Поиск Кабинет

Исследование миграции трансплантированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организме опухоленосителя

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 56-63

 

Авторы

Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А., Ширманова М.В., Балалаева И.В., Киселева Е.В., Загайнова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Изучение роли различных видов стволовых и про гениторных клеток в канцерогенезе является объектом интенсивных исследований. При этом все большее рас пространение получают флюоресцентные методы для ис следования миграции клеток в организме реципиента и участия их в опухолевом патогенезе. В данной работе с применением методов проточной цитометрии и конфокаль ной лазерной сканирующей микроскопии исследовано вза имодействие мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга с аллогенной опухолью. ММСК выделяли из костного мозга самцов GFP+ трансгенных мышей линии С57/Вl6. Опухоли были при виты самцам линии С57/Bl6 подкожной инъекцией опухо левых клеток карциномы легкого Льюис. За день до этого выполняли миелоабляцию облучением. GFP+-ММСК и клетки костного мозга мышей С57/Вl6 системно вводи ли животным той же линии на следующие сутки после облучения. Животные были разделены на две группы: 1 – облученные животные с прививанием опухоли и вве дением аллогенных костномозговых клеток, в том числе GFP+-ММСК; 2 (контрольная) – необлученные животные с прививанием опухоли, без введения клеток. Методом проточной цитометрии оценивали уровень флюорес ценции свежевыделенных клеток костного мозга у жи вотных 1 и контрольной групп на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации GFP+-ММСК. В этих же группах животных методом конфокальной лазерной сканирую щей микроскопии анализировали распределение меченых GFP+-клеток и их дериватов в органах и тканях опухоли также на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации. Установлено, что при системном введении донор ские GFP+-ММСК отсутствуют в костном мозге и тка нях индуцированной опухоли, но вместе с тем способ ны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь в потенциальных нишах (селезенка, печень), и активно пролиферировать.

Изучение роли различных видов стволовых кле ток в канцерогенезе является объектом интенсивных исследований. Стволовые и прогенеторные клетки различного происхождения играют важную роль в развитии опухоли, но особенно интересны в этом от ношении мультипотентные мезенхимные стромаль ные клетки (ММСК). ММСК могут быть получены из костного мозга (КМ), жировой ткани, скелетной мускулатуры, периферической и пуповинной кро ви, синовиальной оболочки суставов и др. ММСК характеризуются фибробластоподобной морфо логией, высоким пролиферативным потенциалом, способностью к симметричному и асимметричному делению, мультилинейностью дифференцировки, выраженными адгезивными свойствами, способно стью к образованию колоний в культуре. Вместе с тем именно костномозговые ММСК наиболее изуче ны, применяются в клинической практике (главным образом, в рамках клинических исследований) и до сих пор остаются «золотым стандартом» в работах, посвященных изучению фенотипа, функций и роли ММСК в постнатальном развитии организма. ММСК участвуют в формировании динамичной системы в КМ, состоящей из дифференцированных фибробластов, ретикулярных клеток, эндотелия, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, цито кинов. При этом взаимодействие между собой и с другими клетками осуществляется через специфические рецепторы и молекулы адгезии[1].

Главными функциями ММСК КМ в организме яв ляются: формирование гемопоэтического и стромаль ного микроокружения, участие в морфогенезе, само поддержание и восстановление пула ММСК, участие в гомеостатических реакциях организма, процессах регенерации, репарации и адаптации системы ММСК в норме и патологии[2]. Имеются также сведения об участии ММСК КМ в канцерогенезе. Считается, что ММСК способны мигрировать в опухоли подоб но тому, как они мигрируют в поврежденные ткани, в том числе и в связи с тем, что опухолевый рост сопровождается воспалительным процессом. При влечение ММСК в опухоль было продемонстрировано в ряде ксенотрансплантационных моделей меланомы [3], рака яичников[4], рака молочной железы[5], гепатоцеллюлярной карциномы[6].

Предполагается существование нескольких меха низмов привлечения и участия ММСК в канцероге незе. Наиболее вероятной считается мобилизация ММСК из системных ниш (в первую очередь кост номозговых) и их последующий хоуминг в опухоль в ответ на действие хемотаксических агентов, про дуцируемых опухолевыми клетками. При этом отме чается, что ингибирования действия одного из аген тов недостаточно для нарушения аттракции ММСК, что говорит о нескольких согласованных механизмах в регулировании их тропизма к опухоли. Способность ММСК к преодолению барьера из эндотелиальных клеток сосудистой стенки является важнейшим ус ловием реализации этого механизма миграции клеток к опухоли.

Привлеченные ММСК могут воздействовать на канцерогенез в нескольких направлениях. Во-первых, оказывать прямое действие через секрецию молекул паракринного действия, влияющих на фенотип опу холевых клеток. Во-вторых, за счет иммуносупрес сивных свойств изменять состав «местных» иммунокомпетентных клеток, нарушая иммунные реакции, направленные на подавление роста злокачественных клеток. В-третьих, способствовать васкуляризации опухоли, усиливая ангиогенез. В-четвертых, дифференцироваться в микросреде опухоли и выступать в качестве местных источников для развития опухолевых стромальных клеток[7].

Для изучения участия стволовых клеток в опухо левом патогенезе и наблюдения распределения их в организме реципиента традиционно используются иммуногистохимический анализ, проточная цитоме трия, ПЦР и др. Одновременно с этим флюоресцент ные методы исследования получают все большее распространение как при ex vivo, так и при иссле дованиях in vivo. В качестве генетических меток (маркеров) используют системы люциферин-люци феразы и флюоресцентных (GFP-подобных) белков различных групп, генами которых трансфицируют исследуемые клетки. Это позволяет отслеживать местоположение маркированных клеток и их продук тов, а также происходящие с ними изменения, что крайне важно при исследованиях in vivo.

При оценке субклеточного распределения флю оресцирующих веществ эндогенного и экзогенного происхождения in vitro стандартом является метод конфокальной лазерной сканирующей микроско пии (КЛСМ)[8, 9]. Пространственное разрешение КЛСМ позволяет строить полноценные трехмерные изображения оптически прозрачных флюоресцирую щих объектов, а также наблюдать структуру образцов биотканей на глубинах до 100 мкм. Методика КЛСМ демонстрирует высокую чувствительность при визу ализации структур, меченных флюоресцирующими белками.

Целью работы было исследование методами проточной цитометрии и КЛСМ распределения аллогенных GFP+-ММСК в организме реципиента и их взаимодействия с привитой аллогенной опу холью (карцинома легкого Льюис). Исследование включало последовательное решение следующих задач:

1. Выделение ММСК из КМ трансгенных GFP+ мышей линии С57/Вl6 и характеристика их метода ми проточной цитометрии и КЛСМ;

2. Облучение животных-реципиентов, прививка им опухоли и трансплантация аллогенных костно мозговых клеток, включая GFP+-ММСК;

3. Исследование миграции меченных ММСК в организме животного с опухолью.

Материал и методы

Дизайн эксперимента

Животным экспериментальной группы была вы полнена миелоабляция облучением с последую щим (на следующие сутки) прививанием опухоли и системной трансплантацией аллогенных клеток КМ. При этом «клеточный препарат», подготов ленный для введения, включал как GFP+-ММСК, так и гемопоэтические GFP--клетки, необходимые для репопуляция костного мозга реципиента, под держки кроветворения. GFP+-ММСК в созданной модели выступали в качестве «сигнальных», по скольку именно по их флюоресценции оценива ли присутствие ММСК или их потомков в органах реципиента (КМ, легкие, печень, селезенка, ткани опухоли). Общая схема эксперимента представлена на рис. 1.

Клеточные культуры

В работе использовали ММСК КМ самцов линии С57/Вl6 и самцов GFP+-трансгенных мышей той же линии. ММСК выделяли из бедренных костей и костей голени. КМ вымывали с помощью иглы рас твором стерильного фосфатно-солевого буфера с гентамицином (200 ед/мл, ПанЭко, Россия), про мывали средой DMEM (ПанЭко, Россия) с гентами цином (2 раза), центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин), суспензию клеток фильтровали через ней лоновый фильтр (диаметр пор = 100 мкм). Клет ки культивировали в среде DMEM с L-глутамином (280мг/л), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, CША) и гентамицин (200 ед/мл) при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Неадгезиро вавшиеся клетки удаляли через 72–96 ч Затем культуры переводили на среду DMEM с 10% сы воротки. Смену среды проводили каждые 3–4 сут. В экспериментах использовали первичные культуры ММСК.

Клетки КМ выделяли из бедренных костей сам цов линии С57/Вl6. КМ вымывали раствором сте рильного фосфатно-солевого буфера с гентамици ном (200 ед/мл, ПанЭко, Россия) с помощью иглы. Полученную суспензию клеток промывали фосфат но-солевым буфером 3 раза, центрифугировали (1200 об/мин, 5 мин) и фильтровали через нейло новый фильтр (диаметр пор = 100 мкм). Клетки характеризовали с помощью проточной цитометрии, количество определяли в камере Горяева.

Опухолевые модели и облучение

При выборе режима облучения руководствовались литературными данными[10, 11], где было установ лено, что доза облучения выше 5 Гр приводит к пол ной миелоабляции КМ, а восстановление его функ ций происходит в течение 4 нед. после облучения. Эффективным (сублетальным) режимом облучения для абляции только КМ мышей признано однократ ное облучение дозой 5 Гр[12]. Поэтому облучение лабораторных животных проводили в этом режиме с помощью излучателя РУМ17 с фильтром Cu05+1Al (210 kV, 15mA, F = 47см, доза 75 рад/мин), ИБР РАН, Москва.

Карциному легкого Льюис прививали самцам ли нии С57/Bl6 в возрасте 3 мес. на следующий день после облучения подкожной инъекцией в область ле вого бедра 100 мкл 10% взвеси опухолевой ткани (10 мкг).

Содержание и использование лабораторных жи вотных соответствовало правилам, принятым в Рос сийской Федерации, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам[13].

Трансплантация клеток

GFP+-ММСК (1×106) и костномозговые клетки мышей С57/Вl6 (1×106) системно вводили мышам той же линии на следующие сутки после облучения. Были сформированы следующие группы животных: 1 (экспериментальная) – облученные животные с прививанием опухоли и трансплантацией аллоген ных костномозговых клеток, в том числе GFP+-ММСК (n = 12); 2 (контрольная) – необлученные животные с прививанием опухоли, но без введения каких-либо клеток (n = 3).

Проточная цитометрия

С помощью проточной цитометрии оценивали уровень флюоресценции свежевыделенных кост номозговых клеток на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации. Для оценки уровня флюоресценции с помощью проточной цитометрии использовали: первичные культуры ММСК КМ мышей линии С57/Вl6 и GFP+ трансгенных животных той же линии; костномозго вые клетки животных контрольной и эксперимен тальной групп.

В работе использовали проточный цитометр FACS Calibur (BD, США) с возбуждением флюоресценции лазером с длиной волны 488 нм и регистрацией сиг нала в диапазоне длин волн 515–545 нм. В случае клеточных культур анализировали не менее 40 000 событий, при исследовании клеток КМ – не менее 200 000 событий.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Методом КЛСМ анализировали распределение меченых GFP+-ММСК и их дериватов в органах и тканях опухоли на 7-е, 12-е и 15-е сут. после транс плантации.

Для анализа распределения меченых клеток в организме реципиента животных выводили из эксперимента дислокацией шейного позвонка. Да лее осуществляли эксплантацию образцов органов для исследования на установке для лазерной ска нирующей микроскопии (LSM 510 META 23, Carl Zeiss, Германия) на основе моторизированного инвертированного микроскопа (Axiovert 200M), ос нащенного модулем для детектиции спектров эпи флюоресценции в видимом диапазоне с разрешением 10 нм. Конфокальные изображения были получены с помощью объектива ×40 с числовой апертурой NA = 1.3. Регистрацию флюоресцентных изображе ний осуществляли при однофотонном возбуждении аргоновым лазером на длине волны 488 нм мощно стью 1–2 мВт на образце. Для идентификации флю оресценции GFP (488/506) регистрировали спектры флюоресценции в интервале 490–600 нм. Изобра жения, полученные на конфокальном микроскопе, обрабатывали в компьютерной программе Zeiss LSM Image browser (version 4.0.0.91).

Результаты

Из 12 облученных животных (экспериментальная группа) на второй день после облучения и транс плантации клеток количество выживших составило 50%, что, вероятно, связано с развитием острой лучевой болезни.

Характеристика флюоресцентных свойств ММСК

GFP+-ММСК трансгенных животных были вы делены и культивированы. Установлено, что при культивировании с увеличением числа пассажей происходит «угасание» первоначально ярко флюо ресцирующих клеток, при этом ММСК к 3 пассажу теряют до 70% первоначальной флюоресценции (рис. 2).

В связи с этим в данной работе использовали клетки первичной культуры, что, с одной стороны, могло привести к разнородности популяции вводи мых клеток, но с другой стороны – позволило сохранить максимум флюоресцентных свойств.

Проточная цитометрия

В предварительных экспериментах был проведен анализ интенсивности флюоресценции первичных культур GFP+-ММСК и GFP--ММСК мышей линии С57/Вl6 (контроль). Установлено, что GFP+-ММСК обладают яркой флюоресценцией в диапазоне 515–545 нм, GFP-ММСК, закономерно, флюорес центными свойствами не обладали (рис. 3А). Кост номозговые клетки животных экспериментальной группы были выделены через 7, 12 и 15 сут. после трансплантации. В ходе анализа распределения кле ток КМ животных экспериментальной и контрольной групп по уровню сигнала не было выявлено досто верных различий. Флюоресценция, характерная для GFP+-клеток, не была обнаружена ни в одном случае (рис. 3Б). Таким образом, GFP+-ММСК в КМ экспериментальных животных не были выявлены.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Для получения контрольного спектра белка GFP на установке КЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры GFP+-ММСК. Данный спектр использовали для дальнейшего сравне ния со спектрами тканей исследуемых органов (рис. 2В). Полученный спектр клеток имел ярко вы раженный пик на длине волны 506 нм и полностью соответствовал спектру флуоресценции белка GFP[14].

У животных экспериментальной группы после введения GFP+-ММСК в тканях легких были обна ружены участки флюоресценции, соответствующей спектру белка GFP: яркие, достаточно часто встре чающиеся в поле зрения на 7-е сут. после транс плантации и разрозненные к 12-м и 15-м сут. экспе римента (рис. 4А). Их спектральные характеристики представлены на рис. 5А, где экспрессия белка GFP характеризовалась пиком на длине волны 506 нм. Участки флюоресценции GFP соответствовали размерам единичной клетки (10–20 мкм) и располагались диффузно (по 1–3 в поле зрения). Областей групповой локализации обнаружено не было.

В селезенке животных экспериментальной груп пы на 7-е сут. после трансплантации были обнаруже ны небольшие скопления клеток со спектральными характеристиками GFP белка. К 12-м сут. их коли чество увеличилось, были найдены яркие локальные скопления GFP+-клеток – от 20 до 50 клеток в груп пе, рассеянные по органу с определенной периодич ностью. На 15-е сут. удалось зафиксировать лишь диффузно распределенные «точки», которые по раз меру были меньше одной клетки (рис. 4). На всех сроках наблюдения отмечено полное соответствие спектральных характеристик обнаруженных клеток спектру флуоресценции белка GFP (рис. 5Б). В тканях печени на 7-е сут. после трансплантации были определены зоны флюоресценции, имеющие спектры, отличные от спектра белка GFP (рис. 5В). Яркие флюоресцирующие локальные скопления GFP+-клеток, часто встречающиеся в поле зрения, обнаружены на 12-е сут. после трансплантации (рис. 4В). К 15-м сут. выявлено как уменьшение количества клеток в группах, так и сокращение чис ла подобных групп в тканях органа. Спектральные характеристики клеток полностью соответствовали спектру белка GFP (рис. 5В).

В опухолевых тканях участков с GFP-флюорес ценцией на 7-е сут. после трансплантации обнаружено не было. Несколько подобных участков были найдены на 12-х и 15-х сут., однако они не соответствовали размерам клеток (были значительно меньше), в от личие от обнаруженных в печени и селезенке (рис. 4). Вместе с тем, спектральные характеристики найден ных участков имели ярко выраженный пик на длине волны 506 нм (рис. 5Г).

Интенсивность собственной флюоресценции в тканях животных контрольной группы оценивали при тех же условиях и настройках, что и в случае экс периментальной группы. В тканях легких, селезенки, печени и опухоли была отмечена слабая флюорес ценция (рис. 4), однако ее спектр кардинально от личался от спектра GFP+-клеток (рис. 5).

Обсуждение

Для изучения распределения донорских GFP+ ММСК в тканях и органах животного с опухолью были использованы методы проточной цитометрии и КЛСМ.

Ранее методом прижизненного биоимиджинга у животных с трансплантацией стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) человека мы выявили пере распределение меченых флюоресцентным белком TurboFP СКЖТ из зоны введения[15]. У животных опухоленосителей с системным введением СКЖТ флюоресценция меченых клеток была зарегистри рована методом флюоресцентного биоимиджинга in vivo в области селезенки как на ранних стадиях канцерогенеза, так и при сформированной опухоли. Полученные результаты соответствовали литератур ным данным[16, 17]. В настоящей работе мы также использовали метод in vivo имиджинга для исследования миграции ММСК в опухоль и потенциальные ниши организма, однако обнаружить органы накопления ММСК у животных экспериментальных групп нам не удалось. Это могло быть обусловлено следующими причинами: 1) малое количество трансплантированных меченых ММСК; 2) неадекватность выбранного типа клеток и линий лабораторных животных задачам исследования; 3) глубокая локализация ниш. Тем не менее, данный метод является достаточно эффективным при изучении in vivo моделей[18–20].

Проточная цитометрия была применена для ана лиза клеток КМ лабораторных животных, поскольку применение КЛСМ для данных исследований имеет ряд ограничений. Меченые клетки не были обнару жены в КМ ни одного из животных эксперименталь ных групп ни на одном из контрольных сроков после трансплантации GFP+-ММСК (7, 12, 15 сут.). Тем не менее, в работе A. Saton с соавт. (2008) было по- казано, что GFP+-клетки могут составлять до 80% от клеток КМ мышей-реципиентов линии С57/BL6 при их летальном облучении (12 Гр) и введении 1 млн. аллогенных GFP+-костномозговых клеток уже через 4 нед.[10]. В работе D. Nolan с соавт. (2007) было показано, что гемопоэз у летально облученных (11 Грей) животных может быть восстановлен более чем на 95% через 4 нед. после трансплантации 10 млн. донорских GFP+-костномозговых клеток[11]. Веро ятно, в используемой нами модели отсутствие GFP+ ММСК в КМ животных экспериментальной группы связано со слишком ранними сроками наблюдения, на которых репопуляция КМ уже началась, но актив ная пролиферация еще не наступила, или в связи с малым количеством трансплантированных клеток. Проблема перераспределения стволовых кле ток в организме животного-опухоленосителя ак тивно изучается. Известны in vivo модели, на ко торых подтверждено присутствие донорских ММСК в зоне опухолевого роста. Например, в работе S. Kidd с соавт. (2009) методами биолюминесцент ного имиджинга и иммуногистохимии показано, что в ксеногенной модели рака молочной железы си стемно введенные ММСК КМ человека, меченные люциферазой, способны мигрировать в опухолевые узлы[20]. В наших исследованиях методом КЛСМ участки с флюоресценцией GFP+-клеток были об наружены в опухолевых тканях животных на 12-е и 15-е сут. после трансплантации. Но вследствие того, что эти участки были значительно меньше размеров единичной клетки, мы не можем с уверенностью го ворить о присутствии GFP+-клеток на данных сроках в тканях опухоли.

Согласно литературным данным, легкие живот ных в экспериментальных моделях in vivo выступают в качестве пункта «премиграции», где системно вве денные стволовые клетки накапливаются (3–4 сут.) и затем (к 7–9 сут.) перераспределяются в организме реципиента[20]. Это подтверждают полученные нами данные. На всех сроках после введения GFP+-ММСК в тканях легких были зарегистрированы области с со ответствующими спектрами флюоресценции. Макси мум приходился на 7-е сут. после трансплантации, а затем их количество уменьшалось.

Нами также были обнаружены донорские GFP+ ММСК в печени и селезенке животных, что со гласуется с результатами, полученными другими авторами[16]. Были выявлены особенности распре деления клеток в тканях этих органов: обнаружены локальные скопления GFP+-клеток – от 20 до 50 в группе, рассеянные с определенной периодично стью и встречающиеся как на поверхности, так и в более глубоких слоях (до 60 нм) тканей печени и селезенки. Вероятно, нами были обнаружены места активной пролиферации донорских ММСК, о чем свидетельствуют как характер распределения клеток (пулами), так и число клеток в каждой группе. При этом эффективность накопления ММСК в этих ор ганах разнесена во времени: в селезенке популяции донорских ММСК обнаруживаются раньше (7 сут. после трансплантации), чем в печени.

Таким образом, взаимодействие опухоли (кар циномы легкого Льюис) с ММСК, выделенными из КМ трансгенных GFP+-мышей линии С57/Вl6, было изучено на сроке до 15 сут. туморогенеза с при менением методов проточной цитометрии и КЛСМ. Установлено, что в пределах указанного срока при системном введении донорские GFP+-ММСК от сутствуют в КМ и тканях индуцированной опухоли, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь в потенциальных «нишах» (селезенка, печень) и активно пролиферировать.

Подняться вверх сайта