Поиск Кабинет

Исследование пленочных матриксов из резорбируемых полигидроксиалканоатов различного химического состава in vivo: реакция тканей и кинетика биоразрушения

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 73-80

 

Авторы

Шишацкая Е.И., Николаева Е.Д., Горева А.В., Бригкхам К.Д., Волова Т.Г., Синкси Э.Д.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследовано «семейство» пленочных матриксов, изготовленных из разрушаемых полигидроксиалканоатов, различного химического состава. Независимо от состава матриксов и длительности контакта с внутренней средой организма, не наблюдали отклонений в поведении животных, их росте и развитии, а также функции крови. Реакция тканей на полигидроксиалканоаты (ПГА) всех типов в целом сопоставима с реакцией на полилактид, но существенно менее выражена на ранних сроках после имплантации. Ответ тканей на имплантацию ПГА всех типов характеризуется непродолжительным (до 2 нед) посттравматическим воспалением с образованием на 30–60 сут. фиброзных капсул толщиной менее 100 мкм, которые в сроки 180 сут. в ходе обратного развития истончаются до 40–60 мкм. Различий в реакциях на матриксы из гомополимера 3-гидроксимасляной кислоты (П3ГБ), сополимеров 3-гидроксимасляной и 4-гидроксимасляной кислот (П3ГБ/4ГБ), 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот (П3ГБ/3ГВ), 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот (П3ГБ/3ГГ) на уровне тканей и целого организма не выявлено. В реакции тканей на исследованные ПГА активное участие принимают макрофаги и гигантские клетки инородных тел. Наиболее активно разрушаемыми ПГА определены матриксы из сополимеров, содержащие 3-гидркосигексаноат и 4 гидроксибутират. Следующими и более медленно разрушаемыми были матриксы из сополимера П3ГБ/3ГВ, и самыми устойчивыми – матриксы из П3ГБ. Более медленная разрушаемость ПГА матриксов сопровождалась более поздним развитием гиганто-клеточной реакции. По разрушаемости исследуемые матриксы из ПГА находятся в ряду: П3ГБ/3ГГ – П3ГБ/4ГБ – П3ГБ/ГВ – П3ГБ.

Освоение новых биосовместимых материалов, необходимых для современных реконструктивных медико-биологических технологий, является актуальной проблемой биотехнологии. Активно развиваемый в настоящее время новейший подход – создание «биоискусственных» тканей и органов, развитие которого делает необходимой разработку новых функциональных материалов [1, 2]. Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) – биосовметимых резорбируемых полиэфиров микробиологического происхождения, явилось значимым событием для биотехнологии новых материалов. Особо ценным в ПГА является возможность синтеза полимеров различного состава, образованных мономерами с различной длиной С-цепи. В зависимости от соотношения мономеров базовые свойства ПГА могут изменяться в достаточно широких пределах [3–5]. Однако наличие в ПГА, помимо гидроксимасляной кислоты, которая является естественным метаболитом клеток высших животных и человека [6], других мономеров, делает необходимым проверку биосовместимости материала в полном объеме. Нельзя не отметить при этом, что для подтверждения биосовместимости новых материалов и изучения закономерностей взаимодействия с организмом in vivo на этапе доклинических исследований необходимы длительные и сложные эксперименты на лабораторных животных. Однако опубликованные результаты медико-биологических исследований сополимерных ПГА весьма отрывочны. Особенно мало информации и результатов исследования ПГА, выполненных на животных. В доступной литературе представлены единичные работы этого плана. В работе X.-H. Qu с соавт. (2006) в сравнительном аспекте исследована реакция тканей на подкожную имплантацию полимера молочной кислоты (ПМК), поли-3-гидркосибутирата (П3ГБ) и сополимеров 3-гидрксибутирата с 3-гидркосигексаноатом (П3ГБ/3ГГ). Тканевая реакция на имплантацию включала двухнедельный воспалительный ответ, который был более выраженным в месте имплантации ПМК и П3ГБ [7]. В работе J. Zhou с соавт. (2010) авторы исследовали тканевую реакцию на имплантаты из сополимера П3ГБ/3ГГ. Характер тканевой реакции был несколько отличным от предыдущей работы. В целом, отмечая отсутствие неблагоприятных реакций в виде нагноения, отторжения и некрозов на сроках до 2 нед. после операции, показана высокая плотность в окружающих тканях клеток воспалительного ряда при имплантации П3ГБ/3ГГ [8]. В работе T.H. Ying с соавт. (2008) изучены биорезорбция и тканевый ответ на подкожную имплантацию матриксов из нетканого волокна, сформированного ультратонкими волокнами из гомополимера П3ГБ, сополимеров П3ГБ/3ГГ и П3ГБ/4ГБ [9]. Отмечено, что сополимер П3ГБ/4ГБ через 4 нед. разрушился и присутствовал в виде мелких фрагментов, вокруг которых сформировалась тонкая фиброзная капсула; через 12 нед. капсула истончилась, клетки воспаления не определялись. Эта картина аналогична наблюдаемой другими авторами [10–12] в ходе изучения реакции тканей на имплантацию П4ГБ. Однако, оценивая тканевую реакцию на другие типы ПГА (П3ГБ/3ГГ и П3ГБ/4ГБ), авторы отметили, что снижения количества клеток воспалительного ряда не наблюдали. Как результат воспаления вокруг этих имплантатов сформировалась фиброзная капсула, а вокруг медленно разрушающегося имплантата из П3ГБ количество макрофагов продолжало возрастать на сроке 12 нед., что привело к формированию плотной фиброзной капсулы. Эти немногочисленные работы не дают исчерпывающего ответа на вопрос о характере взаимодействия полимерных изделий из ПГА различного химического состава с тканями, силе и длительности реакции тканей на инородное тело и клеточной реакции на имплантаты.

В серии работ Института биофизики СО РАН в сравнительном аспекте исследована биологическая совместимость двух типов ПГА (гомогенного П3ГБ и сополимеров П3ГБ/3ГВ) в виде шовных волокон, имплантированных внутримышечно [13–15], объемных имплантатов для замещения модельных дефектов костной ткани [16, 17] и микрочастиц, которые были имплантированы лабораторным животным внутримышечно [18, 19], распределены в тканях внутренних органов при внутривенном введении [20, 21]. Не обнаружено негативного влияния исследованных типов ПГА на общее самочувствие и развитие животных, систему периферической крови, биохимические показатели крови, ткани в местах имплантации. Важно отметить, что оба типа ПГА показали высокую биосовместимость и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медицинского назначения [22, 23]. В нашей недавней работе биологически совместимые 5 типов ПГА: гомополимер 3-гидроксимасляной кислоты, сополимеры 3-гидроксимасляной и 4-гидроксимасляной кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксивалериановой кислот, 3-гидроксимасляной и 3-гидроксигексановой кислот – были исследованы в культуре фибробластов мыши линии NIH 3T3 [24]. По результатам окрашивания культивируемых клеток флуоресцентным зондом на ДНК DAPI и в МТТ-тесте показано, что все представленные типы ПГА не проявляют цитотоксичности при прямом контакте с клетками, обладают высокой биосовместимостью; по адгезивным свойствам и способности поддерживать пролиферацию фибробластов сопоставимы с полистиролом и превосходят ПМК.

Цель настоящей работы – исследование биологической совместимости и динамики биоразрушения пленочных матриксов из ПГА различного химического состава при имплантации лабораторным животным на срок 180 сут.

Материал и методы

Матриксы получены из растворов высокоочищенных ПГА различного химического состав: гомополимер 3-полигидроксибутират (П3ГБ), и сополимеры 3-гидроксибутирата и 3-гидроксивалерата (П3ГБ/3ГВ) с включением 3ГВ от 8,6 до 27,6 мол. %, 3-гидроксибутирата и 3-гидроксигексаноата (П3ГБ/3ГГ) с включением 3ГГ 7 и 18 мол. %, 3-гидроксибутирата и 4-гидроксибутирата (П3ГБ/4ГБ) с включением 4ГБ от 8,7 до 24,3 мол. %. Процедура получения образцов, их характеристики и способы изготовления пленочных матриксов нами подробно описаны ранее [24]. Характеристика матриксов представлена в табл. 1.

Для исследования реакции организма, реакции крови и местной реакции тканей, а также динамики биоразрушения полимерные пленочные матриксы были имплантированы половозрелым крысам линии Вистар (самки массой 180–200 г) на срок 180 сут. Общее число животных 105, по 15 в каждой группе. Распределение животных по группам было следующим: 5 экспериментальных групп (матриксы из ПГА различного химического состава) и 2 контрольные (1 группа – интактные животные, 2-я – группа положительный контроль, матрикс из ПМК, Sigma). Матриксы размером 10×10 мм и толщиной 0,05–0,08 мм были имплантированы подкожно. Техника операции: под ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) в асептических условиях выполняли разрез (длиной 2 см) кожи спины, кожа правого края разреза отслаивалась для формирования подкожного «кармана» глубиной 1 см. Кожу отслаивали от подлежащих тканей и фасции спины, в карман вводили по 3 имплантата; разрез ушивали шелковой нитью наглухо.

В ходе экспериментах в сроки 10, 30, 60, 90 и 180 сут. передозировкой ингаляционного наркоза выводили из эксперимента по три животных каждой группы, забирали для анализов кровь и имплантаты с фрагментами окружающих тканей. В периферической крови с использованием общепринятых методов определяли СОЭ, содержание гемоглобина и форменных элементов.

Для исследований местной реакции на имплантаты образцы тканей с полимерными матриксами иссекали из подкожной ткани и фиксировали в 10% формалине. После заключения материала в парафин изготовливали срезы толщиной 4–6 мкм. Оценивали общую реакцию тканей (окраска гематоксилинэозином) и процессы развития коллагеновых волокон (окраска пикрофуксином по Ван-Гизону). С использованием Image Analysis System «Carl Zeiss Jena» (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования срезов. Оценивали выраженность и длительность воспаления, динамику образования и толщину фиброзной капсулы (ТК), ее клеточный состав, а также время развития и созревания коллагеновых волокон. Об активности клеточных элементов судили по среднему их количеству в поле зрения при анализе 15 полей зрения.

Для изучения кинетики разрушения матриксов in vivo регистрировали остаточное содержание полимера в тканях в динамике эксперимента. С использованием хроматографа для гель-проникающей хроматографии «Waters Breeze System» (Waters, США) исследовали молекулярную массу и молекулярномассовое распределение ПГА относительно полистироловых стандартов (Sigma, США). Значение средней молекулярной массы полимера рассчитывали по формуле:

где Ni — количество молекул массы I; N – общее количество молекул; Mi – масса молекул длины I.

Вес средней молярной массы полимера определяли:

где wi – доля массы (wi = Ni Mi / Σ (Ni · Mi).

Полидисперсность, позволяющую оценить соотношение в полимере фрагментов с различной степенью полимеризуемости, вычисляли из соотношения:

Убыль веса образцов рассчитывали по отношению конечного веса к исходному (Х, %):

где Х1 и Х2 – вес образца, соответственно, до и после испытаний, мг.

Результаты обработаны статистически общепринятыми методами [25] с использованием программы Microsoft Excel. Для получения данных рассчитывали среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку среднего арифметического. Достоверность отличия средних значений проверяли по U-критерию Манна – Уитни (уровень значимости 0,05).

Результаты и обсуждение

В ходе исследования все животные в 5 экспериментальных группах, которым были имплантированы 2D матриксы из полимеров различного химического состава, были здоровы и активны, равномерно прибавляли в весе. Достоверных изменений по сравнению с контрольными группами обнаружено не было. Относительные массы внутренних органов у животных всех экспериментальных групп также не отличались от таковых в контроле. Макроскопические исследования внутренних органов животных наблюдения каких-либо отклонений не выявили.

Показатели общего анализа крови в контрольных и опытных группах находились в пределах физиологических величин и не отличались существенно у животных экспериментальных групп относительно контролей. Незначительное повышение количества лейкоцитов (от 10 до 12,5–13,0×109/л) и уровня СОЭ (до 3,0–3,5) отмечены на 10 сут. после оперативного вмешательства во всех группах у оперированных животных относительно интактного контроля. При этом повышение количества лейкоцитов у животных в группе положительного контроля (ПМК) и во всех экспериментальных группах относительно интактного контроля статистически значимы (p > 0,05). Однако проявление лейкоцитоза на данном сроке у животных, которым были имплантированы матриксы из ПМК, было достоверно выше по сравнению со всеми остальными группами. Повышенное содержание лейкоцитов у этих животных сохранялось на более поздних сроках (30 сут. после операции). Достоверное повышение СОЭ отмечено только на первом наблюдаемом сроке и только у животных в группе положительного контроля относительно других групп. Далее показатель стабилизировался в границах физиологической нормы у всех животных. В целом, сдвиги в лейкоцитарной формуле крови экспериментальных животных всех групп на всех сроках наблюдения статистически значимо не изменялись.

Заживление ран у животных в экспериментальных группах, аналогично положительного контроля, происходило первичным натяжением. Ни у одного животного не обнаружено явлений отторжения имплантатов, нагноения, расхождения швов и других нежелательных явлений. Гистологические исследования реакции тканей на подкожную имплантацию пленочных матриксов из ПГА различного химического состава существенных отличий и неблагоприятных проявлений не выявили. Все матриксы находились в месте имплантации, были окружены тонкой фиброзной капсулой. Вокруг всех типов имплантатов по периферии в окружающей фиброзно-мышечной ткани некрозов, кровоизлияний, гранулем и выраженного отека не было отмечено. Реакция тканей на оперативное вмешательство и последующую имплантацию полимерных матриксов в общих чертах протекала по обычной схеме, характерной для раневого процесса и реакции на инородное тело, включая стадии травматического воспаления, образования соединительной ткани, формирования и перестройки рубца [26].

Микроскопическая картина в месте имплантации экспериментальных матриксов всех типов на 10 сут. после операции (рис. 1) характеризовалась отсутствием отека тканей вокруг имплантатов, которые были макрофагами и лимфоцитами, нейтрофилами и фибробластами. Отмечено начало формирования фиброзной капсулы и обильная макрофагальнофибробластическая инфильтрация на границе с ПГАматриксами. Сопоставление результатов, полученных при имплантации матриксов из ПГА, с реакцией тканей на матрикс, изготовленный из ПМК, показало, что начальная реакция тканей на контрольный материал была более выраженной по сравнению с реакцией на экспериментальные матриксы; количество нейтрофилов и лимфоцитов вокруг имплантата сравнения (ПМК) было выше (табл. 2). Следов разрушения матриксов из ПГА не отмечено.

Через 30 сут. после имплантации вокруг матриксов всех типов сформировались тонкие фиброзные капсулы (рис. 2). Прорастание соединительной ткани в имплантат не отмечено. По периферии в окружающей фиброзно-мышечной ткани некрозов, кровоизлияний, лимфо-гистиоцитарной инфильтрации и отека не наблюдалось. Капсула характеризовалась наличием небольшого количества макрофагов и фибробластов, располагающихся на внутренней поверхности капсулы, на границе с пленкой. Определялись единичные гигантские клеток инородных тел (ГКИТ), лежащие в толще внутренней поверхности капсулы. Минимальная толщина капсулы в эти сроки (22,48±4,16 мкм) определялась вокруг имплантатов из гомополимерного П3ГБ; максимальная (42,36±3,43) – вокруг сополимеров П3ГБ/4ГБ. Более плотная и сформированная капсула характерна для контрольного ПМК (56,75±4,5 мкм). Клеточная инфильтрация капсул, формирующихся вокруг матриксов из всех типов ПГА, возросла преимущественно за счет фибробластов и активных макрофагов; отмечено в небольших количествах присутствие в окружающих тканях клеток воспаления (нейтрофилов и лимфоцитов). В капсуле вокруг контрольного матрикса из ПМК количество нейтрофилов и лимфоцитов было выше в несколько раз. Отмечено также присутствие большого количества ГКИТ, являющихся, как известно, одним из основных агентов биорезорбции ПМК, а также и ПГА. Дегенерации матриксов из ПГА в виде появления трещин или фрагментации не было отмечено.

Существенных отличий в состоянии тканей и структуре фиброзных капсул вокруг экспериментальных ПГА-матриксов спустя 60 сут. после имплантации не отмечено, за исключением увеличения количества ГКИТ и снижения количества клеток воспаления (табл. 2, рис. 3).

Сформированные капсулы в основном были представлены фибробластами и коллагеновыми волокнами; отмечено наличие сосудов микроциркуляторного русла; в их структуре преобладали коллагеновые волокна зрелого типа. В отличие от реакции тканей на ПГА, в тканях вокруг матрикса из ПМК отмечено увеличение количества клеток всех типов, а также увеличение толщины фиброзной капсулы. В зоне, окружающей матриксы, по-прежнему регистрировали большое количество активных макрофагов. Видимые повреждения матриксов из П3ГБ/4ГБ и П3ГБ/3ГГ, среди таковых – выраженная шероховатость поверхности, появление трещин в толще матриксов и вакуолизация. Матрикс, изготовленный из ПМК, выглядел более деструктурированным, в тканях присутствовало значительное количество кристаллизованной остаточной полимерной массы.

Спустя 90 сут. после имплантации (рис. 4). отмечено возрастание толщины фиброзных капсул вокруг всех типов матриксов, однако капсулы были не грубыми, а их толщина не превышала 100 мкм. Капсулы характеризуется наличием ярко выраженной двухслойности, внутренний слой занимает 1/3 толщины, представлен рыхлой фиброзной тканью с большим количеством макрофагов, фибробластов и ГКИТ. Наружная поверхность представлена плотной фиброзной тканью в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. Капсулы характеризуются высокой зрелостью коллагена с наличием фиброцитов во внешнем слое, внутренний – представлен тонким слоем фибробластов с макрофагами, молодой фиброзной тканью с умеренной инфильтрацией лейкоцитами. Наружная поверхность представлена плотной фиброзной тканью в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов, с обеднением клеточного состава инфильтрата. Характерной реакцией тканей на имплантацию матриксов из ПГА было увеличение количества ГКИТ на фоне значительного снижения нейтрофильнолимфоцитарной инфильтрации. Матриксы были существенно деструктурированы.

Через 180 сут. после имплантации вокруг ПГАматркисов зафиксировано значительное (в 1,5–2,3 раза) истончение капсул (рис. 5 и табл. 2) по сравнению со сроком 90 сут. Однако количество активных макрофагов в тканях, примыкающих к имплантатам, по-прежнему оставались на высоком уровне. Среди фибробластических элементов преобладали «зрелые» клетки. Клетки воспалительного ряда не определялись. В периферических частях капсулы наблюдали образование зрелой соединительной ткани в виде пучков коллагеновых волокон и прилегающих к ним фиброцитов. За исключением П3ГБ, практически все матриксы были сильно разрушены и фрагментированы. Остаточное содержание матриксов из П3ГБ/3ГГ, П3ГБ/4ГБ и ПМК – минимально в виде обрывков деструктурированных пленок и небольших фрагментов.

Полученные результаты показали, что матриксы, изготовленные из всех исследованных типов ПГА, биосовместимы и реакция на них со стороны окружающих тканей умеренная, при этом не выявлено существенных отличий и не отмечено, что П3ГБ вызывает более выраженный тканевой ответ по сравнению с другими типами исследованных ПГА. Нельзя не отметить, однако, что в цитированных работах [7, 8, 11] ничего не сказано о процедуре экстракции образцов ПГА и степени химической чистоты исследованных образцов. Вместе с тем, это весьма существенный момент, так как даже следовое присутствие в полимере остаточных количеств макромолекул, присутствующих в биомассе бактерий, из которой выделяют ПГА, может вызвать пирогенные, воспалительные реакции, активировать ферментные системы крови и пр. Поэтому в наших исследованиях в клеточных культурах и в экспериментах на животных использованы только высокоочищенные образцы ПГА, не содержащие каких-либо примесей органической природы [22, 27, 28].

Следующая задача включала изучение кинетики разрушения матриксов, изготовленных из ПГА in vivo. На рис. 6 показано изменение веса матриксов в ходе 180 сут. подкожной имплантации.

Наиболее активно разрушался контрольный матрикс из ПМК. Дефекты его поверхности видны на сроке 10 сут. (см. рис. 1);его остаточная масса через 30 сут. не превышала 60%, через 60 сут. определялась на уровне 36%; спустя 90 сут. – около 10–15 % от исходных значений. Через 180 сут. остаточная масса матрикса из ПМК была следовой. Следующими, активно разрушаемыми были матриксы, полученные из сополимеров П3ГБ/3ГГ и П3ГБ/4ГБ. Через 30 сут. их остаточная масса составила порядка 75–80 % от исходной; через 90 сут. – 20 и 33 %; к концу эксперимента (180 сут.), 10 и 20%, соответственно. Разрушение матриксов, изготовленных из сополимеров П3ГБ/3ГВ (включение 3-гидркосивлаерата 13 и 27,6 мол. %) происходило практически одинаково и было менее замедленным по сравнению с выше описанными сополимерами. Так, через 90 сут. их остаточная масса составила порядка 40%, а через 180 сут. – 30–35% от исходной. Наиболее устойчивы к разрушению матриксы из П3ГБ, заметное разрушение которых (на уровне 25%) зафиксировано на сроке 90 сут, а через 180 сут. остаточная масса этого типа матрикса составила 45% от исходной величины. Более медленная разрушаемость ПГА матриксов сопровождалась более поздним развитием гиганто-клеточной реакции в месте их имплантации. По разрушаемости исследуемые матриксы из ПГА находятся в ряду: П3ГБ/3ГГ – П3ГБ/4ГБ – П3ГБ/ГВ – П3ГБ.

Для анализа закономерностей биодеградации высокомолекулярных соединений информативными являются исследования динамики молекулярной массы полимера, включая определение ряда показателей (Мw, Мn, ПД). С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в динамике эксперимента показано изменение Мw у матриксов из всех типов ПГА и контрольного ПМК (рис. 7).

Выполненные эксперименты позволяют заключить, что все типы исследованных высокоочищенных образцов ПГА не вызывают негативных реакций при имплантации животным, обладают высокой биологической совместимостью и пригодны для биомедицинского применения.

Подняться вверх сайта