Поиск Кабинет

Исследование эндогенной секреции сосудистого эндотелиального фактора роста мультипотентными мезенхимными стромальными клетками из зачатков третьих моляров человека

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 155-158

 

Авторы

Соловьева В.В., Блатт Н.Л., Шафигуллина А.К., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время активно ведутся исследования секретома стволовых клеток человека. В работе показано, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, выделенные из зачатков третьих моляров человека (ММСК-ЗТМ), характеризуются высокой продукцией сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) при культивировании in vitro. В связи с тем, что VEGF является известным ангиогенным и нейропротекторным фактором, применение ММСК-ЗТМ перспективно для разработки методов клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний человека.

В последние годы проведены обширные исследования по анализу секретома различных клеточных типов. Термин «секретом» используется для характеристики общего пула белков, секретируемых клеткой, тканью или организмом в данный момент времени и при определенных условиях среды [1]. Также секретом отражает функциональное состояние клетки в заданных условиях среды. Более того, клетки могут активировать секрецию различных белков в зависимости от стимулов и сигналов, которые они получают извне [2]. К настоящему времени есть ряд работ, посвященных исследованию секретома различных клеточных типов, в том числе стволовых [3–5].

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) играют важную роль в самообновлении и регенерации тканей и органов, они способны к дифференцировке в различных направлениях [6, 7]. ММСК секретируют множество трофических и протекторных факторов, что является основанием для их внедрения в клиническую практику для лечения различных заболеваний человека.

Одним из перспективных источников ММСК являются зачатки и пульпа третьих моляров (зубов мудрости) человека [8, 9]. По своим морфологическим и фенотипическим свойствам клетки из указанных тканевых источников могут быть отнесены к ММСК, поскольку они обладают свойством клоногенности, способны пролиферировать как в условиях in vitro, так и in vivo, а также характеризуются способностью к мультилинейной дифференцировке, в том числе в остеобласты, цементобласты, хондробласты, адипоциты, мышечные и нервные клетки [7, 10–14]. Кроме того, клетки пульпы зуба секретируют нейротрофические факторы и способствуют выживанию чувствительных нейронов in vitro и двигательных нейронов in vivo [15]. Как полученные из любого другого нового источника, ММСК из зачатков третьих моляров (МСК-ЗТМ) требуют тщательного исследования как с точки зрения генетических и фенотипических особенностей, так и с точки зрения безопасности и эффективности для клеточной терапии.

По данным литературы, одним из наиболее перспективных для клинического применения факторов роста является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), обладающий ангиогенными, нейропротекторными, нейротрофическими свойствами [16–18]. Фактор поддерживает выживание нейронов, защищает нервную ткань от кислородного голодания при гипоксии, стимулирует пролиферацию нейробластов и рост аксонов, а также поддерживает выживание нейронов in vitro и in vivo [19]. Популяции клеток, в том числе стволовых, обладающие способностью секретировать высокий уровень VEGF, могут иметь преимущество в качестве клеточного материала в разработке методов лечения пациентов с нейродегенеративными и ишемическими заболеваниями.

Цель работы – определение эндогенного уровня экспрессии VEGF in vitro ММСК, выделенными из зачатков третьих моляров человека.

Материал и методы

Клеточные культуры. ММСК были выделены из зачатка третьего моляра человека, как описано ранее [9, 20]. По медицинским показаниям «зуб мудрости» удалялся хирургом-стоматологом у пациентов с предварительным получением письменного информированного согласия. В течение 30–40 мин после удаления зуб доставляли в лабораторию в физиологическом растворе с добавлением смеси антибиотиков – пенициллина и стрептомицина. В стерильных условиях ламинарного бокса Herasafe Termo (Германия) (второй уровень защиты) проводили механическое очищение твердых тканей зачатка зуба от фолликулярной капсулы. Обрабатывали зачаток зуба раствором Хэнкса (Gibco, США) с добавлением смеси антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). Осторожно удаляли неминерализованную межкорневую перегородку зуба с помощью стерильного пинцета. Аккуратно извлекали зачаток пульпы из полости зуба. Тщательно измельчали пульпу на мелкие кусочки (1–2 мм) с помощью хиругических скальпелей со сменными лезвиями. Культивирование выполняли на среде Игла, модифицированной по методу Дульбекко (Sigma, США), к которой были добавлены 10% сыворотки крови плодов коровы (Sigma, США), 2 мM L-глутамина (Sigma, США) и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma, США) при 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2 [21]. На 3 сут. проводили смену питательной среды. После 10–15 сут. инкубации было отмечено формирование «плотного» монослоя клеток. Замену питательной среды проводили через 1 сут. Пересев клеток проводили с применением раствора 1х трипсина-ЭДТА (Sigma, США).

Культура эмбриональных клеток почки человека HEK-293T была получена из ATCC (American Type Culture Collection, США) (ATCC номер: CRL-11268).

Иммунофенотипирование ММСК. Экспрессию поверхностных антигенов ММСК оценивали методом проточной цитометрии [22]. Клетки трипсинизировали и инкубировали в фосфатно-солевом буфере в течение 45 мин с первичными антителами к CD14, CD29, CD34, CD45, CD90, CD105, CD133, CD166 (SantaCruz Biotechnology, США) и CD73 (Zymed, США). После того, как клетки отмыли от несвязавшихся антител, все клетки инкубировали со вторичными антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, коньюгированными с FITC (Fluorescein Isothiocyanate, длина волны 488/520) при 4°С в течение 45 мин. CD29-специфичные антитела были РЕ-мечеными (Phycoerythrin, длина волны 488/578) и не требовали инкубации со вторичными антителами. Анализ клеток проводили на проточном цитометре Guava easyCyte 8HT (Millipore, США), согласно инструкциям производителя.

Иммуноферментный анализ экспрессии VEGF в культуре клеток. ММСК и клетки линии HEK-293T культивировали в 12-луночных планшетах. Сбор культуральной среды из лунок с клетками проводили через 1, 3 и 5 сут. Концентрацию VEGF в культуральной среде определяли с помощью набора VEGF-ИФА-БЕСТ А-8784 (Вектор, Россия) по методике, рекомендуемой производителем. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» варианте иммуноферментного анализа (ИФА) с применением моно- и поликлональных антител к VEGF человека. Для построения стандартной кривой использовали калибровочные образцы с известной концентрацией VEGF, входящие в состав набора. Стандартная кривая свидетельствует о чувствительности и линейности детекции измеряемых концентраций VEGF в диапазоне 10–2000 пг/мл. Оптическую плотность растворов измеряли на многофункциональном микропланшетного ридере Infinite M200Pro (Tecan, Швейцария) в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – 655 нм. Исходя из прямой пропорциональности между величиной оптической плотности и концентрацией VEGF в стандартных образцах, вычисляли концентрацию VEGF в исследуемых образцах.

В качестве контрольной клеточной линии с низким эндогенным уровнем экспрессии VEGF использовали иммортализированную линию первичных человеческих эмбриональных клеток почки HEK293T.

Результаты и обсуждение

Из зачатков третьих моляров человека были выделены клетки, по своим морфологическим и фенотипическим свойствам аналогичные ММСК, поскольку они обладали фибробласто-подобной морфологией, были способны к длительной пролиферации in vitro и обладали способностью к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном, остеогенном и нейрогенном направлениям (информация не показана). С помощью проточной цитофлуориметрии было подтверждено, что выделенные клетки экспрессируют поверхностные антигены CD29, CD73, CD90, CD105 и CD166, характерные для ММСК, но не маркёры гемопоэтических клеток CD14, CD34, CD45 и CD133 (рис. 1).

Также в ходе работы было установлено, что ММСК, выделенные из зачатков третьих моляров человека, обладают высокой эндогенной экспрессией гена vegf и активно секретируют белок VEGF в культуральную среду. Концентрация VEGF в культуральной среде на 1 день инкубации составила 367 пг/мл, на 3 день – 2247 пг/мл, на 5 день – 2675 пг/мл. Клетки НЕК-293Т обладали низким эндогенным уровнем экспрессии VEGF на 1, 3 и 5 день инкубации – 11, 58 и 78 пг/мл, соответственно (рис. 2).

Таким образом, показано, что клетки, выделенные из зачатков третьих моляров человека, соответствуют ММСК и способны секретировать высокие уровни VEGF при культивировании in vitro. Так как высокий уровень секреции эндогенного VEGF не требует никакой дополнительной генетической модификации или культивирования при специализированных условиях (например, в присутствии факторов роста или при гипоксии), применение ММСК перспективно для разработки методов клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний человека.

Подняться вверх сайта