные концепции, объяс няющие ее структурную организацию. Предположе ния о наличии в печени структурных единиц впервые были высказаны в работах И. Вепфера (1664) и М. Мальпиги (1666), в 1833 г. F. Kiernan описал классическую печеночную дольку[1], в 1906 г. F. Mall охарактеризовал портальную дольку[2], в 1954 г. A. Rappaport описал печеночный ацинус[3], а в 1970 г. E. Bloch была предложена динамичная функциональная единица печени[4]. Все эти кон цепции довольно «искусственны», но, тем не менее, они позволяют лучше понять сложно устроенный, многофункциональный орган. При этом микрострук тура печени – динамична, и, безусловно, меняется в ходе развития и регенерации печени.

Классической моделью изучения регенерации печени является модель частичной гепатэктомии (ЧГ). Она была предложена и выполнена на крысах в 1931 г. G.M. Higgins и R.M. Anderson и позволила установить, что оставшиеся доли восстанавливают массу печени в течение 1–2 нед.[5].

В дальнейшем при изучении регенерации на моде ли ЧГ были описаны кинетика пролиферативного ответа различных клеточных типов[6], последо вательность и уровень вовлечения факторов ро ста, факторов транскрипции, генов, роль гормонов[7], внеклеточного матрикса[8]. Однако, несмо тря на длительное и детальное изучение реге нерации печени после ЧГ, вопрос об изменении морфофункциональных единиц печени до сих пор остается практически неизученным.

Целью нашей работы стала оценка морфологиче ских изменений классической печеночной дольки в ходе репаративной регенерации. Для изучения раз меров печеночных долек мы применяли морфоме трический метод, для изучения элементов порталь ного тракта – иммуногистохимическое исследование с помощью моноклональных антител к различным клеточным типам печени.

Материал и методы

Исследование проводили на белых беспородных крысах-самцах, находящихся на стандартном пище вом рационе вивария центральной научно-исследова тельской лаборатории Казанского ГМУ со свободным доступом к воде. Операция ЧГ (67%) печени прово дилась в условиях операционной под эфирным нар козом по методике, описанной ранее[9]. Удаленные во время операции доли печени взвешивали, фото графировали и использовали в качестве контроля. Эксплантацию органов производили через 1, 2, 3, 5 и 7 сут. после операции, материал помещали в 10% нейтральный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (рН = 7,4) на 24 ч для фиксации, после чего изготавливали гистологические препараты по стандартной методике.

Срезы печени окрашивали иммуногистохимиче ски с коммерческими антителами к ядерному анти гену пролиферирующих клеток (PCNA, клон PC10, DAKO, 1:100), десмину (клон D33, DAKO, 1:30), α-гладкомышечному актину (a-SMA, клон 1A4, DAKO, 1:50), цитокератину 19 (клон ВА17, DAKO, 1:50). Иммуногистохимическая реакция была про ведена стрептавидин-биотиновым методом при помощи визуализационной системы LSAB фирмы DAKO (Дания).

Морфометрические исследования проводили при помощи морфометрической окулярной сетки при увеличении ×400 на микроскопе Leica DM 1000 (Германия). Классическая печеночная долька может быть представлена в виде правильного шестиуголь ника, в центре которого располагается центральная вена, а по углам – портальные тракты. Площадь пра вильного шестиугольника вычислялась по формуле:

где S – площадь шестиугольника, l – длина одной из сторон шестиугольника. Таким образом, для вычисле ния площади печеночных долек мы подставили зна чения межпортальных (порто-портальных) расстоя ний в формулу вычисления площади правильного шестиугольника.

Статистический анализ проводили при помощи графического пакета Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Макроскопическое исследование показало, что восстановление массы оставшихся после ЧГ до лей печени до исходного веса органа (7–10 г) за вершалось к восьмым суткам после операции. При рутинном морфологическом исследовании через сутки после ЧГ мы наблюдали расширение синусо идных капилляров, которое исчезало к четвертым суткам, и стеатоз гепатоцитов, который через 1 сут. после операции можно было охарактеризовать как мелкокапельный, через 3 – крупнокапельный, через 5 – среднекапельный, через 7 – мелкокапельный в единичных гепатоцитах.

Результаты исследования экспрессии PCNA пока зали, что через сутки после операции происходило нарастание числа делящихся гепатоцитов (табл. 1), максимум их пролиферативной активности при ходился на 2 сут. (рис. 1A). В последующем экс прессия PCNA в гепатоцитах уменьшалась, а через 7 сут. была сравнима с контрольными образцами. Среди делящихся гепатоцитов мы обнаружили также PСNA-позитивные синусоидные клетки печени и хо лангиоциты, пик пролиферации которых наблюдали на 3–5 сут. после операции.

Морфометрическое исследование показало, что межпортальные расстояния увеличивались со вторых суток после операции, достигая максимума через трое суток (164,2% по отношению к норме). Далее межпортальные расстояния уменьшались, со ставляя через 7 сут. 108% от контроля (табл. 2). Размеры печеночных долек, находящиеся в прямой зависимости от межпортальных расстояний, увели чивались со вторых суток после частичной гепатэк томии, достигали максимума (269,2% от нормы) че рез трое, а далее постепенно снижались до 116,5% через 7 сут. (см. табл. 1).

Изучение экспрессии десмина показало, что через сутки после операции происходило резкое увеличение числа десмин-позитивных перисинусо идальных клеток, пик их количества мы наблюдали через трое суток (рис. 1Б), но и через 7 сут. чис ло десмин-позитивных перисинусоидальных клеток оставалось выше, чем в контроле (см. табл. 1).

Экспрессия α-SMA была обнаружена только в гладкомышечных клетках стенки сосудов порталь ных трактов, в перисинусоидальных клетках она от сутствовала на всех сроках после операции. Через 5 сут. и, в меньшей степени, через 7 сут. после опе рации мы наблюдали ветвление как афферентных (рис. 1В), так и эфферентных сосудов печеночных долек (рис. 1Г).

Исследование экспрессии цитокератина 19 по казало, что данный маркер в контрольных образ цах печени экспрессировался только в цитоплазме холангиоцитов. В большинстве портальных трактов находилось по 2–3 желчных протока. В экспери ментальных образцах с 3 по 7 сут. после операции мы наблюдали увеличение числа внутрипеченочных желчных протоков. Наибольшее число желчных про токов было отмечено на 5 сут., когда в каждом пор тальном тракте выявлялось 4–6 протоков, а в не которых их число доходило до пятнадцати. На этом сроке мы также наблюдали формирование новых желчных протоков путем ветвления (рис. 1Д).

Таким образом, результаты наших исследований позволили нам установить, что в основе изменений, происходящих с печеночными дольками после ЧГ, лежат пролиферация всех клеточных типов печени и ветвление элементов портального тракта и печеноч ной вены, ведущие к новообразованию печеночных долек путем их деления. Весь этот процесс мы можем разделить на два этапа: 1) гиперплазия печеночных долек, 2) деления печеночных долек (рис. 2).

Гиперплазия печеночных долек достигается пу тем пролиферации клеток печени, которая доста точно подробно описана в литературе, и наше ис следование подтверждает эти данные[6]. Первыми клетками, входящими в пролиферацию являются гепатоциты, их интенсивное деление увеличивает объем паренхимы печени и размер печеночных до лек (табл. 2), что проявляется в увеличении меж портальных расстояний, достигающих максимума через 3 сут. после ЧГ (табл. 2). Следует отметить, что в пролиферации гепатоцитов важную роль игра ют перисинусоидальные клетки. Они уже через сутки после операции усиливают экспрессию дес мина и пролиферируют, вступая в процесс неполной активации и вырабатывая фактор стволовых клеток[10], фактор роста гепатоцитов[11], трансформиру ющий фактор роста-α, что изменяет характер меж клеточных взаимоотношений с гепатоцитами[12] и способствует их делению.

После третьих суток наступает второй этап вос становления печени – деление печеночных долек. Данный процесс инициируется увеличенной функ циональной нагрузкой гипертрофированных пече ночных долек и начинается с пролиферации сину соидных клеток, холангиоцитов и клеток сосудов. Пролиферация холангиоцитов максимальна через 3–5 сут. после ЧГ и сопровождается ветвлением желчных протоков, которое мы выявили при изуче нии экспрессии цитокератина 19. На этом же сроке происходит ветвление ветвей печеночной артерии, воротной и центральной вен. Ветвление элементов портального тракта подтверждается данными мор фометрического анализа межпортальных расстоя ний, которые указывают на то, что через 5 сут. после ЧГ в паренхиме регенерирующей печени происходит уменьшение размеров печеночных долек, которое, видимо, достигается путем их деления. Наша гипо теза о возможности деления печеночных долек пу тем ветвления желчных протоков и сосудов порталь ных трактов в ходе репаративной регенерации также подтверждается результатами исследований с при менением α-нафтилизотиоцианата. В экспериментах с повреждением печени α-нафтилизотиоцианатом было выявлено увеличение пролиферативных про цессов с последующим ветвлением элементов пор тального тракта[13]. Также следует отметить, что интенсивное ветвление и рост сосудов печени в дли ну показаны при исследовании органогенеза печени, когда с 5 по 7 нед. гестации объем печени увели чивается в 100 раз и сосуды печени, адаптируясь к возрастающим функциональным нагрузкам, вынуж дены претерпевать значительные изменения[14]. Подводя итог, можно сделать вывод, что во взрос лой печени крыс в ходе репаративной регенерации после ЧГ происходят изменения микроструктуры, заключающиеся в последовательной гиперплазии и делении печеночных долек, которое в целом напо минает процессы, происходящие в ходе органогенеза печени.

Подняться вверх сайта