Поиск Кабинет

Изменения ангиогенных свойств ММСК жировой ткани с возрастом у больных ишемической болезнью сердца

Гены & Клетки: Том VII, №4, 2012 год, стр.: 73-82

 

Авторы

Ефименко А.Ю., Джояшвили Н.А., Калинина Н.И., Кочегура Т.Н., Акчурин Р.С., Ткачук В.А., Парфенова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани (ММСК-ЖТ) способны стимулировать ангиогенез посредством продукции факторов роста и стабилизации формирующихся сосудов, поэтому являются перспективным материалом для аутологичной клеточной терапии заболеваний ишемического генеза. Однако с возрастом пациентов функциональная активность ММСК-ЖТ, а, следовательно, и эффективность клеточной терапии могут снижаться. Целью нашей работы было определить изменения ангиогенных свойств ММСК-ЖТ больных ишемической болезнью сердца (ИБС) при старении.

ММСК были выделены из подкожной жировой ткани пациентов с ИБС (n=64, возраст 43-77 лет). Иммунофенотип клеток был определен с помощью проточной цитофлуорометрии: CD90+/CD73+/CD105+/CD45-/CD31- – для всех образцов, и была подтверждена мультипотентность клеток путем индукции адипогенной и остеогенной дифференцировки. Кондиционированная среда ММСК-ЖТ стимулировала образование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками (линия EA.hy926), и этот эффект уменьшался с возрастом пациентов. Мы не обнаружили связанных с возрастом изменений содержания мРНК ангиогенных факторов в ММСК-ЖТ. Однако содержание проангиогенных факторов роста, таких как фактор роста эндотелия сосудов, плацентарный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, ангиопоэтин-1 и ангиогенин в кондиционированной среде ММСК-ЖТ, оцененное с помощью метода ELISA, было значимо ниже для пожилых больных по сравнению с более молодыми пациентами, в то время как уровень антиангиогенных факторов (тромбоспондина-1 и эндостатина) существенно не менялся с возрастом пациентов.

Таким образом, при старении ангиогенные свойства ММСК-ЖТ ухудшаются в результате снижения секреции ключевых ангиогенных факторов. Полученные результаты раскрывают механизмы снижения терапевтического потенциала ММСК-ЖТ с возрастом и обосновывают необходимость разработки методов повышения терапевтических свойств этих клеток, направленных на увеличение их паракринной активности.

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемическая болезнь сердца (ИБС), занимают первое место в структуре причин смертности в большинстве стран, несмотря на значительный прогресс в развитии медикаментозных методов лечения и хирургической и эндоваскулярной реваскуляризации. Одним из перспективных подходов к их лечению является терапевтический ангиогенез, основанный на введении в ишемизированные ткани генетических конструкций с генами факторов роста или стволовых/прогениторных клеток. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), выделенные из костного мозга или жировой ткани (ММСК-ЖТ), считаются перспективным инструментом для терапевтического ангиогенеза благодаря своей способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в частности путем секреции ангиогенных факторов роста. Причем ММСК-ЖТ, обладающие теми же свойствами, что и ММСК костного мозга, значительно легче получить в достаточно большом количестве при малоинвазивной процедуре ограниченной липосакции [1, 2]. На моделях ишемии конечностей и миокарда у животных нами и другими авторами показано, что локальное и системное введение ММСК-ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением и улучшению перфузии тканей кровью [3–12]. Восстановление кровотока в ишемизированной ткани при трансплантации ММСК-ЖТ обусловлено несколькими механизмами. Во-первых, эти клетки секретируют широкий набор ангиогенных факторов роста, которые способствуют миграции и пролиферации эндотелиальных клеток и их предшественников, а также формированию новых сосудов [6, 9, 12–14]. Во-вторых, ММСК-ЖТ секретируют активаторы плазминогена и матриксные протеазы, что способствует локальному разрушению внеклеточного матрикса и миграции клеток, участвующих в образовании сосудистой стенки, а также высвобождению связанных с матриксом ангиогенных факторов [15]. В-третьих, ММСК-ЖТ могут дифференцироваться в гладкомышечные и эндотелиальные клетки, встраивающиеся в растущие сосуды, а также стабилизировать вновь образованные сосуды, выполняя функцию перицитов [7, 16–18]. Это согласуется с данными, демонстрирующими, что во всех тканях организма ММСК являются компонентами сосудистой стенки и, по-видимому, играют важную роль в развитии и поддержании сосудистой сети как в норме, так и при патологическом ремоделировании тканей [19].

Хотя ММСК-ЖТ уже используются в различных фазах клинических исследований по клеточной терапии заболеваний ишемического генеза, в том числе ИБС [1, 20–22], их свойства у больных с этими заболеваниями практически не изучены. Подавляющее большинство результатов, касающихся ангиогенных и регенеративных свойств ММСК-ЖТ человека, получено на клетках, выделенных из жировой ткани относительно здоровых молодых доноров. В то же время известно, что старение и само заболевание может оказывать негативное влияние на состояние ММСК [23–27]. В единичных работах показано, что при старении снижается пролиферативный потенциал ММСК-ЖТ и их способность к дифференцировке [28, 29], а также ухудшаются их ангиогенные свойства [29, 30]. Поскольку ММСК входят в состав сосудистой стенки и принимают участие в процессах ее репарации при повреждении, изменения, происходящие с ними при старении, могут являться важным патогенетическим фактором заболеваний, ассоциированных с возрастом, включая атеросклероз, сахарный диабет и гипертоническую болезнь. Изменения свойств ММСК, в том числе их способности стимулировать рост сосудов, могут снижать эффективность аутологической клеточной терапии у пациентов с ИБС или хронической ишемией нижней конечностей, с тяжелым диффузным поражением сосудистого русла, в возрасте, как правило, старше 60 лет, являющихся наиболее вероятными кандидатами для клеточной терапии. Для повышения эффективности клеточной терапии собственными клетками пациента, а также для разработки методов стимуляции эндогенных регенеративных процессов необходимо изучение молекулярных механизмов, обусловливающих снижение терапевтических свойств клеток, в частности, их способности стимулировать васкуляризацию ишемизированных тканей. Таким образом, целью нашей работы было оценить, как изменяются с возрастом ангиогенные свойства ММСК-ЖТ пациентов с ИБС.

Материал и методы

Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование

В исследование были включены 64 пациента с ишемической болезнью сердца, стенозирующим коронарным атеросклерозом, по данным коронароангиографии, стабильной стенокардией II-IV функционального класса (по классификации Канадского общества по изучению сердечно-сосудистых заболеваний), которым проводилось аортокоронарное шунтирование в Отделе сердечно-сосудистой хирургии Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК МЗ РФ (рук. академик РАМН Р.С. Акчурин). В ходе операции у них были выделены образцы подкожной жировой ткани. Все исследования, связанные с образцами жировой ткани, выполнялись на основании разрешения Этического комитета ФГБУ РКНПК МЗ РФ, и все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на выделение и использование в научных целях образцов жировой ткани.

Критериями невключения являлись: наличие аутоиммунных патологий; наличие злокачественных новообразований, в том числе в анамнезе; наличие острых или хронических воспалительных заболеваний; декомпенсированный сахарный диабет (HbA1c ≥8%); длительная гормональная или антибактериальная терапия; анемия (гемоглобин ≤10 г/дл) и гематологические заболевания; острые нарушения мозгового кровообращения в предшествующие 12 мес.

Пациенты были разделены на подгруппы по возрасту, согласно классификации ВОЗ (1963). Основные клинико-анамнестические характеристики подгрупп представлены в таблице 1.

Выделение и культивирование ММСК-ЖТ

Выделение ММСК из подкожной жировой ткани проводили с помощью ферментативной обработки [31]. Выделенные клетки высаживали на чашки Петри в концентрации 5×104/см3 и инкубировали при 37°С, 5% СО2. На следующий день в чашках меняли среду. Выход клеток при использованном нами методе выделения составлял 4–7×104 прикрепившихся клеток на 1 мл ткани. Полученные клетки выращивали на стандартном культуральном пластике (Corning Costar, США) в СО2 – инкубаторе (5% СО2; 95% воздуха; 37°С), используя среду, поддерживающую рост недифференцированных мезенхимальных прогениторных клеток – Advance Stem Cell Basal Medium (HyClone, США), содержащую 10% смеси факторов роста – Advance Stem Cell Growth Supplement (HyClone, США), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина/фунгизона (HyClone, США). При достижении 70–80% конфлуентности монослоя клетки рассаживали в соотношении 1:3 с использованием 0,25% раствора трипсина/0,02% ЭДТА. Для получения кондиционированной среды клетки 2 пассажа в течение 24 ч депривировали в среде роста, не содержащей сыворотку, затем меняли среду на свежую, также не содержащую сыворотку, и культивировали клетки в течение 48 ч. Затем среду собирали, центрифугировали при 200g 5 мин, добавляли коктейль ингибиторов протеаз (1:500, Sigma, кат. № Р1860), аликвоты по 1,5 мл замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Характеристика ММСК-ЖТ

Чтобы оценить содержание ММСК в клеточной популяции, культуры 2 пассажа иммунофенотипировали антителами к CD14 (eBioscience, США), CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, PDGFRB (BD Pharmingen, США) и NG2 (Chemicon, США), конъюгированными с различными флуорохромами, и оценивали с помощью проточного сортера клеток MoFlo (Dako Cytomation, Дания).

Для анализа способности к адипогенной и остеогенной дифференцировке ММСК-ЖТ культивировали в индукционных средах, используя наборы реагентов (Invitrogen, США) по методике, приложенной к набору. В качестве отрицательного контроля использовали фибробласты кожи и ММСК-ЖТ того же пациента, культивируемые в обычной среде роста.

Анализ экспрессии генов ангиогенных факторов ММСК-ЖТ

Содержание мРНК исследуемых факторов, участвующих в регуляции ангиогенеза, проводили методом ПЦР в реальном времени. Для этого из клеток выделяли РНК при помощи набора реагентов RNeasy Miny Kit (QIAGEN, США), затем на матрице РНК строили кДНК, используя набор Fermentas Reverse Transcription Reagents (Fermentas, Литва). Далее проводили ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green І (Евроген, Россия) и подобранных праймеров (табл. 2) в амплификаторе BIO-RAD iQ5 Multicolor Real-time PCR detection system (Bio-rad, США). Данные для каждого образца нормировали по экспрессии генов l7, b-actin и gapdh.

Анализ содержания факторов роста в кондиционированной среде

Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), плацентарного фактора роста (PlGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), ангиопоэтина-1 (ANGPT1), ангиогенина (ANG), тромбоспондина-1 (TНBS1) и эндостатина (ENDS) в среде культивирования ММСК-ЖТ оценивали с помощью наборов реагентов для иммуноферментного анализа (ELISA) компании R&D Systems (США). Уровень поглощения раствора в лунках определяли при длине волны 450 нм с корректировкой при 620 нм. Полученные значения концентрации исследуемого белка в образцах кондиционированных сред нормировали на количество клеток.

Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле

Ангиогенную активность суммарных продуктов секреции ММСК-ЖТ в среде культивирования оценивали с помощью методики образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками линии EA.hy926 на Матригеле, обедненном факторами роста (Growth factors reduced Matrigel, BD Biosciences) [32] в присутствии кондиционированной среды ММСК-ЖТ. В качестве отрицательного контроля использовали среду роста эндотелиальных клеток, не содержащую сыворотку, в качестве положительного контроля – среду роста эндотелиальных клеток, содержащую 20% сыворотки. Суммарную длину образованных трубчатых структур в 5 случайно выбранных полях зрения в лунке подсчитывали на изображениях, полученных при использовании объектива ×10 с помощью программы MetaMorph 5.0 (Universal Imaging).

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов и графическое представление данных производили с использованием пакетов статистических программ SigmaStat 9.0 и Statistica 6.0. При подтверждении нормальности распределения признака методами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилксона для сравнения двух независимых групп использовали t-критерий Стьюдента, для анализа данных в нескольких независимых группах – метод ANOVA, в случаях малочисленных выборок (n<10) и распределений, отличных от нормального, для тех же целей использовали U-критерий Манна – Уитни и ANOVA по методу Крускал – Уоллиса, соответственно. Для сравнения распределений порядковых и номинальных признаков применяли тест χ2. Корреляционный анализ проводили с использованием метода Пирсона для нормально распределенных выборок и метода Спирмена – в остальных случаях. Для оценки тесноты связи по значению коэффициента корреляции использовали шкалу Чеддока. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p < 0,05. Данные в тексте и на графиках представлены в виде среднее±стандартное отклонение (SD) или как медиана (25-й и 75-й процентили), если не указано иначе.

Результаты

Характеристика ММСК-ЖТ, полученных от пациентов с ИБС разного возраста

Клетки, выделенные из жировой ткани с помощью ферментативной обработки, представляли собой смешанную популяцию различных клеточных типов, однако при культивировании в среде, поддерживающей рост недифференцированных ММСК, ко 2 пассажу в культуре оставались клетки, имеющие фибробластоподобную морфологию. Заметных различий в части морфологии клеток, полученных от пациентов разных возрастных групп, выявлено не было.

Анализ иммунофенотипа культивированных до 2 пассажа ММСК-ЖТ с помощью метода проточной цитофлуориметрии показал, что эти клетки экспрессируют мезенхимальные маркеры CD73 (>85%), CD90 (>95%) и CD105 (>99%) в сочетании со сниженной продукцией CD14 (<10%), CD19 (<10%), CD34(<5%), CD45 (<2%), CD79 (<10%). Такой профиль экспрессии является типичным для ММСК, согласно определению Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy Statement) [33]. ММСК-ЖТ также экспрессируют маркеры, характерные для перицитов, такие как NG2 (>99%) и PDGFRB (>80%). Доля клеток, «несущих» мезенхимальные маркеры, была одинаковой в разных возрастных группах (табл. 3).

Одной из определяющих характеристик ММСК является их мультипотентность, т.е. способность к направленной дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях [7, 29, 31]. Мы культивировали выборочные образцы клеток в соответствующих индукционных средах и показали, что ММСК-ЖТ и молодых, и пожилых пациентов способны к адипогенной и остеогенной дифференцировке.

Изменение ангиогенной активности ММСК-ЖТ с возрастом

Способность ММСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов обусловлена в значительной степени продукцией ими широкого набора ангиогенных факторов [4–9, 12–14]. Учитывая это, мы проанализировали ангиогенную активность суммарных продуктов секреции клеток в среду культивирования на модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле in vitro. Было обнаружено, что способность кондиционированной среды ММСК-ЖТ стимулировать образование тубулярных структур снижается с возрастом, что выражалось в обратной корреляции между общей длиной тубулярных структур и возрастом пациентов (r = -0,38, p = 0,02). Кондиционированная среда клеток, выделенных из жировой ткани пациентов старшего возраста (старше 60 лет), стимулировала образование тубулярных структур в достоверно меньшей степени, чем среда клеток, полученных от более молодых пациентов (рис. 1).

Для того чтобы установить, изменение продукции каких именно ангиогенных факторов лежит в основе снижения ангиогенной активности ММСК-ЖТ пациентов старшего возраста, мы оценили содержание проангиогенных (VEGF, PlGF, HGF, Angpt1 и ANG) и антиангиогенных (THBS1 и ENDS) факторов в кондиционированных средах ММСК-ЖТ пациентов разного возраста (табл. 4).

Мы обнаружили, что средние значения содержания ангиогенных факторов в среде культивирования ММСК-ЖТ были в несколько раз ниже в старших возрастных группах, чем в более молодых, статистически значимые различия наблюдали для VEGF, HGF и ANG, достоверных различий для остальных факторов из-за выраженного разброса показателей не было получено. Корреляционный анализ показал наличие достоверных обратных связей между содержанием проангиогенных факторов VEGF, PlGF, HGF и ANG в кондиционированной среде ММСК-ЖТ и возрастом пациентов (см. табл. 4; рис. 1А–Д). В то же время содержание антиангиогенных факторов (THBS1 и ENDS) в кондиционированной среде ММСК-ЖТ менялось с возрастом незначительно (рис. 3В-Г).

Следует отметить, что ангиогенная активность суммарных продуктов секреции ММСК-ЖТ в среде культивирования сильнее всего коррелировала с содержанием ангиогенина (r = 0,66, p = 0,05), ангиопоэтина-1 (r = 0,77, p < 0,0001) и HGF (r = 0,65, p < 0,0001), но несколько слабее с уровнем VEGF (r = 0,51, p < 0,0001), что указывает на существенный вклад уровня продукции этих ангиогенных факторов на выраженность ангиогенной активности ММСК-ЖТ.

Чтобы выявить механизмы снижения секреции ангиогенных факторов ММСК-ЖТ, мы проанализировали содержание мРНК генов основных регуляторов ангиогенеза в клетках пациентов разных возрастных групп. Мы наблюдали статистически значимое снижение содержания мРНК PlGF в ММСК-ЖТ пациентов старшего возраста (рис. 2Е), в то время как содержание мРНК других про- и антиангиогенных факторов (рис. 3А–Б) с возрастом изменялось незначительно, что позволяет предполагать наличие посттрансляционных механизмов снижения секреции проангиогенных факторов ММСК-ЖТ при старении организма.

Таким образом, снижение при старении продукции основных проангиогенных факторов (VEGF, PlGF, HGF, Angpt1, ангиогенина) может лежать в основе ухудшения ангиогенных свойств ММСК-ЖТ пожилых пациентов.

Обсуждение

Стволовые клетки опосредуют физиологическое обновление и регенерацию тканей организма в течение всей жизни. Возможно, что снижение способности организма к регенерации с возрастом обусловлено влиянием старения на активность стволовых и прогениторных клеток. Подавление функциональной активности клеток-предшественниц при старении может быть обусловлено несколькими механизмами, включая укорочение длины теломер и снижение активности теломеразы [34], уменьшение пролиферационного потенциала, ослабление антиоксидантной защиты клеток и (или) увеличение оксидативного стресса [35], необратимую модификацию белков, а также нарушение репарации геномной ДНК и изменение паттерна ее метилирования. Следует учитывать, что описанные механизмы отражают процессы «внутреннего» старения клеток, в то время как даже большее значение, по современным представлениям, может иметь воздействие измененного при старении микроокружения прогениторных клеток. Так, в работе Y. Sun с соавт. (2011) показано, что ММСК от старых животных восстанавливают способность к самообновлению и остеогенезу при культивировании на внеклеточном матриксе, синтезированном клетками молодых животных [27]. Аналогичным образом эндотелиальные предшественники, выделенные из крови старых крыс, восстанавливают свои функции in vitro и in vivo после культивирования в присутствии сыворотки крови молодых животных [28].

Влияние старения организма на ММСК хорошо изучено на клетках костного мозга. Так, многие авторы показали снижение количества ММСК в аспирате костного мозга с возрастом [26, 36, 37], снижение пролиферации и потенциала к дифференцировке в различных направлениях ММСК пожилых пациентов [23, 24, 27]. A. Wilson с соавт. (2010) выявили более 8000 генов, по-разному экспрессирующихся в ММСК костного мозга мышей в возрасте 2, 8 и 26 мес. [38].

Опубликованы отдельные данные, касающиеся влияния возраста на количество и свойства ММСК-ЖТ. В большинстве работ показано, что количество ММСК в жировой ткани, оцененное с помощью проточной цитофлуорометрии, не уменьшается с возрастом [39, 40], однако их клоногенность, пролиферативный потенциал [29, 41, 42], способность к дифференцировке [28, 39, 43] и продукции VEGF [30] снижаются при старении.

Ранее нами было показано, что в ММСК-ЖТ жировой ткани старых мышей происходят изменения, характерные для стареющих клеток: укорочение теломер, снижение скорости пролиферации, усиление оксидативного стресса, и ухудшается их способность стимулировать рост кровеносных сосудов на моделях in vitro и in vivo [44, 45]. В настоящей работе мы проанализировали, как изменяются с возрастом ангиогенные свойства ММСК-ЖТ пациентов с ИБС – одних из наиболее вероятных кандидатов для клеточной терапии аутогенными клетками.

По экспрессии основных маркеров ММСК, принятых Международным обществом клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy) [33], а также маркеров, характерных для перицитов (NG2 и PDGFRB), культивированные ММСК-ЖТ пациентов разного возраста не различались, что может свидетельствовать в пользу того, что с возрастом доля ММСК в жировой ткани не снижается.

Для оценки ангиогенной активности суммарных продуктов секреции ММСК-ЖТ мы анализировали формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками в присутствии кондиционированной среды ММСК-ЖТ и обнаружили, что кондиционированная среда ММСК-ЖТ пожилых пациентов хуже стимулирует образование тубулярных структур эндотелиальными клетками, чем среда ММСК-ЖТ более молодых пациентов. Схожие результаты были получены нами ранее при сравнении ММСК-ЖТ, полученных от мышей разных возрастных групп [44, 45], что подтверждает, что этот эффект, по-видимому, связан именно с возрастом пациентов.

Секреция паракринных факторов является основным, хотя и не единственным механизмом ангиогенного и регенеративного эффекта ММСК-ЖТ [3–9, 13, 14, 21]. Роль конкретных факторов, секретируемых ММСК-ЖТ, в паракринных эффектах клеток изучена мало. В одном из исследований было определено, что антиапоптотический эффект ММСК-ЖТ на неонатальные кардиомиоциты на 62,5% обусловлен действием инсулинового фактора роста (IGF-1), а на 34,2% – действием VEGF [46]. В работе L. Cai с соавт. (2007) с помощью стабильного подавления HGF shRNA было показано, что продукция HGF ММСК-ЖТ является принципиально важной для реализации их способности восстанавливать васкуляризацию ишемизированной ткани [47]. Мы показали, что секреция важнейших проангиогенных факторов – VEGF, PlGF, HGF, ангиопоэтина-1 и ангиогенина ММСК-ЖТ, полученными от больных ИБС, снижается с возрастом. Однако содержание мРНК ангиогенных факторов в клетках, за исключением PlGF, меняется с возрастом незначительно, что позволяет предполагать наличие посттрансляционных механизмов снижения секреции проангиогенных факторов ММСК-ЖТ человека при старении.

Снижение продукции VEGF ММСК-ЖТ было продемонстрировано в уже упоминавшейся работе S. El-Ftesi c соавт. (2009) [30]. Более выраженная экспрессия VEGF была показана для ММСК костного мозга молодых крыс по сравнению с клетками старых животных [48]. Снижение экспрессии VEGF и увеличение экспрессии антиангиогенного фактора TBS2 с возрастом наблюдались в ММСК мышей в возрасте 24 мес. по сравнению с 6-мес. животными [49]. Мы впервые показали, что секреция ММСК-ЖТ не только VEGF, но и целого комплекса проангиогенных факторов роста снижается при старении.

Самую сильную связь с ангиогенной активностью ММСК-ЖТ мы наблюдали для содержания в кондиционированной среде ANG и Angpt1. ANG относится к семейству рибонуклеаз со специальными биологическими функциями и обладает проангиогенной активностью. Связывание ANG с актином и последующее открепление образовавшегося комплекса играет важную роль в индуцируемой им инвазии эндотелиальных и гладкомышечных клеток путем активации клеточноассоциированных протеаз [50]. ANG также стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток и способствует образованию тубулярных структур in vitro [51], что подтверждают наши данные.

Angpt1 принципиально важен для ангиогенеза как в норме, так и при патологии, поскольку он регулирует стабилизацию кровеносных сосудов и обеспечивает формирование стабильной, зрелой сосудистой сети. Как и остальные ангиопоэтины, он связывается с Tie2 рецептором, что является необходимым для ветвления образующихся сосудов, их ремоделирования и стабилизации [52, 53]. В отсутствие Angpt1 под действием VEGF образуются незрелые сосуды с высокой проницаемостью, в то время как совместная экспрессия этих двух факторов приводит к формированию полноценных сосудов [54]. На животных моделях ишемии было показано, что Angpt1 увеличивает количество сосудистых коллатералей [55]. Таким образом, способность ММСК-ЖТ секретировать не только VEGF, но и другие факторы, такие как Angpt1, ANG и др., обусловливает их ангиогенную активность, а с возрастом происходит снижение продукции этих факторов, что приводит к ухудшению ангиогенных свойств ММСК-ЖТ.

Ассоциированное с возрастом пациентов снижение ангиогенной активности ММСК-ЖТ может быть обусловлено усилением продукции антиангиогенных факторов клетками пожилых пациентов. Выраженным антиангиогенным действием обладает эндостатин, представляющий собой биологически активный С-концевой фрагмент коллагена XVIII, существенно модулирующий паттерн генной экспрессии эндотелиальных клеток и подавляющий их пролиферацию [56]. Другой фактор – THBS1 – является матриксным белком, постоянно экспрессирующимся в ММСК человека и являющимся аутокринным фактором для сосудистых гладкомышечных клеток. THBS1 напрямую подавляет миграцию, пролиферацию, выживаемость и апоптоз эндотелиальных клеток, в том числе за счет антагонизма с VEGF [57]. Было показано, что содержание мРНК THВS1 повышено в фибробластах от 24-мес. крыс по сравнению с 3-мес. [58]. Однако мы не обнаружили значимой зависимости между продукцией антиангиогенных факторов (THBS1 и ENDS) ММСК-ЖТ и возрастом пациентов с ИБС.

Заключение

Использование аутогенных ММСК-ЖТ открывает широкие перспективы для разработки новых методов лечения заболеваний ишемического генеза, благодаря их способности стимулировать рост кровеносных сосудов, в основном путем продукции ангиогенных факторов роста и цитокинов. Однако в нашей работе показано, что возраст пациентов может оказывать значительное влияние на ангиогенные свойства ММСК-ЖТ, в том числе у больных ИБС. Мы установили, что ММСК, выделенные из жировой ткани пожилых пациентов с ИБС, несмотря на сохранение иммунофенотипа, свойственного ММСК, и мультипотентности, секретируют меньше проангиогенных факторов, чем клетки пациентов молодого и среднего возраста, что подтверждается на модели образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками на Матригеле. Это накладывает определенные ограничения на применение аутологичных клеточных препаратов у пожилых пациентов, которые составляют самую большую когорту среди кандидатов на проведение клеточной терапии заболеваний ишемического генеза. Кроме того, полученные нами результаты и значительный разброс данных между пациентами по ангиогенным свойствам ММСК-ЖТ указывают на необходимость тестирования пригодности аутогенных клеток стимулировать рост кровеносных сосудов, а также актуальность разработки методов предтрансплантационной подготовки ММСК-ЖТ пожилых пациентов, способствующих усилению ангиогенных свойств клеток. К таким методам можно отнести гипоксическое прекондиционирование, эффективность которого была продемонстрирована нами ранее[44], а также генетическую модификацию ММСК-ЖТ конструкциями,несущими гены факторов роста [28, 59], продукция которых снижена у пожилых больных.

Подняться вверх сайта