Поиск Кабинет

Исследование остеопластических свойств матриксов из резорбируемого полиэфира гидроксимасляной кислоты

Гены & Клетки: Том III, №4, 2008 год, стр.: 41-49

 

Авторы

Шишацкая Е.И., Камендов И.В., Старосветский С.И., Волова Т.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для целей репаративного остеогенеза разработано семейство объемных имплантатов разного состава: из резорбируемого полимера гидроксимасляной кислоты (полигидроксибутирата, ПГБ), из композиции этого полимера с гидроксилапатитом (ГАП), и в сочетании ПГБ с рекомбинантным морфогенетическим белком кости человека-2 (КМБ-2). В экспериментах на животных с использованием модели сегментарной остеотомии исследованы остеопластические свойства разработанных имплантатов в сравнение с фирменными материалами, применяемыми в стоматологии. Показано, что реконструктивный остеогенез происходит активно при использовании всех типов имплантатов, содержащих в качестве основного компонента полигидроксибутират. Собственно полигидроксибутират и его композиции с гидроксиапа-титом и морфогенетическим белком КМБ-2 обладают выраженными остеопластическими свойствами, медленно и адекватно росту новой костной ткани деградируют in vivo, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза.

Введение

Заболевания и травмы опорно-двигательного аппарата относятся к частой патологии, приводящей к снижению качества жизни, а их удельный вес среди общей заболеваемости неуклонно растет [1, 2]; до 30% заболеваний связано с травматизмом. Ежегодно на 100 ООО населения регистрируется свыше 1700 травм, среди них около 37,5% приходится на переломы верхних и 31,1% — нижних конечностей [3]. Несмотря на использование современных конструкций для остеосинтеза и технологий лечения, процент осложнений и неудовлетворительных результатов все еще остается высоким — до 37%. [4]. Учитывая высокий травматизм и большое количество ортопедических манипуляций, разработка новых эффективных методов реконструктивной ортопедии является важнейшей проблемой восстановительной медицины.

В обычных условиях основная часть восстановительных процессов костной ткани происходит в основном за счет остеобластов надкостницы, которые проникают в зону перелома и восстанавливают целостность кости. Несмотря на достаточно активную способность к репарации, костная ткань иногда не в состоянии полностью устранить массивный дефицит ткани, возникший в результате действия повреждающего фактора. Попытки восстановить утраченную часть кости предпринимались с давних пор и сводились, прежде всего, к аллотрансплантации или использованию синтетических материалов. Однако у этих широко применяемых, и ставших уже рутинными, технологий есть множество недостатков: от наличия иммунологического барьера и дефицита пластического материала до остаточного ограничения качества жизни, даже после проведенного лечения (например, при использовании синтетических протезов).

Успешное внедрение в практику экспериментальной биологии и медицины методов длительного культивирования клеток, в том числе клеток-предшественниц специализированных тканей, создали предпосылки для разработки новых технологий и подходов для реконструктивной ортопедии [5]. Со стволовыми клетками применительно к восстановлению дефектов костной ткани в настоящее время связывают большие надежды [6, 7]. Имеются сообщения положительного применения стволовых клеток костного мозга для лечения системного и местного дефицита костной ткани [8, 9]. Используемый в тканевой инженерии междисциплинарный подход направлен в первую очередь на поиск и создание новых биокомпозиционных материалов. Пригодность материала для культивирования пролиферирующих клеток, их прикрепления и поддержания соответствующего генотипа является наиболее жестким критерием выбора [10]. Для обеспечения жизнеспособности пересаживаемых клеток на протяжении заданного периода времени необходимо соответственное существование в ране материала-опоры. Скорость биодеградации материала подложки также должна соответствовать скорости репарации ткани, не опережая и не затрудняя ее [11]. По современным представлениям, «идеальный» костнозамещающий материал должен обладать рядом свойств: остеогенностью (содержать клеточные источники для остеогенеза); остеоиндукцией (запускать остеогенез); остеокондукцией (служить матрицей для образования новой кости в ходе репа-ративного остеогенеза, обладать способностью направлять ее рост); остеопротекцией (заменять кость по механическим свойствам) [12—14],

В настоящее время для восполнения костных дефектов в ортопедии, травматологии и хирургической стоматологии наиболее распространенными материалами с четко выраженной опорной функцией являются искусственные и натуральные кальций-фосфатные материалы (гидроксилапатит, ди- и трифосфат кальция). По мнению многих авторов, гидроксиапатит обладает только остеокондуктивными свойствами [15—18], Однако есть немногочисленные экспериментальные данные о том, что кальций-фосфатные материалы могут стимулировать остеогенез с формированием очагов гетеротопи-ческого костеообразования при помещении их в «мягкие ткани» [19, 20]. Полагают, что кальций-фосфатные материалы, по-видимому, способны адсорбировать белки-регуляторы (например, костные морфогенетические белки) и/или иные факторы роста, необходимые для поддержания процессов пролиферации и дифференци-ровки остеогенных клеток-предшественниц с последующим их развитием в остеобласты и образованием костной ткани [21, 22]. Нельзя не отметить, что остео-кондукция на кальций-фосфатных материалах, несмотря на многочисленные публикации, все еще является сложным и мало изученным процессом, и до сих пор остается открытым вопрос о выборе конкретного типа кальций-фосфатных материалов для ускорения восстановления того или иного типа повреждения костной ткани. Результаты, раскрывающие механизмы взаимодействия биоактивных имплантатов из гидроксиапати-та с костью при развитии остеогенеза в различных режимах, недостаточны для фундаментальных обобщений [23, 24].

После установления в 70-х годах способности коллагена оптимизировать регенерацию костной ткани были начаты получение и исследование биокомпозиционных материалов, содержащих одновременно коллаген и гидроксиапатит. Для челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии за рубежом разработаны композиции типа «Alveloform» и «Bigraft», содержащие очищенный фибриллярный кожный коллаген и частицы гидроксиапатита (Collagen Corp., Palo Alto, США), пригодные для восстановления дефектов костной ткани при хирургическом лечении больных с парадонтитами. Серия гибридных материалов на основе кальцийфосфа-тов и коллагена создана в России, это «Гидроксиапол», КоллапАн®, «Росдент», «Полистом», «Индост» [25, 26]. Однако физико-механические характеристики этих препаратов (невысокие показатели прочности порядка 6,5 МПа и модуль Юнга около 2 ГПа) ограничивают применение материалов такого типа для заполнения крупных костных дефектов [29].

Среди подходов, направленных на улучшение механических свойств биоматериалов из гидроксиапатита (уменьшение жесткости, повышение эластичности) в последние годы сформировалось направление исследований, ориентированное на получение композитов гидроксиапатита с синтетическими полимерами (полиэтиленом, полисульфоном). Однако наполнение гидроксиапатита такими полимерами значительно снижает биосовместимость имплантируемого материала [30]. Новым решением проблемы может стать создание гибридных материалов на основе гидроксиапатита и био-совместимых полимеров, способных к биодеградации [31, 32].

Среди разрушаемых биополимеров особое место занимают полигидроксиалканоаты (ПГА) — полимеры гид-роксипроизводных алкановых кислот (масляной, валериановой и др.), которые с середины 80-х годов активно изучают в качестве материала для хирургии, тканевой инженерии и создания биоискусственных органов [33, 34]. ПГА представляют большой интерес для ортопедии в связи с их механической прочностью, высокой биосовместимостью и медленной биодеградацией [35— 37]. В Институте биофизики СО РАН разработана технология получения полигидроксиалканоатов различного состава; получено семейство экспериментальных полимерных изделий и конструкций биомедицинского назначения различного типа, в том числе плотных и пористых трехмерных матриксов, пригодных для замещения костной ткани. Исследованы структура и физико-химические свойства полимеров и изделий из них. В соответствии со стандартами ГОСТ Р ИСО 10 993—99 проведены комплексные доклинические исследования, продемонстрировавшие биосовместимость изделий из ПГА на уровне клеток, тканей и организма и соответствие требованиям, предъявляемым к материалам и изделиям медицинского назначения, включая контакт с кровью [38]. Ряд полимерных изделий прошли клинические испытания и разрешены к применению [39]. Для реконструктивного остеогенеза разработан композит из полимера гидроксимасляной кислоты (полигидроксибу-тирата, ПГБ) и гидроксилапатита (ГАП) с различным соотношением компонентов, исследованы физико-химические и физико-механические свойства [40]; in vivo показано, что композит ПГБ/ГАП обладает окстекондук-тивными свойствами и способствует образованию костной ткани в тесте эктопического костеообразования [41, 42].

Цель исследования — выявление остеопластичес-ких свойств имплантатов, полученных на основе био-резорбируемого полигидроксибутирата на модели сегментарной остеотомии в эксперименте на лабораторных животных.

Материал и методы

Эксперимент проведен на половозрелых крысах-самках линии «Вистар» с исходной массой 200^220 г (питомник Института цитологии и генетики СО РАН) с разрешения и в соответствии с Программой исследований, утвержденной Комиссией института биофизики СО РАН по биоэтике. Животных содержали в виварии на стандартном рационе, руководствуясь инструкцией «Использование животных в космической биологии и медицине» и «Правилами проведения работ с экспериментальными животными». Использовано 72 животных, которые были разделены на 6 групп (по 12 крыс в каждой группе): три экспериментальные (имплантаты на основе ПГБ), две группы сравнения (имплантаты из материалов, применяемых в стоматологии), контрольная группа (без имплантата, заживление дефекта — «под кровяным свертком») (табл.).

Область для формирования дефекта выбрана с учетом известных данных о том, что наиболее оптимальной моделью у крыс, позволяющей корректно оценить эффективность влияния на репаративный остеогенез имплантатов из различных материалов, является дефект метаэпифизарной зоны большеберцовой кости диаметром от 1,5 до 3,0 мм и глубиной от 1,0 до 3,5 мм [12, 43—44]. Для формирования дефекта костной ткани у животных под ингаляционным эфирным наркозом в области эпифиза большеберцовой кости после обнажения мыщелков и верхней трети правой голени с помощью остеотома диаметром 2,5 мм при постоянном охлаждении физиологическим раствором создавали дефекты диаметром 3,0 мм и глубиной 2,0 мм, которые заполняли сконструированными имплантатами диаметром 2,5 мм и высотой 1,5 мм. После этого проводили послойное ушивание операционной раны. Исходная площадь экспериментальных имплантатов на основе ПГБ составила 26,28 мм2; объем — 39,42 мм3.

Исследованы экспериментальные объемные имплантаты трех типов, изготовленные из собственно полигид-роксибутирата (ПГБ), гибридного материала полигидрок-сибутират/гидроксиапатит (ПГА/ГАП) с содержанием ГАП 20% (фирмы ЗАО Полистом®, Москва) и полигидрокси-бутирата, наполненного рекомбинантным морфогенетическим белком человека ПГА/гИВМР^2 (ProSpec—Талу TechnoGene Ltd, Израиль). В качестве материалов сравнения использовали композитный гранулированный материал гидроксиапатит/коллаген (препарат «Коллапол®», ЗАО Полистом, Москва) и препарат аллокости «Bio-OSS®» в виде порошка («Geistlich», Швейцария).

В ходе эксперимента анализировали общее состояние животных, опороспособность оперированной конечности, состояние тканей в месте операции. На сроках 14, 28 и 84 сут. после операции животных выводили из опыта летальной дозой наркотического препарата. Выделяли бедренную кость, визуально и рентгенологически (установка «Kodak Trophy IRIX—70») оценивали область дефекта кости. Гистологические исследования выполнены общепринятыми методами; участок костной ткани с исследуемыми имплантатами фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина. После декальцинации препаратов раствором «Трилона-Б» готовили гистологические срезы (толщиной 5^10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологические исследования проводили с применением поляризационного микроскопа в проходящем свете Axioskop 40 Pol. (Karl Zeiss, Германия) с цифровой фотокамерой AxioCam MRc-5. С использованием пакета прикладных программ Image Analysis System «Karl Zeis» (Германия) проводили анализ изображений и морфометрические исследования срезов для морфометрических исследований структуры костной ткани в месте дефекта, оценки состояния и динамики резорбции материала имплантатов. Определение остаточного содержания материала имплантатов в месте дефекта проводили модифицированным морфометрическим методом В.П. Яценко [45].

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы «MS Excel». Рассчитывалась средняя арифметическая величина и ее ошибка (М±т) и критерий Стьюдента (£) с определением значимости различий (р). Критический уровень значимости р принимался меньшим или равным 0,05. Анализировали не менее 5-ти гистологических срезов препаратов, полученных от каждого животного; в ходе морфометрического анализа анализировали не менее 10 полей зрения.

Результаты

Все животные удовлетворительно перенесли оперативное вмешательство; значимых осложнений у животных в послеоперационном периоде не выявлено. У всех животных раны зажили первичным натяжением. Через 7^8 сут. животные могли нагружать оперированную конечность в полном объеме. В экспериментальной группе с имплантатами ПГА/гИВМР-2 у одного животного наблюдали гипертрофированный рост новообразованной кости в области имплантата; в контрольной группе у одного животного опорная функция конечности полностью восстановилась на 5 сут. позднее остальных.

На всех сроках наблюдения имплантаты всех типов находились в месте костного дефекта. По данным рентгенологических исследований зон лизиса, образования фиброзных капсул вокруг имплантатов всех типов не выявлено. Заживление костных дефектов у животных протекало по общим закономерностям, включая фазы посттравматических изменений тканевых элементов, регенерации и адаптивной ремоделяции. Заполнение модельного дефекта имплантатами, изготовленными из различных материалов, способствовало регенерации костной ткани в разной степени. В зависимости от типа имплантата выявлены некоторые отличия в течение ре-паративного остеогенеза.

На рис. 1 представлены поперечные спилы костей в области дефектов с исследуемыми имплантатами на разных сроках наблюдения.

При использовании для заполнения костного дефекта полимерного имплантата из ПГБ (1 группа) через 14 сут. после имплантации вокруг фрагментов полимера зафиксирована пролиферация остеогенных клеток (рис. 2А), дифференцировка их в остеобласты и образование новой костной ткани в виде костных трабекул, с формированием в межтрабекулярных пространствах сосудов капиллярного типа. В костных полостях видны большие фрагменты полимера, на границе которого происходило образование хрящевой и незрелой костной тканей. На рис. 2Б отчетливо видны новообразованная компактная кость и геверсовы системы, остеоциты и остеоны, линии цементации. Через 1 мес. в зоне дефекта при имплантации ПГБ на фоне активной перестройки в компактную кость, что подтверждалось наличием остеонов с четкими линиями цементации, зафиксированы значительно сокращение количества полимерного имплантата; фрагменты полимера на гистологических срезах составили около 60% от исходной площади. В отдельных участках исследуемых препаратов наблюдали сла-бовыраженное разрастание остеогенной ткани вокруг материала с пролиферацией остеобластов и образованием остеоида. На этом сроке наблюдений наибольший прирост новообразованной костной массы определялся в области эндоста, что подтверждалось значительным увеличением количества, объема и степенью зрелости костных трабекул. К окончанию эксперимента (3 мес.) в зоне имплантации ПГБ отмечено активное формирование новообразованной кости, имеющей дефинитивное строение, о чем свидетельствовали пластинчатая организация и формирование остеонов. В препаратах видны отдельные мелкие фрагменты разрушающегося полимера, которые не включились в состав остеогенной ткани и находились отдельно от неё в виде кластеров. Площадь, занимаемая фрагментами полимера, составила порядка 25% от исходной. Присутствие полимерного материала в препаратах на этом сроке свидетельствует о низких скоростях его резорбции. Проявлений воспалительной реакции в месте контакта имплантата с костью, формирования капсулы не отмечено.

При замещении модельных дефектов костной ткани имплантатами из композита ПГБ/ГАП картина репаративного остеогенеза несколько отличалась от течения процесса при использовании чистого полимера. На 14 сут. после имплантации в области дефекта зафиксировано формирование незрелой костной ткани (рис. ЗА).

В костных полостях частицы полимера располагались вместе с кроветворными клетками в виде крупных агрегатов. Отмечено формирование тонких костных пластинок с большим количеством пролиферирующих остеобластов. Отчетливо фиксировались зоны значительных массивов не разрушенного матрикса (рис. ЗБ). Через месяц объем остеогенной ткани заметно возросла, но расположение костных пластин было хаотичным; система остеонов выражена в меньшей степени по сравнению с животными группы 1. На срезах отчетливо видны фрагменты имплантатов, не интегрированные в новообразованную костную ткань. Отмечено усиление продукции ге-мопоэтических клеток. Формирующаяся компактная кость с сохранением крупных полостей достаточно рыхлая, что позволяет предполагать отличия биомеханических свойств. Через 3 мес. зафиксирована практически полностью сформированная компактная костная ткань, содержащая системы остеонов. Тем не менее, костные пластинки в отдельных участках гистологических препаратов имели не продольную, а хаотическую направленность. По-прежнему в препаратах видны достаточно крупные фрагменты имплантатов, суммарная площадь, занимаемая остаточными фрагментами которых составляла до 30^40% от исходной, что значимо выше этого показателя в случае использования имплантата, изготовленного только из полимера. При этом отмечено наличие фрагментов гидроксиапатита, отделенного от полимера слоем остеогенных клеток. Таким образом, резорбция композитного матрикса протекала значительно медленнее по сравнению с матриксами из ПГБ.

При регенерации костной ткани в месте имплантации полимерной конструкции из ПГБ, нагруженной костным морфогенетическим белком (ПГА/гИВМР-2), на 14 сут. отмечены признаки индукции преимущественно хрящевой ткани с образованием массы хондробластов и хондроцитов (рис. 4А). Новообразованная костная ткань имела рыхлую структуру и разнонаправленность пластинок. В препаратах определялся материал имплантата в агрегатах в количестве, аналогично результатам, полученным на группе животных, которым имплантировали ПГБ. Часть этих агрегатов были окружены клетками соединительнотканной природы. Через месяц эксперимента в препаратах отмечено массивное разрастание созревающей соединительной ткани. Здесь же отмечаются признаки прямого остеогенеза (интрамембраноз-ная оссификация) с формированием тонких «кружевных» костных балок, между которыми расположены соединительная ткань и единичные гемопоэтические клетки. Костные балки покрыты остеогенными клетками, наблюдалось образование костно-хрящевых структур, имеющих хаотичное направление. В препаратах обнаружены фрагменты полимера; признаков воспалительной реакции не обнаружено (рис. 4Б). Через три месяца костная ткань в месте дефекта представлена в основном компактной костью с большим количеством остеонов с наличием на границах соседних систем линий цементации. Меж-трабекулярные костные полости широкие, практически пустые, выстланы остеогенными клетками. Создается впечатление о почти полном окончании регенерационных процессов в кости с ее реконструкцией и перестройкой. Не смотря на то, что система остеонов сформирована, направление костных пластинок не всегда строго параллельно и костная ткань имеет достаточно «рыхлую» структуру. Количество полимера существенно уменьшилось, но по-прежнему присутствовало в препаратах; его площадь составила около 20^25% от исходной.

При использовании имплантатов из остеопластичес-ких фирменных материалов «Коллапол®» и «Bio-OSS®» регенерация костного дефекта протекала на фоне более активной резорбции матриксов в сравнении с матриксами на основе ПГБ. При использовании «Коллапол®» спустя 14 сут. отмечены немногочисленные костные трабекулы. Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово (рис. 5А). Отмечено значительное утолщение периоста за счет разрастания фиброзного слоя, при этом остеогенный слой периоста тонкий, представлен неактивными остеогенными клетками.В препаратах рядом с новообразованными нежными костными пластинками видны фрагменты имплантата (рис. 5Б); площадь фрагментов составила порядка 20^25%. Через месяц костные трабекулы более выражены, чем на сроке 14 сут.; межтрабекулярные костные полости более узкие, содержат много зрелой неоформленной волокнистой соединительной ткани, а также кроветворные клетки. Активность остеогенных клеток и остеобластов умеренная, то есть остеогенез продолжается с началом перестройки и формирования компактной кости. Признаков имплантированного материала не обнаружено. Через 3 мес. отмечена перестройка губчатой кости регенерата в компактную с формированием гаверсовых систем. Соединительная зрелая ткань присутствует в небольшом количестве, костно-мозговой канал широкий, заполнен кроветворными клетками, пролиферативная активность остеогенных клеток крайне низкая, количество остеокластов — минимально. К концу эксперимента в препаратах встречаются области, не до конца заполненные новообразованными костными структурами.

При использовании для заполнения модельного дефекта костной ткани препарата «Bio-OSS®» (рис. 6) на сроке 14 сут. материал в препаратах практически не определяется. Признаки остеогенеза выражены слабо. Определяются немногочисленные костные трабекулы с оптически плотным органическим матриксом. Пролиферативная активность остеогенных клеток, выстилающих костные полости, выражена очагово. Отмечается значительное утолщение периоста за счет разрастания фиброзного слоя, при этом остеогенный слой периоста тонкий, представлен неактивными остеогенными клетками. Через 1 мес. в препаратах представлена в основном компактная кость с четкими гаверсовыми системами. Периост утолщен за счет фиброзного слоя. Костно-мозговой канал широкий, заполнен костным мозгом. Спустя 3 мес., картина остеогенеза, аналогична сроку 1 мес., в препаратах зафиксирована компактная кость с широким костно-мозговым каналом, заполненным костным мозгом. В целом, морфологические признаки репаратив- ной регенерации костной ткани выражены слабее, а объем новообразованной кости меньше, чем при использовании всех типов имплантатов, изготовленных с использованием полигидроксибутирата.

Восстановление костного дефекта «под свертком крови» протекало по обычной схеме. Чрез 14 сут. в препарате отмечены признаки непрямого (энхондрального) остеогенеза. Отмечены области рыхлой волокнистой соединительной ткани в зоне формирования хрящевой ткани. Через месяц зафиксирована менее зрелая по сравнению с экспериментальными группами животных компактная кость с гаверсовыми системами и линиями цементации. Активность остеогенных клеток и остеобластов при этом невелика; остеокластический феномен отсутствует. На сроке 3 мес. препарат представлен компактной костью; костно-мозговой канал широкий, заполнен кроветворными клетками. Зндост представлен одним слоем остеогенных клеток. Остеокластической резорбции не отмечено.

Результаты проведенных экспериментальных исследований на животных различных остеопластических материалов показали, что замещение экспериментального дефекта всеми типами имплантатов на основе резорби-руемого полигидроксибутирата препятствует прорастанию в зону дефекта рыхлой соединительной ткани, способствуя образованию новой кости. Исследованный биоматериал обладает выраженными остеопластическими свойствами, медленно, адекватно росту новой костной ткани деградирует in vivo, постепенно замещается ею, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза. Полученные результаты позволяют планировать эксперименты на более крупных животных с формированием костных дефектов большего объема.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований (грант № 07^03430112а), Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки^медицине» (проект 12, 11.1), Программы Президента РФ для поддержки молодых кандидатов наук (грант №. МК^577.2008.4).

Подняться вверх сайта