Поиск Кабинет

Использование стромальных клеток костного мозга, мобилизованных на гранулах биоситалла, для пластики костей мозгового черепа

Гены & Клетки: Том II, №2, 2007 год, стр.: 62-67

 

Авторы

Деев Р.В., Цупкина Н.В., Николаенко Н.С., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В экспериментальном исследовании продемонстрирован один из подходов клеточных технологий для пластики костей мозгового черепа. Данные кости характеризуются низкой способностью к восстановлению. поэтому при их обширных повреждениях возникает необходимость использования различных пластических материалов.

Эксперимент выполнен на кроликах породы Шиншилла. Костный мозг для выделения фракции стромальных клеток получали по стандартной схеме. После наращивания необходимого количества клеток в культуре их мобилизовали на гранулах костнопластического стеклокерамического материала - «Биосит» диаметром 0,3-1.0 мм. Полученную конструкцию вносили в модельный дефект теменной кости диаметром 1,0 см. Результаты оценивали при помощи световой и электронной сканирующей микроскопии на сроках 60 и 120 суток. Установлено, что культура клеток адгезируется к поверхности гранул и, будучи перенесенной в область повреждения, в сочетании с костнопластическим материалом приводит к быстрому устранению костного дефекта.

Введение

Лечение дефектов костей черепа остается актуальной про блемой современной травматологии и нейрохирургии. Данные кости имеют низкие регенераторные свойства, следствием чего является снижение возможности гисто и органотипичес кого восстановления в случаях повреждений [1 3].

По современным данным, черепно мозговые травмы мирного времени составляют до 40% от всех травм, причем до 40% из них сопровождается формированием дефектов, нуждающихся в оперативном лечении [4]. По результатам анализа санитарных потерь во время Великой Отечествен ной войны и войны в Республике Афганистан (РА) ранения головы составляли соответственно 14,8% и 22,6% [5]. При чем, в РА 46,5% и 32,9% ранений черепа приходились на лобную и теменную области соответственно, то есть на от делы мозгового черепа [6]. В вооруженных конфликтах в Чеченской Республике количество раненых и пострадавших с повреждениями черепа колебалось от 68,9 до 76,2% среди всех раненых нейрохирургического профиля [7].

Имеющиеся в арсенале нейрохирургов методы пластики дефекта при помощи синтетических материалов (различные пластмассы) обладают рядом недостатков. Среди них еле дует отметить экзотермический эффект при полимериза ции, что приводит к дополнительному повреждению тканей раны; канцерогенное действие; относительную хрупкость, ведущую к повторным переломам (3). Альтернативой этому является аллопластика трупной костью, костной крошкой, костным регенератом, пластика фрагментом живой аутоко сти с дальнейшей его дистракцией (2, 3, 8, 9]. Вместе с тем, данная проблема далека от своего окончательного разреше ния. В последнее время дискутируется возможность кранио пластики с использованием культивированных остеогенных клеток (10 12].

В качестве носителей для остеогенных клеток предложе ны различные субстанции: альгинаты (13], гидроксиапатит, трикальцийфосфат и иные керамические материалы (14 16], деминерализованная костная ткань (17, 18]. Перепек тивным представляется использование в качестве носителя пористых имплантатов из стеклокристаллических материа лов, в том числе и биоситалла (19]. Получены положительные результаты по остеоинтегративным свойствам имплантатов из этого материала (20].

Материал и методы

В качестве источника стромальных клеток использовали красный костный мозг, заключенный в крыльях подвздош ных костей. Для получения материала животных (кроли ков) после премедикации (0,5 мл 2% раствора димедрола, 1,0 мл 50% раствора анальгина в/м) фиксировали к стан ку. Удаляли шерсть в проекции крыльев подвздошных кос тей. Операцию выполняли под местным обезболиванием 0,25% или 0,5% раствором новокаина. Резецировали кры лья подвздошных костей у подвздошно позвоночного угла так, что удаленный фрагмент кости имел площадь не менее 1 сма.

Манипуляция выполнялась с обеих сторон. Кусочки помеща лись в питательную среду DMEM (ISN, США) без сыворотки. Осуществляли гемостаз, рану послойно ушивали.

Из резецированных фрагментов костей тщательно выс кабливали костный мозг. Полученную гомогенную тканевую массу центрифугировали в течение 10 мин. при 10ОО обо ротах. Для диссоциации костномозговых клеток применяли трехкратную последовательную щадящую ферментативную обработку осадков смесью трипсин версен (Difco, США) при 37°С. Далее фермент нейтрализовали сывороткой. Клеточ ную взвесь фильтровали через капроновый фильтр.

Клетки высевали в одноразовую пластиковую посуду (чашки Петри) из расчета 5 7x105 клеток на 1 сма площади дна. Среда имела следующий состав: DMEM (ISN, США) и F12 (ISN, США) в соотношении по объему 3:1 с добавле нием 20% эмбриональной сыворотки коров (ISN, США), гентамицина сульфата (50 мкг/мл). Культивирование про исходило в С02 инкубаторе при концентрации углекислого газа 5% при 37°С. Смену среды производили каждые 3 сут. Первый пересев осуществляли по достижении монослоя. После первого пассажа с целью индукции направленной ос теогенной дифференцировки в среду добавляли L аскорбат (0,2 мМ), р Na глицерофосфат (10 мМ) и дексаметазон в количестве 10s М.

Г ранулы биоситалла размером 0,3 1,0 мм, представляю щие собой фракцию препарата «Биосит», многократно про мывали средой без сыворотки, стерилизовали автоклавиро ванием и до использования хранили в среде без сыворотки.

Культивирование клеток на гранулах осуществляли в 24 х луночных платах. На дно укладывали гранулы так, что бы оно было покрыто ими в слой. В каждую лунку вносили 106 клеток культуры. Первую смену среды осуществляли через 3 сут. Общий срок культивирования на гранулах со ставлял 10 сут.

Кроликам, от которых был получен костный мозг, в даль нейшем выполняли дефект теменной кости. С соблюдением правил гуманного обращения с животными, послойно рас секали кожу, подкожную клетчатку, апоневротический шлем. Нагнетанием раствора анестетика и распатером отслаива ли и отодвигали надкостницу. При помощи корончатой фрезы латеральнее сагиттального шва формировали фрезевое от верстие диаметром 1,0 см так, чтобы не повреждать твердую мозговую оболочку. Выполняли гемостаз. В образовавшийся дефект помещали гранулы костнопластического материала с мобилизованными на его поверхности клетками. Над ма териалом тщательно ушивали апоневротический шлем. Кожную рану ушивали наглухо. Через 60 и 120 сут. после операции материал, вклю чавший фрагменты костей, твердую мозговую оболочку, апоневротический шлем, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, а кусочки, предназначенные для изготовления препаратов для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), в 2,5% растворе глугарового альдегида.

После промывки от фиксатора в течение 8 12 ч в про точной воде материал декальцинировали в перенасыщенном растворе трилона Б в термостате при 37°С. Достаточная деминерализация кусочка проходила за 20 30 сут. Далее изготавливали препараты для световой микроскопии по об щепринятой схеме. Окрашивали гематоксилином по Майеру и эозином, а также по Маллори.

После фиксации кусочки для СЭМ подвергали комбини рованной деорганификации. Сначала их инкубировали в 2,5% растворе трипсина при 37°С в течение 12 ч, затем в 5% растворе гипохлорида натрия - 30 мин. В дальнейшем препараты обезвоживали в ряду спиртов возрастающей концентрации, напыляли золотом и изучали в растровом электронном микроскопе JEOL JSM - 35С при ускоряющем напряжении 15 kV. Также при помощи СЭМ контролирова ли адгезию клеток к гранулам до пересадки.

Результаты

Установлено, что культура стромальных клеток костного мозга кроликов после индукции направленной остеогенной дифференцировки обладает способностью адгезироваться к поверхности гранул из биоситалла. При длительном куль тивировании они попадают и на дно культурального сосуда, где сохраняют свою обычную отростчатую и веретеновид ную форму (рис. 1 А). При перенесении таких гранул в колла геновый гель и дальнейшем культивировании, они диффузно прорастают в гель, занимая все больший объем, и посте пенно теряют связь с фрагментом биоситалла (рис. 1В). Следовательно, биоситалл не обладает выраженным угне тающим действием на культуру клеток. В его присутствии клетки сохраняют способность к пролиферации.

В зависимости от рельефа поверхности гранулы клетки приобретали различную форму. На гладких, пологих поверх ностях клетки распластывались, сохраняя при этом отроет чатую форму (рис. 2). На неровных поверхностях материала клетки располагались рядами, покрывая его монослоем, при этом их отростки фиксируются на дополнительных точках, находящихся в иных плоскостях (рис. 3). В течение 10 сут. клетки покрывали монослоем практически все поверхности гранул.

В области костной раны гистологическая картина через 60 сут. свидетельствовала о частичном зарастании дефекта костной тканью, при этом его размер уменьшился приблизи тельно на 2/3. Морфология регенерата была различной в краевых и центральных участках дефекта. Так, в области краев дефекта наблюдался активный процесс остеогенеза вокруг гранул биоситалла. Следует, однако, отметить, что ни в одном случае не удалось наблюдать плотного контакта ново образованной кости с гранулами. Напротив, между ними всегда сохранялась прослойка волокнистой соединитель ной ткани, иногда с собственными кровеносными сосудами (рис. 4А). Однако архитектоника трабекул свидетельствова ла о том, что они образуются вокруг беспорядочно лежащих гранул (рис. 4В). Часть гранул оказались заключенными во вновь сформированную костную ткань. Со стороны краев на блюдался активный центростремительный рост костной тка ни даже в тех участках, которые были лишены биоситалла.

Часто гранулы, находящиеся ближе к краю дефекта, были окружены богатой клеточными элементами тканью, которую в патогистологической литературе принято называть «осте огенной» (рис. 5А). В центральных участках дефекта гранулы были окружены в основном соединительной тканью с мощ но развитым волокнистым компонентом. Часть коллагено вых фибрилл была плотно упакована и демонстрировала слабые признаки минерализации, что выявлялось при окрас ке по Маллори (рис. 5В).

По данным СЭМ к 60 сут. костная ткань занимала не ме нее 2/3 дефекта. Ее граница с исходной костью прослежива лась четко (рис. 6А). Новообразованная ретикулофиброзная костная ткань имела неровную поверхность и большое коли чество отверстий, каналов и полостей, в которых залегали гранулы биоситалла, обнаженные в результате деорганифи кации (рис. БЕЗ, С).

Через 120 сут. после пересадки клеток на гранулах био ситалла целостность теменной кости была восстановлена полностью. Бывшая область дефекта заполнена ретикуло фиброзной костной тканью, формирующей костные трабе кулы, расположенные между гранулами материала. Следует отметить, что со стороны твердой мозговой оболочки и надкостницы уже была сформирована кость пластинчатого строения. Общие костные пластинки составляли наружную и внутреннюю поверхности бывшего регенерата (рис. 7А). В самой кости происходили процессы ремоделирования -перестройки ретикулофиброзной костной ткани в пластин чатую.

Немаловажным является тот факт, что пространство между костью и биоситаллом стало значительно уже. Вместе с тем, признаков резорбции биоситалла или непосредствен ного замещения его костной тканью выявить не удалось. Г ранулы были окружены минерализованными пластинками соединительной ткани, которую можно интерпретировать как костную (рис. 7В).

Обсуждение

Использованный в работе в качестве носителя для кле ток стеклокристаллический материал - биоситалл может выполнять функцию доставки клеток в область дефицита костной ткани, то есть использоваться в качестве скаффол да (scaffold). Ранее показано, что биоситалл может служить источником необходимых элементов для минерализации волокнистого матрикса при остеогенезе, что доказано ме тодами электроннозондового микроанализа у пациентов с имплантированными биоситалловыми блоками (20]. Нема ловажно, что биоситалл не только не подавляет пролифера цию и дифференцировку находящихся на нем клеток, но и способствует этим процессам. Установлено, что при куль тивировании остеогенных клеток на биоситалле почти в два раза увеличивается удельная активность щелочной фосфа тазы, что свидетельствует об их прогрессивной остеоген ной дифференцировке (21, 22].

При трансплантации культивированных стромальных кле ток на носителе в рану возникают обоснованные сомнения относительно сохранения ими жизнеспособности в области активного воспаления и действия различных цитокинов. В некоторых работах показано, что данные клетки сохраняют жизнеспособность и прямо или опосредованно участвуют в процессах остеогенеза (23, 24].

Значимость использования данной методики для опта мизации процессов остеорепарации или пластики костей следует оценивать в сравнении с теми же процессами, про исходящими естественным образом.

О сниженном регенераторном потенциале покровных костей черепа известно давно. Так, по данным различных авторов восстановление дефекта теменной кости у кролика либо не происходит вообще, либо происходит частично (2, 25]. Результаты наших экспериментов показывают, что этот процесс может быть существенно ускорен. При ис пользовании биоситалла в качестве носителя клеток дан ный процесс по срокам наступления полного восстановле ния целостности кости происходит быстрее, чем при использовании взвеси клеток или клеток в коллагеновом носителе. Так, по нашим данным, при трансплантации взвеси стромальных клеток в аналогичный дефект формирование полноценного костного регенерата наблюдается лишь на 120 сут., а в коллагеновом геле - на 90 (23], в то время как по результатам настоящего эксперимента восстановление целостности костной ткани произошло в период от 60 до 120 сут. При этом следует предположить, что сформирован ный в результате трансплантации клеток в культуральной среде или коллагене регенерат отличается по прочности от регенерата с гранулами биоситалла, поскольку в этом слу чае в структуру костной ткани инкрустированы гранулы биоситалла, достаточно плотно охваченные костными тра бекулами. Необходимо также отметить и более полное вое становление анатомических контуров теменной кости.

Не следует забывать тот факт, что, несмотря на снижен ный регенераторный потенциал, плоские кости черепа ос таются весьма подверженными к индукции остеогенеза (23]. Реализация индукционного воздействия выражается в изменении временного соотношения фаз посттравмати ческой регенерации: первичной реакции на повреждение, репаративного остеогистогенеза и адаптивной пере стройки (26, 27]. В плоских костях черепа репаративный процесс отличается тем, что фаза адаптивной перестрой ки протекает атипично. Результаты морфометрических ис следований свидетельствуют, что именно на 60 120 сут. в регенерате наблюдается снижение доли костной ткани (28]. Такие манипуляции, как пересадка клеток, в том числе и на биоситалловых носителях, являются тем индуктором, ко торые пролонгируют фазу собственно репаративного ос теогистогенеза и способствуют нормальному протеканию фазы адаптивной перестройки. Об этом свидетельствуют и полученные нами данные признаки перестройки ретикуло фиброзной костной ткани регенерата в пластинчатую, пол ностью восстановившего целостность кости через 120 сут. после формирования дефекта и пересадки клеток на гра нулах биоситалла.

Является ли длительное сохранение биоситалла в кост ной ране препятствием или, наоборот, положительным мо ментом при замещении дефектов различной локализации, покажут будущие исследования. Однако уже сейчас ясно, что данный материал, как в чистом виде, так и в сочетании с культурой клеток в форме гранул пригоден лишь при строго определенных показаниях, например, при лечении костных кист и полостей различного происхождения. Искусственное расширение показаний, в том числе и при использовании клеточных технологий, преждевременно, что не исключает возможности рассматривать технологии совмещения мате риала носителя, в том числе биоситалла, и клеток в каче стве элемента, улучшающего остеоинтеграцию различных имплантатов.

Безусловно, дефекты костей иной локализации могут потребовать использования не гранулированного матери ала, а создания трехмерных конструкций, по характеру и степени открытости пор имитирующих нативную кость. Результаты проведенного исследования могут стать пред посылкой и обоснованием дальнейшего поиска эффектив ных стратегий костной пластики, основанных на клеточных технологиях.

Подняться вверх сайта